Cholesterin Efflux-Assay

Summary

Die Cholesterin-Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen und die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu quantifizieren. Der Test besteht aus Markieren von Zellen mit Cholesterin, Äquilibrierung von Cholesterin unter den intrazellulären Pools und Freisetzung von Cholesterol an einer extrazellulären Akzeptor.

Abstract

Cholesteringehalt von Zellen innerhalb der sehr engen Grenzen gehalten werden, zu viel oder zu wenig Cholesterin in einer Zelle führt zu Störungen von Zellmembranen, Apoptose und Nekrose ^1. Die Zellen können Quelle Cholesterin aus intrazellulären Synthese und von Plasma-Lipoproteine ​​sind beide Quellen ausreichend, um Zellen vollständig erfüllen die Anforderungen für Cholesterin. Die Prozesse der Cholesterin-Synthese und die Aufnahme ist streng reguliert und Mängel an Cholesterin sind selten ^zwei. Übermäßige Cholesterin ist häufiger Problem ^3. Mit Ausnahme von Hepatozyten und in gewissem Maße NNR-Zellen, Zellen sind nicht in der Lage, Cholesterin zu degradieren. Die Zellen haben zwei Möglichkeiten, um ihre Cholesterin-Gehalt zu reduzieren: auf Cholesterin in Cholesterylester, eine Option mit begrenzten Kapazitäten zu konvertieren, wie eine Überlastung Zellen mit Cholesterylestern ist auch giftig, und Cholesterin Efflux, eine Option, mit potenziell unbegrenzte Kapazität. Cholesterin Efflux ist ein specific Prozess, der durch eine Reihe von intrazelluläre, wie ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Proteine ​​A1 (ABCA1) und G1 (ABCG1) und Scavenger-Rezeptor des Typs B1 reguliert wird. Die natürliche Akzeptor von Cholesterin im Plasma ist High Density Lipoprotein (HDL) und Apolipoprotein AI.

Die Cholesterin-Efflux Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen zu quantifizieren. Es misst die Fähigkeit von Zellen, Cholesterin Efflux und / oder die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu halten. Der Assay besteht aus den folgenden Schritten. Schritt 1: Markieren zellulärem Cholesterin mit indem markiertem Cholesterin im Serum enthaltenden Medium und Inkubation mit Zellen für 24-48 h. Dieser Schritt kann mit dem Laden der Zellen mit Cholesterin kombiniert werden. Schritt 2: Inkubation der Zellen in einem Serum-freien Medium auf markiertem Cholesterin unter allen intrazellulären Cholesterin-Pools sich ausgleichen lassen. Dieses Stadium kann mit der Aktivierung von zellulären ch kombiniert werdenolesterol Transporter. Schritt 3: Inkubation der Zellen mit der extrazellulären Akzeptor und Quantifizierung der Bewegung des markierten Zellen Cholesterin aus dem Akzeptor. Wenn Cholesterin Vorstufen wurden verwendet, um neu synthetisierte Cholesterin zu kennzeichnen, einen vierten Schritt, Reinigung von Cholesterin, erforderlich sein.

Der Test liefert folgende Informationen: (i), wie eine bestimmte Behandlung (eine Mutation, eine Knock-down, eine Überexpression oder eine Behandlung) die Kapazität der Zelle wirkt sich auf Efflux Cholesterin und (ii), wie die Kapazität des Plasma-Cholesterin-Akzeptoren zu akzeptieren durch eine Krankheit oder eine Behandlung beeinflusst. Diese Methode wird häufig in Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Forschung, metabolische und neurodegenerative Erkrankungen, Infektionskrankheiten und reproduktiven Erkrankungen eingesetzt.

Protocol

1. Herstellung von ^[3 H]-Cholesterin

1. In der Dunstabzug, verzichten die erforderliche Menge an ^[3 H] Cholesterin in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 uCi (19 kBq) pro Vertiefung ist für einen typischen Test erforderlich).
2. Wenn ^{[3H]-Cholesterin} in Toluol suspendiert wird, trocknen Sie ihn nach unten komplett mit N2-Gas-und resuspendieren mit 100% Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 1 uCi (37 kBq / ul. Vortex und gut mischen.

