Summary
En grunnleggende søken i cellebiologi er å definere hvilke mekanismer som ligger til grunn for identiteten til de organeller som gjør eukaryote celler. Her foreslår vi en metode for å identifisere gener som er ansvarlige for den morfologiske og funksjonelle integritet av plante organeller med fluorescens mikroskopi og neste generasjons sekvensering verktøy.
Abstract
Denne protokollen beskriver en fluorescens mikroskop-basert screening av Arabidopsis frøplanter og beskriver hvordan du tilordner recessive mutasjoner som endrer subcellulære fordelingen av et bestemt merket fluoriserende fargestoff i den sekretoriske vei. Arabidopsis er en kraftig biologisk modell for genetiske studier på grunn av dens genom størrelse, generasjonstid, og bevaring av molekylære mekanismer blant kongeriker. Matrisen genotyping som en tilnærming til å kartlegge mutasjon i alternativ til den tradisjonelle metoden basert på molekylære markører er en fordel fordi det er relativt raskere og kan tillate kartlegging av flere mutanter i en veldig kort tidsramme. Denne metoden gjør at identifisering av proteiner som kan påvirke integriteten til noen organeller i planter. Her, som et eksempel, foreslår vi en skjerm å kartlegge gener som er viktige for integriteten til den endoplasmatiske retikulum (ER). Vår tilnærming, derimot, kan lett utvides til andre anlegg celleorganeller(For eksempel se 1,2), og dermed representerer et viktig skritt mot å forstå den molekylære basisen for annen subcellulære strukturer.
Protocol
1. EMS behandling
Arabidopsis thaliana frø mutagenized bruker som mutagen agenten etyl metan sulfonat (EMS) 3,4, som induserer inn i genomet C-til-T-endringer som resulterer i C / G til T / A mutasjoner 5-7.
- Vei 0,8 g Arabidopsis frø (~~~HEAD=NNS 40.000 frø) frakter organeller fluoriserende fargestoff (spesielt i denne studien ssGFPHDEL (signal sekvens-GFP-HDEL Tetrapeptid) har blitt brukt som en ER markør).
- Overfør frøene i en 50-ml Falcon rør, legg deretter til 25 ml destillert vann.
- Legg 0,2% (v / v) etyl metan sulfonate.
- Inkuber i 16 timer på nutating mikser på lav hastighet.
- Aspirer væsken og kast den inn i en kolbe med 1,0 M NaOH til inaktivere EMS.
- Tilsett 25 ml vann til Falcon rør som inneholder frøene, tett, og invertsukker 5 ganger for å vaske frøene, vente til alle frøene har avgjort, og deretter aspirer vannet og kast inn i 1,0 M Na OH kolbe.
- Gjenta vasketrinn opptil 10 ganger.
- Etter den siste vask, re-suspendere frøene i en minimal mengde vann.
- Fortsett til frø sterilisering legge 25 ml 10% blekemiddel, rist kraftig i 30 sek. La frø bosette til bunnen, og hell av blekemiddel og skyll med 25 ml sterilt vann. Hell av sterilt vann og tilsett 25 ml 70% etanol. Rist rør for 30 s. La frø bosette til bunnen. Hell av etanol og skyll med 25 ml sterilt vann. Gjenta to ganger på vask med sterilt vann, og hell frø på en plast petriskål inneholder 3 MM filter papir og la tørke under panseret. Oppbevares ved 4 ° C i 2 dager.
- Plate frøene på ½ MS phytagel (halvparten konsentrasjon av Murashige og Skoog medium), 150-mm petriskål (~~~HEAD=NNS 250-300 frø for plate).
- Grow M1 frø på tallerkenen i 2 uker, deretter transplantere inn jord.
- Samle M2 frø fra enkelte M1 planter å generere M2 linjer (1000 uavhengige linjer).
I dette avsnittet beskriver vi observasjon av frøplanter med en confocal eller fluorescens mikroskop som beskrevet tidligere åtte.
