Kolesterol effluks Assay

Summary

Den kolesterol analysen er konstruert for å quantitate frekvensen av kolesterol utstrømming fra dyrkede celler og kapasitet på plasma akseptorer å akseptere kolesterol løslatt fra celler. Analysen består av merking celler med kolesterol, likevekt av kolesterol blant intracellulære bassenger og frigjøring av kolesterol til en ekstracellulær akseptor.

Abstract

Kolesterol innhold av celler må opprettholdes innenfor svært trange rammer, for mye eller for lite kolesterol i en celle resulterer i forstyrrelser av cellemembraner, apoptose og nekrose ^en. Celler kan kilde kolesterol fra intracellulær syntese og fra plasma lipoproteiner, begge kildene er tilstrekkelig til å tilfredsstille cellenes behov for kolesterol. Prosessene av kolesterol syntese og opptak er tett regulert og mangler av kolesterol er sjeldne ^to. Overdreven kolesterol er mer vanlig problem ^3. Med unntak av hepatocytter og i noen grad adrenokortikal celler, celler ikke klarer å fornedre kolesterol. Celler har to alternativer for å redusere sitt kolesterol innhold: å konvertere kolesterol til kolesteryl estere, et alternativ med begrenset kapasitet som overbelastning celler med kolesteryl estere er også giftig, og kolesterol utstrømming, et alternativ med potensielt ubegrenset kapasitet. Utstrømming av kolesterol er en specific prosess som er regulert av en rekke intracellulære transportører, slik som ATP bindende kassett Transporter proteiner A1 (ABCA1) og G1 (ABCG1) og scavenger reseptor type B1. Den naturlige akseptor av kolesterol i plasma er høy density lipoprotein (HDL) og apolipoprotein AI.

Den kolesterol utstrømming analysen er utformet for å quantitate frekvensen av kolesterol utstrømming fra dyrkede celler. Den måler antall celler til å opprettholde kolesterol utstrømming og / eller evne plasma akseptorer å akseptere kolesterol løslatt fra celler. Analysen består av følgende trinn. Trinn 1: merking cellulær kolesterol ved å legge merket kolesterol til serum-holdig medium og ruger med celler i 24-48 timer. Dette trinnet kan kombineres med lasting av celler med kolesterol. Trinn 2: inkubering av celler i serum-fri medium skal stabilisere merket kolesterol blant alle intracellulære kolesterol bassenger. Dette stadiet kan kombineres med aktivering av mobilnettet lmolesterol transportører. Trinn 3: inkubering av celler med ekstracellulært akseptor og kvantifisering av bevegelse av merket kolesterol fra cellene til akseptor. Dersom kolesterol forløpere ble brukt til å merke nylig syntetisert kolesterol, et fjerde trinn, rensing av kolesterol, kan kreves.

Analysen gir følgende informasjon: (i) hvordan en bestemt behandling (en mutasjon, en knock-down, en overuttrykk eller en behandling) påvirker kapasiteten til cellen for å efflux kolesterol og (ii) hvordan kapasiteten til plasma akseptorer å akseptere kolesterol påvirkes av en sykdom eller en behandling. Denne metoden er ofte brukt i sammenheng med kardiovaskulær forskning, metabolske og nevrodegenerative lidelser, smittsomme og reproduktive sykdommer.

Protocol

1. Utarbeidelse av ^[3 H]-kolesterol

1. I avtrekksskap, dispensere den nødvendige mengden av ^[3 H] kolesterol inn i en 1,5 ml microfuge tube (0,5 μCi (19 kBq) per brønn er nødvendig for en typisk analyse).
2. Hvis ^[3 H]-Kolesterol er suspendert i toluen, tørke den helt ned med N2 gass og resuspender med 100% etanol til en endelig konsentrasjon på 1 μCi (37 kBq / mL. Vortex og bland godt.

