Summary
En grundläggande strävan i cellbiologi är att definiera de mekanismer som ligger bakom identiteten av organeller som gör eukaryota celler. Här föreslår vi en metod för att identifiera de gener som är ansvariga för den morfologiska och funktionella integritet växt organeller med fluorescensmikroskopi och nästa generation verktyg sekvensering.
Abstract
Detta protokoll beskriver en fluorescens-mikroskop-baserad screening av Arabidopsis plantor och beskriver hur man mappa recessiva mutationer som förändrar den subcellulära fördelningen av en märkt specifik fluorescerande markör i den sekretoriska vägen. Arabidopsis är en kraftfull biologisk modell för genetiska studier på grund av dess genom storlek, generationstid, och bevarande av molekylära mekanismer bland riken. Arrayen genotypning som en metod att kartlägga mutationen i alternativ till den traditionella metod som bygger på molekylära markörer är fördelaktigt eftersom det är relativt snabbare och kan tillåta kartläggning av flera mutanter i en riktigt kort tid. Denna metod gör det möjligt att identifiera proteiner som kan påverka integriteten hos all organell i växter. Här, som ett exempel, föreslår vi en skärm för att kartlägga gener som är viktiga för integriteten hos det endoplasmatiska retiklet (ER). Vårt tillvägagångssätt, kan dock lätt utvidgas till andra organeller växt cell(Se till exempel 1,2), och utgör därmed ett viktigt steg mot att förstå den molekylära grunden för övriga subcellulära strukturer.
Protocol
1. EMS Behandling
Arabidopsis thaliana frön mutageniseras med användning som mutagent medel etylmetansulfonat (EMS) 3,4, vilket inducerar i genomet C-till T-förändringar som resulterar i C / G till T / A mutationer 5-7.
- Väg 0,8 g Arabidopsis frön (cirka 40.000 frön) som bär organellen fluorescerande markör (bestämt i denna studie ssGFPHDEL (signalsekvens-GFP-HDEL tetrapeptid) har använts som en ER-markör).
- Överföra fröna i en 50-ml Falcon-rör och tillsätt sedan 25 ml destillerat vatten.
- Tillsätt 0,2% (volym / volym) etyl-metansulfonat.
- Inkubera i 16 timmar på nuterande mixer på låg hastighet.
- Suga ut det flytande och kassera den i en kolv innehållande 1,0 M NaOH för att inaktivera EMS.
- Tillsätt 25 ml vatten till Falcon rör som innehåller frön, nära och invertsocker 5 gånger för att tvätta fröna, vänta tills alla frön har avgjorts, så aspirera vattnet och kasta in i 1,0 M Na OH kolv.
- Upprepa tvättningssteget upp till 10 gånger.
- Efter den slutliga tvätten, återsuspendera fröna i en minimal mängd vatten.
- Fortsätt till utsäde sterilisering tillsätta 25 ml av 10% blekmedel, skaka kraftigt i 30 sekunder. Låt frön sedimenterar till botten, häll sedan av blekmedel och skölj med 25 ml sterilt vatten. Häll av sterilt vatten och tillsätt 25 ml 70% etanol. Skaka rören under 30 s. Låt frön sedimenterar till botten. Häll av etanol och sköljdes med 25 ml sterilt vatten. Upprepa två gånger tvätt med sterilt vatten, häll sedan frön på ett plast petriskål innehållande 3 mM filterpapper och låt torka under huven. Lagra vid 4 ° C under 2 dagar.
- Plate fröna på ½ MS Phytagel (halv koncentration av Murashige och Skoog medium), 150-mm petriskål (ca 250-300 frön för platta).
- Odla M1 frön på platta för 2 veckor sedan transplantera i marken.
- Samla M2 frön från enskilda M1 växter för att skapa M2 linjer (1000 fristående linjer).
I detta avsnitt beskriver vi observationen av plantor med en konfokal eller fluorescens mikroskop som beskrivits tidigare 8.