2. Plattieren von Zellen und Kennzeichnung zellulärem Cholesterin

Dieses Protokoll wurde getestet mit folgenden Zelltypen: menschliche Monozyten ^4,5, THP-1-menschlichen Monozyten-Makrophagen ^6,7,8, RAW 264.7 murine Makrophagen ^5,9,10,11, HeLa-Zellen ^12, HUVEC (HUVEC), BHK-21 Zellen ^9, Human-und Maus-Fibroblasten ^13,14, HepG2 menschlichen Hepatokarzinomzellen ¹⁵ und, in modifizierter Form, von Thrombozyten <sup> 16.

1. Die Zellen und zähle sie. Tafel Zellen in 12-Well-Platten bei der Enddichte von 0.2x10 ⁶ Zellen pro Well in 0,9 ml Vollmedium. Die Zellen werden weiter wachsen und 0.8x10 ⁶ Zellen pro Well zu dem Zeitpunkt der Ausströmung Experiment erreicht. Für Zellen, die sich nicht teilen, wie differenzierte THP-1 Zellen, sollte die Aussaatdichte 0.8x10 ⁶ Zellen pro Vertiefung sein. Bei Verwendung von 6 - oder 24-Well-Platten, doppelt oder halb so viele Zellen pro Well. Die Zahl der Brunnen sollte ausreichend sein für Vierfachbestimmungen Für jeden experimentellen Zustand.
2. Wenn die Differenzierung von THP-1-Zellen erforderlich ist, fügen PMA (Endkonzentration 0,1 g / ml) zu den Medien für 48-72 h.
3. Fügen Sie eine kleine Teilmenge von Medien in das Mikrozentrifugenröhrchen mit der ^[3 H] Cholesterin.
4. Waschen Seiten der Röhre mit Medien vor dem Hinzufügen ^[3 H] Cholesterin in einen separaten Aliquot komplette Medien (100 ul / Well).
<li> In der Medien, die ^[3 H]-Cholesterin in die Vertiefungen mit Zellen (Endvolumen pro Well 1 ml). Wenn keine Behandlung der Zellen vor der Markierung erforderlich ist, können Zellen in ^[3 H]-Cholesterin-Medium ausplattiert werden.
5. Inkubieren Zellen für 48 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO _2).

3. Äquilibrierung Incubation

1. Nach 48 Stunden Inkubation, überprüfen Zellen unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, sie sind gesund und sind bei etwa 80% Konfluenz.
2. Entfernen Sie das Medium mit ^[3 H] Cholesterin. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS. Wiederholen Sie 3 mal Waschen.
3. Bereiten serumfreien Medien. Falls erforderlich, aktivieren Zellen durch Zugabe von LXR-Agonisten (z. B. TO-901317 bei 1-4 mmol / l) oder cAMP (0,3 mmol / l; für Zellen der Maus Ursprungs) zu serumfreien-Medien.
4. Fügen Sie 500 ul serumfreiem Medium in jede Vertiefung.
5. Inkubieren für 18 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO _2).

<p class = "jove_title"> 4. Cholesterin Efflux Incubation

1. Nach 18 Stunden Inkubation in Serum-freiem Medium, zu überprüfen Zellen unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sie gesund sind und konfluent (mindestens 80% Konfluenz).
2. Planen Lösung von Cholesterin Efflux Akzeptoren in serumfreiem Medium. Beispiele für Akzeptoren schließen ein:
   Apolipoprotein AI (ApoA-I) (Endkonzentration 10 ug / ml)
   High Density Lipoprotein (HDL) (Endkonzentration 20 ug / ml)
   Cyclodextrin (Endkonzentration 200 ug / ml)
   Plasma (Endkonzentration 1-2%)
3. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS.
4. Fügen Sie 250 ul serumfreiem Medium mit Akzeptoren in jede Vertiefung.
5. Lassen Sie eine Reihe von Brunnen, um Hintergrund-Efflux (Ausstrom zu serumfreien Medien ohne Akzeptor) bestimmen
6. Inkubieren Zellen für 2 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO _2). Dauer der Inkubation kann Efflux von 30 min bis 8 h variieren, wenn erforderlich.