2. Kontaktflate Cells og merking Cellular Kolesterol

Denne protokollen er testet ved bruk av følgende celletyper: humane monocytter ^4,5, THP-1 humane monocytt-makrofager ^6,7,8, RAW 264,7 murine makrofager ^5,9,10,11, Helà celler ^12, menneskelig umbilical vein endothelial celler (HUVEC), BHK-21 celler ^9, menneskelige og mus fibroblaster ^13,14 og HepG2 menneskelige hepatocarcinoma celler ^15, og i modifisert form, fra blodplater <sup> 16.

1. Resuspender celler og telle dem. Plate celler inn i 12-brønns plater på avsluttende tettheten av 0.2x10 ⁶ celler per brønn i 0,9 ml komplett medium. Celler vil fortsette å vokse og vil nå 0.8x10 ⁶ celler per brønn ved tidspunktet for effluks eksperimentet. For celler som ikke deler, for eksempel differensierte THP-1 celler, bør seeding tetthet være 0.8x10 ⁶ celler per brønn. Hvis du bruker 6 - eller 24-brønns plater, dobbel eller halve antall celler per brønn henholdsvis. Antallet brønner bør være tilstrekkelig for fire eksemplarer bestemmelser for hver eksperimentell betingelse.
2. Dersom differensiering av THP-1 celler er nødvendig, legger PMA (endelig konsentrasjon 0,1 mikrogram / ml) til media i 48-72 timer.
3. Legg til en liten delmengde av media i microfuge røret som inneholder ^[3 H] kolesterol.
4. Vask sider av rør med media før han legger ^[3 H] kolesterol inn i en egen delmengde av komplette media (100 mL / brønn).
<li> Legg til medier som inneholder ^[3 H] kolesterol til brønnene med celler (endelig volum per brønn er 1 ml). Hvis ingen behandling av celler kreves før merking, kan cellene bli belagt i ^[3 H] kolesterol-holdig medium.
5. Inkuber cellene i 48 timer i cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO _2).

3. Ekvilibrering Inkubasjon

1. Etter 48 timers inkubering, sjekk cellene under mikroskop. Sikre at de er sunne og er på ca 80% samløpet.
2. Fjern medier som inneholder ^[3 H] kolesterol. Vask cellene forsiktig med PBS. Gjenta 3 vaske ganger.
3. Forbered serum-frie medier. Om nødvendig, aktiverer cellene ved å legge LXR agonist (for eksempel TO-901317 på 1-4 mmol / L) eller cAMP (0,3 mikromol / L, for celler av mus opprinnelse bare) til serum free-media.
4. Legg 500 mL serum frie medier til hver brønn.
5. Inkuber i 18 timer i cellekultur inkubatoren (37 ° C, 5% CO _2).

<p class = "jove_title"> 4. Kolesterol effluks Inkubasjon

1. Etter 18 timers inkubering i serum-fri medium, sjekk cellene under mikroskop. Sikre at de er sunne og konfluent (minimum 80% confluency).
2. Forbered løsning av kolesterol utstrømming akseptorer i serum-fri medium. Eksempler på akseptorer inkluderer:
   Apolipoprotein AI (apoA-I) (endelig konsentrasjon 10 mg / ml)
   Høy density lipoprotein (HDL) (endelig konsentrasjon 20 mg / ml)
   Cyclodextrin (endelig konsentrasjon 200 mg / ml)
   Plasma (endelig konsentrasjon 1-2%)
3. Vask cellene forsiktig med PBS.
4. Tilsett 250 mL av serum-frie medier med akseptorer til hver brønn.
5. La ett sett av brønner for å avgjøre bakgrunn effluks (effluks til serum frie medier med NO akseptor)
6. Inkuber cellene i 2 timer i cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO _2). Varighet av effluks inkubasjonstiden kan variere fra 30 min til 8 timer om nødvendig.