- Sextio frön från varje M2 linje odlas för 7 till 10 dagar på plast Petriskålar ½ MS Phytagel, på samma platta odlas också 5 plantor EMS-obehandlade (kontroll).
- Fem till tio kotyledoner är monterade med abaxiala sidan mot linsen (40X) på ett objektglas och innesluten med ett täckglas.
- Varje kotyledon observeras från kortikala till den mediala området, under fluorescens för varje förändrad subcellulär distribution av organell markören.
- Positiva växter transplanteras in i marken och deras frön samlas och siktas igen för att bekräfta mutantfenotypen i M3 generation.
- Ta bort kontaminerande bakgrunden mutationerna genom återkorsning minst tre gånger för att en vild typ genomet eventuellt samarbetantaining den önskade organellen fluorescerande markör.
- Från moderplantan, med fina sax eller pincett bort mogna siliques, och öppna blommor.
- Ta bort knoppar som är för små från meristem.
- För in spetsen på en pincett mellan kronblad och foderblad att öppna en blomknopp och ta bort alla ståndarknappar.
- Med en pincett tar en öppen mogen blomma från fadern anläggningen och gnugga ståndarknappar på stigma av kastrerad anläggningen.
3. Mappning
I det här avsnittet beskrivs i huvudsak hur man mappa en recessiv mutation hjälp av en modifierad protokoll från Borevitz 9 som är snabbare om man jämför med traditionella kartläggning 10,11. Detta tillvägagångssätt använder hög densitet oligonukleotidmatriser med förmågan att detektera ett flertal enda kännetecken polymorfismer (SFP) i en enda analys 12. Använda Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip array är det möjligt attanalysera ca 24 tusen gener. En pool av F 2 personer som visar mutationen jämfört med en pool av vild typ F 2 plantor som samlats inom samma segregerande population. Då kommer mutationen mappas i det område där det mutanta poolen är anrikad för mutant genotyp alleler och följaktligen i samma region av vild typ poolen kommer att resultera anrikad på de vild-typ föräldrar alleler 13.
- Genomiskt DNA (3 g) utvinns ur homozygot mutant Columbia (M3) med en Qiagen DNeasy växt Mini Kit och lämnas in för Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 sekvensering.
- Den homozygot mutant Columbia (M3) korsas med Landsberg erecta att generera en kartläggning befolkning.
- Mappningen utförs på 70 upp till 100 F2-individer som uppvisar den avvikande fenotyp och samma antal F2-plantor med en vildtyp fenotyp.
- Samlar in från varje växt ett löv skiva (0,60 mm) med en hålslag. Denbladskiva bör samlas in från blad i samma ålder för att vara säker på att ha liknande mängder DNA. Proverna kan behandlas för genomisk utvinning separat eller i grupp. I detta fall är det möjligt att samla 5-10 prover för varje Eppendorfrör så att i slutändan kommer du att ha färre eppendorfrör som DNA måste extraheras.
- MasterPure växters blad-DNA Purification Kit (Epicentre) används för att extrahera genomiskt DNA. Det genomiska DNA: t som erhållits från varje prov kvantifierades med en NanoDrop.
- Samma mängd DNA från varje prov sätts sedan samman till ett sammanlagt 300 ng (~ 30 il) av växt-DNA, tillsätt 60 pl 2,5 X slumpprimers lösning [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-merkaptoetanol, 750 pg / ml primrar oligodeoxiribo (slumpmässiga oktamerer)] (Bioprime kit) och 42 pl vatten (slutlig volym 132 pl).
- Denaturera DNA vid> 95 ° C under 5 till 10 minuter.
- Cool på is.
- Till varje denaturöd-DNA lägga 15 pl 10X dNTP blandning med Biotin dCTP [1 mM biotin-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP i 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime kit), och avsluta med 3 il Klenow polymeras (Bioprime kit).