5. Processing SAmples

1. Nach 2 Stunden Inkubation überprüfen Zellen unter dem Mikroskop.
2. Sammeln Sie Medien in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 14.000 rpm für 1-10 min bei Raumtemperatur, um Zelltrümmer zu entfernen.
3. Übertragen Sie 100 ul Medium in 7 ml Szintillations-Fläschchen. In 5 ml Insta-Gel Plus (PerkinElmer) und Vortex-Mischung. Bewahren restlichen Proben bei 4 ° C
4. Platzieren Sie Platten in Gefrierschrank für 30 Minuten. Fügen Sie 500 ul dH ₂ O in jede Vertiefung. Prüfen Zellen unter dem Mikroskop zu gewährleisten, dass alle Zellen von der Unterseite der Vertiefungen angehoben. Wenn noch anhaftenden, entweder die Platten mit dH ₂ O bei 4 ° C über Nacht oder Kratzen Brunnen.
5. Wenn alle Zellen aufgehoben wurden ausgeschaltet, und Abpipettieren zum Aufbrechen Zellklumpen. Übertragen Sie 100 ul in 7 ml Szintillationsgefäße. In 5 ml Insta-Gel Plus (PerkinElmer) und Vortex-Mischung. Bewahren restlichen Platten bei 4 ° C
6. Platzieren Sie Szintillationsgefäße auf Szintillationszähler. Konfigurieren Zähler für ^[3 H] zählen indpm Einheiten.

6. Die Analyse der Ergebnisse

1. Die Rate der Cholesterin-Efflux in der Regel als ein Anteil von Cholesterin aus den Zellen verschoben auf den Akzeptor ausgedrückt. Die folgende Formel verwendet wird:

2. Die spezifische Abgabe erfolgt als eine Differenz zwischen den Ausfluß in Gegenwart oder Abwesenheit des Akzeptors (leer) berechnet.

7. Timeline

8. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für ein Ergebnis einer Cholesterin-Efflux Versuchs ist in gezeigt. 1. In diesem Experiment THP-1 Monozyten wurden in Makrophagen und Cholesterin Efflux auf verschiedene Akzeptoren differenziert wargetestet. Cholesterin Efflux um Medium ohne Akzeptoren ("blank") betrug 0,79% und dieser Wert wurde als nicht-spezifische Efflux angesehen und von anderen Werten abgezogen. Cholesterin Efflux für die menschliche ApoA-I (Endkonzentration 30 ug / ml) war 4,75%. Ein Verweis Plasmaprobe wurde in diesem Experiment aufgenommen, um inter-experimentellen Variabilität überwachen. Eine Referenzprobe kann für die Normalisierung der Daten über eine große Anzahl von Experimenten verwendet werden, aber wir fanden es sinnvoll, den Test wiederholen, wenn die Variabilität ist hoch. Ein Patient Plasma (Endkonzentration 2%) wurde getestet, bevor und nachdem der Patient mit Medikamenten behandelt wurde. Es wurde gefolgert, dass bei diesem Patienten Medikamente hatten einen negativen Einfluss auf die Kapazität des Plasma-Cholesterin-Efflux zu unterstützen.

Ein weiteres Beispiel für ein Ergebnis des Experiments ist in Efflux gezeigt. 2. In diesem Experiment wurden Makrophagen-RAW 264.7 aktiviert oder nicht aktiviert durch Inkubation über Nacht mit LXR-Agonisten TO-901.317 (Endkonzentration1 mol / L) und Cholesterin Efflux zu der gleichen Probe von menschlichem Plasma (2%) wurde getestet. Es wurde festgestellt, dass die Aktivierung der zellulären Expression von ABC-Transportern mit LXR-Agonisten die Fähigkeit von Zellen, Cholesterin zu extrazellulären Akzeptor freizugeben erhöht.

Abbildung 1. Cholesterin Efflux aus THP-1 Zellen auf verschiedene Akzeptoren. Anteil von Cholesterin Efflux (dh der Anteil der markierten Cholesterin aus den Zellen bewegt, um die angegebene Akzeptor) nach Abzug des Rohlings Werte beschränkt. Mittelwert ± Standardabweichung von Vierfachbestimmungen, * p <0,05.

Abbildung 2. Cholesterin Ausfluß aus RAW 264.7 aktiviert oder nicht aktiviert mit LXR-Agonisten an menschlichem Plasma. Anteil von Cholesterin Efflux (dh der Anteil der markierten Cholesterin aus den Zellen bewegt, um dieangegeben Akzeptor) wird nach Abzug der Blindwerte gezeigt. Mittelwert ± SD von Vierfachbestimmungen, * p <0,001.