5. Processing Samples

1. Etter 2 timer inkubering sjekke cellene under mikroskop.
2. Samle medier i 1,5 ml microfuge rør. Snurr på 14.000 rpm for 1-10 min ved romtemperatur for å fjerne mobilnettet rusk.
3. Overfør 100 mL medier i 7 ml scintillation hetteglass. Legg fem mls av Insta-gel Plus (PerkinElmer) og virvle blanding. Oppbevar resterende prøvene ved 4 ° C.
4. Plasser platene i fryseren i 30 minutter. Legg til 500 mL dH ₂ O til hver brønn. Sjekk cellene under mikroskop for å sikre at alle cellene har løftet fra bunnen av brønnene. Hvis det fortsatt tilhenger, enten la platene med dH ₂ O ved 4 ° C over natten eller skrape brønner.
5. Når alle cellene har løftet seg, pipetter opp og ned for å bryte opp celle klumper. Overfør 100 mL inn i 7 ml scintillation hetteglass. Legg fem mls av Insta-gel Plus (PerkinElmer) og virvle blanding. Oppbevar resterende platene ved 4 ° C.
6. Plasser scintillation hetteglass på scintillation disken. Konfigurer telleren til å telle for ^[3 H] iDPM enheter.

6. Analyse av resultatene

1. Satsen for kolesterol utstrømming er vanligvis uttrykt som en andel av kolesterol flyttet fra cellene til akseptor. Følgende formel benyttes:

2. Den spesifikke efflux beregnes som en forskjell mellom effluks i nærvær eller fravær av akseptor (blank).

7. Tidslinje

8. Representative Resultater

Et eksempel på et resultat av en kolesterol utstrømming eksperiment er vist i fig. 1. I dette eksperimentet THP-1 humane monocytter ble differensiert i makrofager og kolesterol utstrømming til ulike akseptorer vartestet. Utstrømming av kolesterol til medium uten akseptorer ("blank") var 0,79% og denne verdien ble ansett som en ikke-spesifikk efflux og ble trekkes fra andre verdier. Utstrømming av kolesterol til menneske apoA-I (endelig konsentrasjon 30 mg / ml) var 4,75%. En referanse plasma prøven ble tatt inn i dette eksperimentet for å overvåke inter-eksperimentell variasjon. En referanseprøve kan brukes til normalisering av data på tvers av et stort antall forsøk, men vi fant det forsvarlig å gjenta analysen dersom variasjonen er høy. En pasient plasma (endelig konsentrasjon 2%) ble testet før og etter at pasienten ble behandlet med medisiner. Det ble konkludert med at i denne pasienten medisinen hadde en negativ innvirkning på kapasiteten plasma å støtte kolesterol utstrømming.

Et annet eksempel på en utfallet av effluks forsøket er vist i fig. 2. I dette eksperimentet RAW 264,7 makrofager var aktivert eller ikke aktiveres av natten inkubasjon med LXR agonist TO-901317 (endelig konsentrasjon1 mikromol / L) og kolesterol utstrømming til samme prøve av menneskelig plasma (2%) ble testet. Det ble konkludert med at aktivering av mobilnettet uttrykk for ABC transportører med LXR agonist øker kapasiteten av celler å slippe kolesterol til ekstracellulær akseptor.

Figur 1. Kolesterol utstrømming fra THP-1 celler til ulike akseptorer. Prosent av kolesterol utstrømming (dvs. andelen av merket kolesterol flyttet fra cellene til den angitte akseptor) vises etter fratrekk av tomme verdier. Mean ± SD av fire eksemplarer bestemmelser, * p <0,05.

Figur 2. Kolesterol utstrømming fra RAW 264,7 aktivert eller ikke aktivert med LXR agonist til humant plasma. Prosent av kolesterol utstrømming (dvs. andelen av merket kolesterol flyttet fra cellene tilspesifisert akseptor) vises etter fratrekk av tomme verdier. Mean ± SD av fire eksemplarer bestemmelser, * p <0,001.

Discussion

Den beskrives metode for å måle kolesterol utstrømming er laget for å måle bevegelse av kolesterol fra cellene til en ekstracellulær kolesterol akseptor. Det er flere kritiske betraktninger i å forstå denne metoden.