- Seksti frø fra hver M2 linje er dyrket i 7 til 10 dager på plast petriskåler, ½ MS phytagel, på samme plate er også vokst 5 frøplanter EMS-ubehandlet (kontroll).
- Fem til ti cotyledons er montert med abaxial side mot linsen (40X) på et objektglass og vedlagt en dekkglass.
- Hver cotyledon er observert, fra kortikale til den mediale regionen, under fluorescens for noen endrede subcellulære fordeling av organeller markør.
- Positive planter blir transplantert inn i jord og deres frø er samlet og vist igjen for å bekrefte muterte fenotypen i M3 generasjon.
- Fjern forurensende bakgrunnen mutasjoner gjennom tilbakekryssing minst tre ganger til en villtype genom muligens containing ønsket organeller fluoriserende fargestoff.
- Fra moren anlegget, bruker fine saks eller tang fjerne modne siliques, og åpne blomster.
- Fjern knopper som er for små fra meristem.
- Sett spissen av en pinsett mellom kronblader og begerblad å åpne en blomst knopp og fjerne alle pollenknapper.
- Bruk en pinsett ta en åpen moden blomst fra faren anlegg og gni de pollenknapper på stigma av emasculated anlegget.
3. Kartlegging
Denne delen beskriver i hovedsak hvordan å kartlegge en recessiv mutasjon ved hjelp av en modifisert protokoll fra Borevitz 9 som er raskere hvis forhold til tradisjonelle kartleggingsmetoder 10,11. Denne tilnærmingen bruker høy tetthet oligonukleotid arrays med evnen til å oppdage en rekke enkelt funksjon polymorfismer (slike ernæringsprosjekter) i en enkelt analyse 12. Bruke Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip matrise er mulig åanalysere omtrent 24 000 gener. En pool av F 2 personer som viser mutasjon er sammenlignet med en pool av vill type F 2 planter som samles innenfor samme segregering befolkningen. Deretter vil mutasjonen bli kartlagt i området der det muterte bassenget er beriket for mutant genotype alleler og dermed i samme region villtype bassenget vil medføre beriket for villtype foreldre alleler 13.
- Genomisk DNA (3 mikrogram) er hentet fra homozygot mutant Columbia (M3) med en Qiagen DNeasy Plant Mini Kit og er presentert for Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 sekvensering.
- Den homozygot mutant Columbia (M3) er krysset med Landsberg erecta å generere en kartlegging befolkning.
- Kartleggingen er utført på 70 til 100 F2 individer som viser avvikende fenotypen og samme antall F2 planter med en vill-type fenotype.
- Samle fra hver plante et blad plate (0,60 mm) med et hull punch. Detblad plate skal hentes fra bladene på samme alder å være sikker på å ha lignende mengder DNA. Prøvene kan behandles for genomisk utvinning separat eller i grupper. I dette tilfellet er det mulig å samle 5-10 prøver for hver Eppendorf rør, slik at til slutt vil du ha færre Eppendorf rør som genomisk DNA har å trekkes ut.
- MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kit (Epicentre) brukes til å pakke ut genomisk DNA. Den genomisk DNA hentet fra hver prøve er kvantifisert med en nanodrop.
- Det samme mengde av genomisk DNA fra hver prøve settes deretter sammen opp til totalt 300 ng (~ 30 mL) av plante DNAS, legg 60 mL 2.5x tilfeldig primere løsning [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mm MgCl2, 25 mm 2-mercaptoethanol, 750 mikrogram / ml oligodeoxyribonucleotide primere (tilfeldige octamers)] (Bioprime kit) og 42 mL vann (endelig volum 132 mL).
- Denature DNAS ved> 95 ° C i 5 til 10 min.
- Cool på is.
- Til hver denaturød DNA tilsettes 15 mL 10X dNTPs blanding med Biotin dCTP [1 mM biotin-14-dCTP, 1 mm dCTP, 2 mm dATP, 2 mm dGTP, 2 mm dTTP i 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mm Na2EDTA] (Bioprime kit), og komplett med 3 mL Klenow polymerase (Bioprime kit).