Discussion

Das beschriebene Verfahren zur Cholesterin-Efflux gemessen wurde entwickelt, um die Bewegung von Cholesterin aus den Zellen zu einer extrazellulären Cholesterin-Akzeptor zu messen. Es gibt einige kritische Überlegungen zum Verständnis dieser Methode.

Kennzeichnung und Äquilibrierung

In der beschriebenen Methode markierten Cholesterin im Serum enthaltenden Serum zugegeben. Obwohl dies nicht im Detail untersucht, wird angenommen, dass Cholesterin in Serum-Lipoproteine ​​enthalten ist und sie werden von den Zellen aufgenommen. Es ist wichtig, genügend Zeit für Lipoproteine ​​zu berücksichtigen gilt, und für Cholesterin aus Lipoproteinen an zelluläre Membranen zu bewegen. In der Regel 24 h Kennzeichnung ist ausreichend, aber die Kennzeichnung für 48 h erzielt eine höhere spezifische Aktivität von intrazellulären Cholesterins. Es muss berücksichtigt werden, dass, wenn ^[14 C] Cholesterin wird anstelle von ^[3 H] Cholesterin verwendet (zB in Doppel-Kennzeichnung Experimente), die spezifische Handlungduktivität des ehemaligen sehr niedrig ist und das Hinzufügen von markiertem Cholesterin genug, um spezifische Aktivität bestimmt erzielen kann sich ändern, Zell-Cholesterin-Gehalt und damit Einfluss auf das Ergebnis. Es ist auch wichtig, dass (i) gibt es keine markierten Cholesterin oder Lipoproteine ​​nicht spezifisch auf der Zelloberfläche eingefangen, da dies Cholesterin schnell durch einen Akzeptor über unspezifische Übertragung aufzunehmen, und (ii) markiertem Cholesterin äquilibriert zwischen verschiedenen intrazellulären Pools. Obwohl in unserer Erfahrung 24 h Äquilibrierung Inkubation in Serum-freiem Medium ist ausreichend, um diese Ziele zu erreichen, wird in der Regel 48 h Inkubation verwendet. Viele Zelltypen nicht für 48 h oder 24 h in serumfreiem Medium zu überleben. In diesem Fall 0,1% BSA (im wesentlichen Fettsäure-frei) kann als Ersatz fungieren. Lipoprotein-abgereichertem Serum oder Serum-Ersatz verschiedenen Ergänzungen als letztes Mittel eingesetzt werden können, aber es ist wichtig, dass Lipoprotein-defizienten Serum tut und Serum-Ersatz Ergänzungen erkennen kann contain Apolipoproteine ​​und das kann das Ergebnis beeinflussen. Leider Hersteller oft offenbaren nicht die Zusammensetzung der Ergänzungen.

Dauer der Inkubation Efflux

Cholesterin Efflux führt zur Beladung von Cholesterin zu einer extrazellulären Akzeptor-und Abbau von Cholesterin in den Zellen. Änderungen in Cholesteringehalt von Zellen und Akzeptor kann Einfluss auf die Geschwindigkeit und andere Eigenschaften von Cholesterin Efflux. Außerdem, wenn der Akzeptor enthält Cholesterin (zB HDL) kann es von Akzeptor zu Zellen bewegen und wenn spezifische Aktivität von Cholesterin in der Akzeptor signifikant wird, das wird die Interpretation der Ergebnisse erschweren. So ist es am besten, Efflux Inkubationszeit so kurz wie möglich zu halten, wodurch jedoch Zeit für eine ausreichende Menge an markiertem Cholesterin aus den Zellen auf den Akzeptor zu bewegen, um eine sichere Erkennung zu ermöglichen. Im Allgemeinen 2-6 h ist die empfohlene Zeit. Inkubationen länger als 24 h würde reflektieren einen Zustand des Gleichgewichts und daher wird ein Indikator für die Fähigkeit von Akzeptor zu Cholesterin als die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux ansammeln.

