胆固醇外流检测

Summary

胆固醇检测到定量，从培养细胞的胆固醇流出率和血浆受体的能力，接受从细胞释放的胆固醇。该法由标记细胞内池和胆固醇释放到细胞外受体之间的胆固醇，胆固醇平衡。

Abstract

细胞中胆固醇的含量必须保持在非常紧张的限制，过多或过少的胆固醇在一个细胞在细胞膜破坏，细胞凋亡和坏死^1。细胞可以从细胞内合成和血浆脂蛋白胆固醇，这两个来源是足够充分满足细胞胆固醇的要求。胆固醇的合成和吸收的过程中，严格监管和胆固醇的不足之处是罕见的^2。过多的胆固醇是比较常见的问题^3。细胞与肝细胞的异常和肾上腺​​皮质细胞在一定程度上，都无法降低胆固醇。细胞有两种选择，以降低他们的胆固醇含量：转换成胆固醇酯，能力有限的选项中的胆固醇，胆固醇酯细胞超载也是有毒，和胆固醇流出，潜在的无限容量的选择。胆固醇外流是一个规范的IFIC过程中，细胞内的转运，如三磷酸腺苷结合盒转运蛋白体A1（ABCA1）和G1（ABCG1的）和清道夫受体B1型监管。血浆中的胆固醇的天然受体是高密度脂蛋白（HDL）和载脂蛋白AI。

胆固醇外流试验设计定量从培养细胞的胆固醇流出率。它测量的能力，以维持细胞胆固醇流出和/或血浆受体的能力，接受从细胞释放的胆固醇。该法包括以下步骤。步骤1：标记细胞内胆固醇含血清培养基中加入标记的胆固醇，并与细胞孵育24-48小时。这一步，​​可装载细胞与胆固醇结合。第2步：在无血清培养基培养细胞之间的所有细胞内胆固醇池标记的胆固醇平衡。此阶段可结合激活细胞CHolesterol转运。第三步：培养细胞与胞外受体和定量标记的胆固醇从细胞受体的运动。如果胆固醇的前体被用来标记新合成的胆固醇，第四步，胆固醇的净化，可能需要。

该法提供了以下信息：（i）一个特定的治疗（一个突变，敲下来，过度或治疗）如何影响细胞的能力流出胆固醇和（ii）如何接受胆固醇血浆受体的能力受疾病或治疗。这种方法通常用于研究心血管，代谢和神经退行性疾病，传染病和生殖系统疾病方面。

Protocol

1。 ^[3H]胆固醇的制备

1. 在通风柜，免除到1.5 ml离心管（0.5微居里（19 kBq）每口井是一个典型的检测要求^）[3H]胆固醇所需的金额。
2. 如果^[3H]胆固醇在甲苯暂停，完全干燥氮气和重悬与100％乙醇的终浓度为1微居里（37 kBq /μL。涡拌匀。

2。的电镀细胞和标签细胞内胆固醇

该协议已通过测试，使用以下类型的细胞：人单核细胞^4,5，THP-1人单核细胞-巨噬细胞^6,7,8的RAW 264.7巨噬细胞^{5,9,10,11，12} HeLa细胞，人脐静脉内皮细胞（HUVEC），BHK-21细胞^9，人类和小鼠成纤维细胞^13,14，肝癌人肝癌细胞^15，在修改后的形式，从血小板<SUP> 16。

1. 重悬细胞，并计算它们。到12孔板板细胞最终密度0.2x10 ⁶细胞，每孔0.9毫升完全培养基。细胞会继续生长和外排实验时将达到0.8x10 ⁶细胞，每孔。对于不分裂的细胞分化的THP-1细胞，如播种密度应为0.8x10 ⁶细胞每口井。如果分别用6 - 或24孔板，双或每孔细胞数的一半。井的数量应该足够一式四份决定为每个实验条件。
2. 如果需要的THP-1细胞的分化，加入PMA（终浓度为0.1微克/毫升）到48-72Ĥ媒体。
3. 含^[3H]胆固醇的离心管中加入了媒体的小等份。
4. 与媒体之前加入^[3H]胆固醇单独成一个完整的媒体等份（100μL/孔），洗管的两侧。
<李>添加媒体细胞（每孔终体积为1毫升）含^[3H]胆固醇的水井。如果没有标签之前需要细胞治疗，细胞可镀在^[H]含胆固醇的媒介。
5. 孵育细胞在细胞培养孵化器48小时（37℃，5％CO _2）。