- Inkubera över natten vid 25 ° C.
- Följande dag, tillsätt 15 | il 3 M NaOAc och 400 | il kall 100% EtOH, blanda.
- Inkubera vid -80 ° C under 1 timme och därefter centrifugera vid 20.500 xg under 15 minuter, avlägsna supernatanten och tvätta med 500 | il kall 75% EtOH.
- Snurra vid 20.500 xg under 10 min.
- Torra DNA-pelletar vid 37 ° C under 10 min och återsuspendera i 100 ni vatten.
- Använda 5 | il för att kontrollera utbytet och kvaliteten på en gel (Figur 2).
- Sända 95 | il av märkning reaktion för vildtyp och mutant för GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array Hybridisering.
- Uppsättningarna skannas och. CEL erhållna filer analyseras med R mjukvara ( http://www.r-project.oRG /).
- Installera R mjukvara, öppna programmet och klistra in följande sträng:
källa (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
Tryck sedan på Retur-Det här kommer att installera de vanliga bioledare paket ( http://www.bioconductor.org ). - I en ny mapp på skrivbordet, ladda ner från följande webbplats ( http://www.naturalvariation.org/methods ) filerna:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
Filen ColLerCEL.zip ska packas upp och de resulterande filerna klistras in i din nya mapp. - Byt namn på de data som erhållits från GeneChip experiment i wildtype.CEL och mutant.CEL.
- Kopiera nu dina GeneChip data (wildtype.CEL ochmutant.CEL) i din mapp.
- Öppen R, a) för Mac: Klicka på "Diverse" och klicka sedan på "Ändra arbetskatalog." b) För PC: Klicka på "File" och sedan "Ändra katalog"
- a) för Mac: Välj den mapp som innehåller filerna. Klicka på "Arbetsyta", "Load arbetsplats File" och välj ath1V5.RData, b) för PC: Välj den mapp som innehåller filerna ovan, klicka på "Arkiv" och sedan "Ladda arbetsyta" och välj ath1V5.RData.
- Öppen readCEL.R använda Anteckningar och kopiera hela texten till R.
- Öppen SFP.R använda Anteckningar och kopiera hela texten till R.
- Öppen Map.R använda Anteckningar och kopiera hela texten till R.
- I Console-fönstret ser du följande meddelande:
Kromosom x begränsar Mb yz
Sök gener på TAir klistra in den här länken
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& Slutet = z - Kopiera och klistra in länken i din webbläsare. Ett fönster visas och be för att öppna eller spara filen, du bör välja spara. Välj ett filnamn och bifoga filändelsen ". Xls", och klicka sedan på Spara.
- Öppna filen ". Xls" där du kan hitta koordinatsystemet för din mutant (resultatet grafiskt i figur 3).
- Inom den mappade området i den monterade Illumina läser av den muterade genomet identifiera specifika EMS övergångar 4 bland de enskilda nukleotidpolymorfismer. Komplettera den mutanta fenotypen genom transformation med vildtyp gen (er) med användning av standardförfaranden 15.
4. Representativa resultat
Figur 1 visar den strategi som används för identifiering av en mutant av den sekretoriska vägen med användning av konfokalmikroskopi screening. Figur 2 visar en typisk framställning av märkt genomisk DNA för matrisen hybridisering. I figur 3, ett typiskt resultat förväntas efter analys av de data som erhållits från GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array presenteras.
Figur 1. Arabidopsis transgena växter som uttrycker ssGFPHDEL (ER markör) (1) odlades för att producera tillräckligt med utsäde för EMS behandling (2). Utsäde som behandlats med EMS sedan såddes för att generera M1 växter (3). Varje M1 anläggning representerar en annan linje och utsäde samlades in separat från varje av dem. M2 frö ströks ut på halv MS substrat (4) och screenades sedan för defekter i ER morfologi genom konfokal mikroskopi (5). Under screening vi funnit växter som konserveras av vildtyp ER morfologi (6) och växter som uppvisar defekta ER fenotyper (7). Dessa plantor odlades för att erhålla den M3-generationen och för att bekräfta fenotyp (8). Genomiskt DNA från M3-växt användes för Solexa Illumina sekvensering (en). Samma växtanvändes också för korsningar med Ler-wt att få F2 kartläggning befolkningen (b).