Acceptor

Unterschiedliche Akzeptoren sind spezifisch für unterschiedliche Wege von Cholesterin Efflux. Zur Messung der spezifischen Cholesterin-Efflux, ApoA-I wird verwendet, um ABCA1-abhängige Efflux während HDL oder rekonstituiertem HDL für ABCG1 und SR-B1-abhängige Signalwege zu reflektieren. Cyclodextrin wird häufig verwendet, um nicht-spezifische Efflux bewerten. Es ist wichtig, im Experiment ein "leeres" Probe, die keinen Akzeptor enthält überhaupt, um den Beitrag der nicht-spezifischen Dissoziation von Cholesterin und Cholesterin aus zerfallenden abgestorbenen Zellen freigesetzt zu messen sind.

Konzentration des Akzeptors

Cholesterin Efflux umfasst (i) Freisetzung von Cholesterin von den Zellen und (ii) seine Aufnahme durch einen Akzeptor, können beide Schritte sein geschwindigkeitsbestimmend. Wenn die experimentellen Ziel ist es, Änderungen in der UntersuchungKapazität von Zellen, Cholesterin freisetzen (z. B. nach der Transfektion oder Knock-down), dann die Konzentration des Akzeptors nicht geschwindigkeitsbegrenzende sein. Für ApoA-I und HDL-Konzentrationen von 30-50 pg / ml sind in der Regel nicht geschwindigkeitsbestimmend. Wenn die Kapazität des Akzeptors, Cholesterin Efflux unterstützen ist das Ziel der Untersuchung (zB Kapazität von isolierten HDL oder Plasmaproben von Patienten oder Tieren zu Cholesterin Efflux unterstützen), dann die Konzentration des Akzeptors sollte geschwindigkeitsbestimmenden. Für ApoA-I und HDL dies in der Regel 10 pg / ml, für Plasma-Proben ist dies in der Regel 1-2%, aber eine vorläufige Dosisabhängigkeit Experiment, um eine korrekte Konzentration zu finden ist wichtig, die Dosis zu wählen.

Aktivierung von Zellen

Die wichtigsten Elemente, die für bestimmte Cholesterin Efflux sind zwei ABC-Transporter, ABCA1 und ABCG1. Beide werden von LXR und Vorinkubation der Zellen mit LXR-Agonisten reguliert (beliebtesten Verbindung TO-901.317, erhältlich von Sigma) in Konzentrationen von 1 bis 4 verwendet mmol / L signifikant erhöht den Anteil der spezifischen Cholesterin-Efflux. Zellen von einer Maus stammt, wie RAW 264.7 oder J774, kann auch durch cAMP (0,3 mMol / L) aktiviert werden.

Beladung von Zellen mit Cholesterin

Laden der Zellen mit Cholesterin durch Vorinkubieren sie mit acetylierten oder oxidiertes LDL-Cholesterin oder Cyclodextrin-Komplex stimuliert Cholesterin Efflux. Es muss bedacht werden, dass Be-Zellen, insbesondere Makrophagen mit Cholesterin verändert viele Aspekte ihres Stoffwechsels. Wahl des Modells (Cholesterin im Vergleich zu nicht geladen geladen Cholesterin) hängt davon ab, wissenschaftliche Ziel der Studie.

Präsentation der Ergebnisse

Normalerweise sind die Ergebnisse von Cholesterin Efflux Experiments sind als Prozentsatz von Cholesterin aus den Zellen freigesetzt dargestellt: dies eliminiert Variabilität von Zellzahl in einzelnen Wells und der Effizienz der Kennzeichnung. Allerdings thwird ist nur gültig, wenn die Behandlung nicht beeinträchtigt haben die Aufnahme von Cholesterin und den Efflux in Abwesenheit des Akzeptors (leer). Diese beiden Bedingungen müssen experimentell nachgewiesen.

Theoretisch kann diese Methode verwendet, um zelluläre Efflux von jedem Wahlkreis zu einer extrazellulären Akzeptor zu studieren. Wenn, im Gegensatz zu Cholesterin, eine solche Verbindung metabolisiert wird, dann eine analytische Reinigungsschritt muss enthalten sein. Ferner, wenn die Verbindung in der Zelle synthetisiert wird, kann Vorstufen für die Kennzeichnung verwendet werden. Zum Beispiel, ^[14 C] Acetat und ^[3 H] Wasser wurden verwendet, um den Abfluss von neu synthetisierten Cholesterin zu studieren und ^[14 C] Cholat für das Studium der Efflux von Phospholipiden. In diesem Fall neu synthetisierten Cholesterin muss von Vor-und Zwischenprodukte getrennt werden, in der Regel durch Dünnschichtchromatographie.