- Inkuber over natten ved 25 ° C.
- Dagen etter, legger 15 mL 3 M NaOAc og 400 mL kald 100% EtOH; mix.
- Inkuber ved -80 ° C i 1 time, deretter spinne på 20 500 xg i 15 min, fjern supernatanten, og vask med 500 mL kald 75% EtOH.
- Snurr på 20 500 xg i 10 min.
- Tørre DNA pellets ved 37 ° C i 10 min og resuspender i 100 mL vann.
- Bruk 5 mL å sjekke avling og kvalitet på en gel (Figur 2).
- Send 95 mL av merking reaksjon for vill-type og mutert for GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array Hybridisering.
- De rekker blir skannet og. Cel-filene innhentet er analysert ved hjelp av R-programvare ( http://www.r-project.oRG /).
- Installer R programvare, og deretter åpne programmet og lim inn følgende streng:
kilde (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
Deretter trykker retur-tasten, dette vil installere standard Bioconductor pakkene ( http://www.bioconductor.org ). - I en ny mappe på skrivebordet ditt, laste ned fra følgende nettsted ( http://www.naturalvariation.org/methods ) filene:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
Filen ColLerCEL.zip skal pakkes ut og de resulterende filene limes inn i den nye mappen. - Endre navn på data innhentet fra GeneChip eksperimentet inn wildtype.CEL og mutant.CEL.
- Kopier nå dine GeneChip data (wildtype.CEL ogmutant.CEL) inn i mappen din.
- Åpen R, a) for Mac: Klikk "Diverse" og deretter klikk på "Endre arbeidskatalog." b) for PC: Klikk på "File" og deretter "Endre katalog"
- a) for Mac: Velg mappen som inneholder filene. Klikk på "arbeidsområde", "Load arbeidsområde fil" og velg ath1V5.RData, b) for PC: Velg mappen som inneholder filene ovenfor, klikk på "File", deretter "Load arbeidsområde" og velg ath1V5.RData.
- Åpen readCEL.R bruke Notepad og kopiere hele teksten til R.
- Åpen SFP.R bruke Notepad og kopiere hele teksten til R.
- Åpen Map.R bruke Notepad og kopiere hele teksten til R.
- I Console-vinduet vil du se følgende melding:
Kromosom x begrenser Mb YZ
Søk gener på Tair lim i linken
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& End = z - Kopier og lim inn koblingen i nettleseren. Et vindu vises og spør om å åpne eller lagre filen, bør du velge lagre. Velg et filnavn og fest utvidelsen ". XLS," klikk deretter Lagre.
- Åpne filen ". XLS" hvor du kan finne koordinaten for din mutant (resultatet er grafisk representert i figur 3).
- Innenfor det kartlagte området i den sammensatte Illumina leser av mutant genomet identifisere spesifikke EMS overganger fire blant de single nukleotid polymorfismer. Utfylle mutant fenotype ved transformasjon med villtype gen (r) ved hjelp av standard prosedyrer 15.
4. Representative Resultater
Figur 1 viser tilnærmingen som brukes for identifisering av en mutant av den sekretoriske vei med konfokalmikroskopi screening. Figur 2 viser en typisk forberedelse av merket genomisk DNA for array hybridisering. I tre figur, et typisk resultat forventes etter å analysere data innhentet fra GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array presenteres.
Figur 1. Arabidopsis transgene planter som uttrykker ssGFPHDEL (ER markør) (1) ble dyrket for å produsere nok frø for EMS behandling (2). Frø som ble behandlet med EMS ble deretter sådd til å generere M1 planter (3). Hver M1 plante representerer en annen linje og frø ble samlet atskilt fra hver av dem. M2 frø ble belagt på ½ MS substrat (4) og deretter undersøkes for feil ER morfologi ved konfokalmikroskopi (5). Under screening fant vi planter som konservert villtype ER morfologi (6) og planter som viser defekte ER fenotyper (7). Disse plantene ble dyrket for å få M3 generasjon og for å bekrefte fenotypen (8). Genomisk DNA fra M3 anlegg ble brukt for Solexa Illumina sekvensering (a). Det samme anleggetble også brukt for krysninger med Ler-WT å få F2 kartlegging befolkningen (b).