Figur 2. Bioprime slumpmässiga märkningsreaktioner (5 | il av 100 | il) laddades på agarosgel 1%. Bana a är från en pool av vild typ F2-plantor, och bana b är från en pool av mutanta F2-växter. (Markör är 1 kb DNA-stege-N3232, från NEB).
Figur 3. Figuren visar ett exempel på kartläggning av Col-0 mutation med GeneChip Arabidopsis ATH1 Hybridisering Genome Array. Mutationen i detta exempel är belägen på kromosom 1, som avgränsas av vertikala staplar. De horisontella staplarna representerar trösklarna för detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit en konfokal mikroskopi screening för identifiering av endomembrane mutanter. Detta tillvägagångssätt kan enkelt utvidgas till andra organeller i cellen för vilken särskilda fluorescerande proteinmarkörer finns tillgängliga. Skärmen är baserad på identifieringen av mutanter som visar en avvikande fördelning av den fluorescerande markören antingen i mål-organell eller organeller som inte är tänkta att innehålla markören. Respektive dessa mutanter representerar populationer då antingen förmåga organell till subcompartimentalize markören äventyras eller mutanter som inte kan riktigt translokerar markören bland organeller. Under granskningen har vi märkt att vissa mutanter visade en fenotyp i tidiga utvecklingsskeden så tidigt som 7 dagar efter groning, men visade andra fenotypen endast i ett senare skede av utvecklingen. Även om detta kan kopplas till ett antal orsaker, inklusive utveckling-beroende uttryck av den muteradeallelen (s), tyder detta på att växter bör granskas i olika stadium (minst 7 till 14 dagar) för att garantera att potentiellt intressanta mutanter inte kasseras.
Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll gör att vi kan kartlägga en gen i en relativt kort tid jämfört med den klassiska kartläggning metod. I själva verket samla ett tillräckligt antal individer av F2 befolkningen används för GeneChip Array kräver en relativt liten mängd tid jämfört med F2 anläggningar som krävs för den klassiska fina kartläggning förfarande. Det finns dock kritiska steg som bör följas. Val av F2 befolkningen prover visar eller inte visar fenotypen skall utföras noggrant, eftersom tillsatsen av ens ett litet antal växter med fel fenotypen av misstag kan införa fel i slutresultatet. Detta är främst kopplat till det faktum att F2 befolkningen som används för grov kartläggning är mycket liten. Av denna anledning valet av växter som eithenne visa eller inte visa fenotypen bör göras varje gång på samma dag efter groning. Detta beror, som vi nämnde ovan, kan utseendet på fenotypen kopplas till tillväxt. En annan viktig punkt att tänka på är att titta noga på nästa generations uppgifter postalignment, som genereras av program som ger oss viktig information som den andel av läser innehåller varianten. Det teoretiska förväntade värdet för en heterozygot variant är omkring 50%, innebär detta att 50% av sekvenserna skulle innehålla varianten medan för en homozygot variant är ca 100%. Tyvärr situationen efter en postalignment kan vara långt från det teoretiska värdet, i själva verket andelen läser innehåller varianten för heterozygot kan variera från 20 till 80%, medan 60 till 100% för homozygot 16. Därför, för att inte missar de viktigaste enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP), är det viktigt att inte kasta mutanter med mindre än 100% procentandel av reannonser för varianten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi erkänner stöd från Chemical Sciences, geovetenskap och Biosciences Division Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (tilldelning antalet DE-FG02-91ER20021) och National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Vi är tacksamma för att Karen Bird för redigering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