3。平衡育成

1. 经过48小时的潜伏期，在显微镜下检查细胞。确保它们是健康的，并在约80％汇合。
2. 取出介质含有^[3H]胆固醇。轻轻地用PBS洗涤细胞。重复3次洗涤。
3. 准备无血清培养基。如果需要，加入LXR激动剂（如在1-4毫摩尔/升-901317）或cAMP（0.3μmol/ L的;只小鼠起源细胞）激活细胞无血清媒体。
4. 每孔加入500μL无血清媒体。
5. 在细胞培养孵化器18小时的孵育（37℃，5％CO _2）。

<类p =“jove_title”> 4。胆固醇流出孵化

1. 经过18小时无血清培养基中培养，在显微镜下检查细胞。确保他们健康和融合（最低80％汇合）。
2. 准备在无血清培养基中的胆固醇流出受体的解决方案。受体的例子包括：
   载脂蛋白AI（载脂蛋白A-I），（终浓度为10微克/毫升）
   高密度脂蛋白（HDL）（终浓度为20微克/毫升）
   环糊精（终浓度为200微克/毫升）
   等离子（终浓度为1-2％）
3. 轻轻地用PBS洗涤细胞。
4. 添加受体，每孔250μL无血清培养基。
5. 离开一个集水井，以确定背景流出（流出受体与NO无血清媒体）
6. 孵育细胞，在细胞培养孵化器为2小时（37℃，5％CO _2）。流出潜伏期的持续时间可能会有所不同，从30分钟到8小时，如果需要的话。

5。加工萨mples

1. 2小时后孵化检查，显微镜下的细胞。
2. 收集到1.5 ml离心管媒体。在室温1-10分钟，14,000 rpm的旋转，以去除细胞碎片。
3. 7毫升闪烁瓶中转入100μL媒体。新增的Insta-凝胶加5毫升（珀金埃尔默）和涡混合物。其余样品储存在4°C
4. 放置在冰箱板为30分钟。每孔加入500μLDH _2。细胞在显微镜下检查，以确保所有的细胞都从井底解除。如果仍然附着，要么离开DH _{2 O的} 4°C过夜或刮井板块。
5. 一旦升空，所有的细胞，吸来打破细胞团块。 7毫升闪烁瓶转移到100微升。新增的Insta-凝胶加5毫升（珀金埃尔默）和涡混合物。储存在4°C其余板块
6. 闪烁计数器放置在闪烁瓶。配置计数器计数^{3 H]}DPM单位。

6。分析结果

1. 胆固醇流出率通常表示为胆固醇的比例，从细胞受体。使用下列公式：

2. 具体计算差异的存在或缺乏受体（空）之间的流出流出。

7。时间轴

8。代表结果

如图胆固醇流出实验结果的一个例子。 1。在这个实验中THP-1人单核细胞分化成巨噬细胞和胆固醇流出到不同的受体测试。没有受体（“空白”）介质的胆固醇流出为0.79％，此值被视为一个非特定的外流，并从其他值中减去。胆固醇外流的人载脂蛋白A-Ⅰ（终浓度为30微克/毫升）为4.75％。本实验参考的血浆样品被纳入监测实验间变异。参考样本，可用于跨越大量的实验数据正常化，但我们发现它审慎的重复检测，如果是高变异。测试之前和之后的病人药物治疗的病人的血浆（终浓度为2％）。得出的结论是，在这个病人服药有一个对血浆容量支持胆固醇外流的负面影响。

外排实验结果的另一个例子是在图所示。 2。在这个实验中，RAW 264.7巨噬细胞被激活或不激活LXR激动剂TO-901317过夜培养（终浓度加入1μmol/ L）和胆固醇流出的人类血浆相同的样本（2％）进行了测试。得出的结论是LXR激动剂激活细胞表达ABC转运增加胆固醇释放到细胞外受体细胞的能力。

图1。从THP-1细胞的各种受体的胆固醇流出胆固醇流出的百分比（即标记胆固醇的比例从指定的受体细胞）。后显示空白值的加减。平均值±SD一式四份决定，* P <0.05。

图2。从细胞胆固醇流出的RAW 264.7激活或不激活LXR激动剂对人体血浆胆固醇流出的百分比（即标记胆固醇的比例。指定受体）后显示空白值的加减。平均值±SD一式四份决定，* P <0.001。