Figur 2. Bioprime tilfeldige merking reaksjoner (5 mL av 100 mL) ble lastet på agarose gel 1%. Lane en er fra en pool av vill type F2 planter, og kjørefelt b er fra en pool av muterte F2 planter. (Marker er en Kb DNA stigen-N3232, fra NEB).
Figur 3. Figuren representerer et eksempel på kartlegging av Kol-0 mutasjon hjelp GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array Hybridisering. Mutasjonen i dette eksemplet ligger på kromosom 1, avgrenset av loddrette stolper. De horisontale linjene representerer grensene for deteksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en konfokalmikroskopi-basert screening for identifisering av endomembransystemet mutanter. Denne tilnærmingen kan lett utvides til andre organeller i cellen for hvilke spesifikke fluorescerende protein markører er tilgjengelig. Skjermen er basert på identifisering av mutanter som viser en avvikende fordeling av fluoriserende fargestoff enten i mål organeller eller organeller som ikke ment å inneholde markør. Henholdsvis disse mutantene representerer bestander som enten evne organeller til subcompartimentalize markøren er kompromittert eller mutanter som ikke kan ordentlig translocate markør blant organeller. Under screening la vi merke til at noen mutanter viste en fenotype i tidlige utviklingsfasene så tidlig som 7 dager etter spiring, men andre viste fenotypen bare i et senere stadium av utviklingen. Selv om dette kan være knyttet til en rekke årsaker, herunder utvikling avhengig uttrykk for den muterteallelet (s), tyder dette på at plantene bør undersøkes ved ulike vekst stadier (minst 7 til 14 dager) for å garantere at potensielt interessante mutanter ikke forkastes.
Tilnærmingen som beskrives i denne protokollen tillater oss å kartlegge et gen i en relativt kort tid i forhold til den klassiske kartlegging metoden. Faktisk, samle et tilstrekkelig antall individer av F2 befolkningen brukes for GeneChip Array krever en relativt liten mengde tid i forhold til F2 planter som kreves for den klassiske fine mapping prosedyre. Det er imidlertid kritiske trinnene som skal følges. Valg av F2 befolkning prøver viser eller ikke viser fenotypen bør gjennomføres nøye, siden tillegg av selv et lite antall planter med feil fenotypen ved en feiltagelse kan introdusere feil i den endelige resultatet. Dette er hovedsakelig knyttet til det faktum at F2 befolkningen brukes til grov kartlegging er svært liten. Av denne grunn, valg av planter som eithenne vise eller ikke vise fenotypen skal gjennomføres hver gang på samme dag etter spiring. Dette er fordi, som vi nevnte ovenfor, kan utseendet på fenotype være knyttet til vekst. Et annet viktig punkt å vurdere, er å se nøye på den neste generasjonen data postalignment, som er generert av programmer som gir oss viktig informasjon som prosentandelen av leser inneholder varianten. Den teoretiske verdien forventet for en heterozygot variant er rundt 50%, betyr dette at 50% av de sekvensene vil inneholde variant mens for en homozygot variant, er circa 100%. Dessverre situasjonen etter en postalignment kan være langt fra den teoretiske verdien, faktisk andelen leser inneholder variant for heterozygot kan variere fra 20 til 80%, mens 60-100% for homozygot 16. Derfor, for ikke å gå glipp av de viktigste single nukleotid polymorfismer (SNP), er det viktig å ikke kaste mutanter med mindre enn 100% prosent av reannonser for varianten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner støtte av Chemical Sciences, Geofag og biovitenskap Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (pris nummer DE-FG02-91ER20021) og National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Vi er takknemlige for Ms Karen Bird for redigering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