Discussion

所描述的方法，测量胆固醇流出是用来衡量运动的胆固醇从细胞到细胞外的胆固醇受体。了解这种方法有几个关键因素。

标签和平衡

中所述的方法被添加到标记的胆固醇血清含药血清。虽然从来没有详细调查，这是假设纳入血清脂蛋白胆固醇和他们采取由细胞组成。重要的是让脂蛋白足够的时间采取了从脂蛋白胆固醇移动到细胞膜。一般24小时的标签是足够的，但48小时的标签达到较高的细胞内胆固醇的具体活动。它需要考虑到，如果^[14]胆固醇用来代替^[3H]胆固醇（如双标记实验），具体行政行为前ivity是非常低，加上足够的标记的胆固醇达到目的的具体活动可能改变细胞中胆固醇含量，从而影响了结果。同样重要的是，（ 我 ）没有任何标记的胆固醇或细胞表面上的非特异性被困脂蛋白胆固醇会被迅速纳入受体通过非特异性转移;及（ii）标记的胆固醇之间的各种细胞内的平衡池。虽然平衡的无血清培养基培养24小时，在我们的经验是不足以实现这些目标，通常48 h后使用。许多类型的细胞不存活48小时，甚至24小时无血清培养基中。在这种情况下，0.1％BSA（基本上脂肪无酸）可以作为替代。脂蛋白耗尽血清或各种血清替代补充，可以作为最后的手段使用，但重要的是要认识到，脂蛋白缺乏血清和血清替代补充可Çontain载脂蛋白和可能影响的结果。不幸的是制造商往往不透露补充剂的成分。

时间流出孵化的

胆固醇外流导致装载到细胞外受体和胆固醇耗竭胆固醇。在细胞和受体的胆固醇含量的变化可能会影响胆固醇流出的速度和其他特性。此外，如果承兑人含有胆固醇（如高密度脂蛋白胆固醇）可能会从受体细胞，如果承兑人胆固醇的具体活动变得显着，将复杂的解释结果。因此，最好是保持尽可能短的流出孵化，允许但足够数量的标记胆固醇从细胞受体，使一个可靠的检测时间。一般2-6小时是推荐的时间。孵化时间超过24小时，将反映的equili州brium，因此将是受体积累，而不是胆固醇胆固醇流出率容量指示。

受体

不同的受体是胆固醇外流的不同途径的具体。用于测量具体的胆固醇流出，载脂蛋白A-我是用来反映ABCA1依赖的外流，而高密度脂蛋白胆固醇或ABCG1的重组HDL与SR-B1依赖途径。环糊精通常被用来评估非特异性流出。重要的是要包括在实验的一个“空白”的样品，不包含在所有的受体，非特异性分离崩解死亡细胞释放的胆固醇和胆固醇的贡献来衡量的。

受体的浓度

胆固醇流出，包括（一）胆固醇由细胞释放及（ii）由承兑人吸收，这两个步骤可以限速。如果实验目的是探讨在变化细胞释​​放胆固醇的能力（如转染后或击倒），然后受体的浓度不应该是限速。对于载脂蛋白A-I和高密度脂蛋白的浓度为30-50微克/毫升通常非限速。如果容量，承兑人支持胆固醇流出是调查目标（如孤立的HDL或从病人或动物的血浆样本，以支持胆固醇流出的能力），然后受体的浓度应该限速。为载脂蛋白A-我和高密度脂蛋白通常是10微克/毫升，血浆样品，这通常是1-2％，但一个初步的剂量依赖实验，找到了正确的浓度是必不可少的选择剂量。

活化细胞

负责具体的胆固醇流出的关键要素是ABC转运，ABCA1和ABCG1。 LXR和LXR激动剂细胞的预孵化调节（最流行的化合物是TO-901317可从SIGMA）浓度1-4μmol/ L的显着增加了特定的胆固醇流出的比例。如鼠标起源细胞的RAW 264.7或J774，也可以通过cAMP激活（0.3毫摩尔/升）。

载入细胞与胆固醇

载入中胆固醇的细胞预孵化与乙酰化或氧化低密度脂蛋白或胆固醇环糊精复合物，也刺激胆固醇流出。加载细胞，尤其是巨噬细胞胆固醇改变其新陈代谢的许多方面，需要牢记。 （胆固醇加载与加载不胆固醇）模式的选择取决于研究的科学目标。

结果介绍

通常胆固醇流出实验的结果是胆固醇从细胞释放的百分比：消除变异细胞数量在个别井和标记效率。然而，TH是唯一有效的，如果治疗不影响胆固醇的吸收，并在承兑人（空白）的情况下流出。这两个条件，需要实验证明。

从理论上讲，这种方法可以用来研究任何蜂窝选区流出到细胞外受体。如果不像胆固醇，这种化合物被代谢，然后分析纯化步骤需要包含。此外，如果在细胞中合成的化合物，合成的前体，可用于标注。例如^，[14]醋酸和^[3Ĥ]水被用来研究新合成的胆固醇流出和^[14 C]研究磷脂流出的胆。需要通常是由薄层色谱分离前体和中间体，在这种情况下，新合成的胆固醇。