Merking og likevekt

I den beskrevne metodikken merkede kolesterol legges til serum-holdig serum. Selv aldri undersøkt i detalj, er det antatt at kolesterol er innarbeidet i serum lipoproteiner og de er tatt opp av cellene. Det er viktig å gi tilstrekkelig tid for lipoproteiner å bli tatt opp og for kolesterol å flytte fra lipoproteiner til cellemembraner. Vanligvis 24 h merking er tilstrekkelig, men merking for 48 h oppnår høyere spesifikk aktivitet av intracellulær kolesterol. Det må tas hensyn til at dersom ^[14 C] kolesterol brukes i stedet for ^[3 H] kolesterol (f.eks doble merking eksperimenter), den spesifikke handlingenivity av det tidligere er svært lav og legge nok merket kolesterol å oppnå beregnet spesifikk aktivitet kan endre celle kolesterol innhold og dermed påvirke utfallet. Det er også viktig at (i) er det ingen merket kolesterol eller lipoproteiner ikke-spesifikt fanget på celleoverflaten som dette kolesterol vil bli raskt inn ved en akseptor via ikke-spesifikk overføring, og (ii) merket kolesterol er likevekt mellom ulike intracellulære bassenger. Selv i vår erfaring 24 t ekvilibrering inkubasjon i serum-fri medium er tilstrekkelig for å oppnå disse målene, er vanligvis 48 timers inkubering brukt. Mange celletyper ikke overleve 48 timer eller enda 24 timer i serum-fri medium. I dette tilfellet 0,1% BSA (hovedsakelig fatty acid-free) kan fungere som substitutt. Lipoprotein-utarmet serum eller ulike serum-erstatning kosttilskudd kan brukes som en siste utvei, men det er viktig å erkjenne at lipoprotein-mangelfull serum gjør og serum-erstatning kosttilskudd kan contain apolipoproteins og som kan påvirke utfallet. Dessverre produsentene ofte ikke avsløre sammensetningen av kosttilskudd.

Varighet av effluks inkubasjon

Utstrømming av kolesterol fører til lasting av kolesterol til en ekstracellulær akseptor og uttømming av kolesterol i celler. Endringer i kolesterol innhold av både celler og akseptor kan påvirke din og andre egenskaper av kolesterol utstrømming. Videre, hvis akseptor inneholder kolesterol (f.eks HDL) kan det gå fra akseptor til celler og dersom spesifikk aktivitet av kolesterol i akseptor blir betydelige, vil det komplisere tolkningen av resultatene. Dermed er det best å holde efflux inkubering så kort som mulig, slik imidlertid tid for tilstrekkelig mengde merket kolesterol å flytte fra cellene til akseptor for å aktivere en pålitelig deteksjon. Vanligvis 2-6 h er den anbefalte tiden. Inkuberinger lengre enn 24 t ville reflektere en tilstand av equilibrium og derfor vil være en indikasjon av kapasiteten akseptor å akkumulere kolesterol snarere enn frekvensen av kolesterol utstrømming.

Akseptor

Ulike akseptorer er spesifikke for ulike veier av kolesterol utstrømming. For måling av spesifikk kolesterol utstrømming, apoA-I brukes til å reflektere ABCA1-avhengige efflux mens HDL eller rekonstruert HDL for ABCG1 og SR-B1-avhengige veier. Cyclodextrin blir ofte brukt for å vurdere ikke-spesifikk effluks. Det er viktig å ta med i eksperimentet en "blank" prøven, som ikke inneholder akseptor i det hele tatt, for å måle bidraget av ikke-spesifikk dissosiasjon av kolesterol og kolesterol løslatt fra oppløsning døde celler.

Konsentrasjon av akseptor

Kolesterol utstrømming omfatter (i) frigjøring av kolesterol i celler og (ii) sin opptak av en akseptor, kan begge trinnene være hastighetsbegrensende. Hvis den eksperimentelle målet er å undersøke endringer ikapasitet på cellene for å frigjøre kolesterol (for eksempel etter transfeksjon eller knock-down), da konsentrasjonen av akseptor bør ikke være hastighetsbegrensende. For apoA-I og HDL konsentrasjonene på 30-50 mikrogram / ml er vanligvis ikke hastighetsbegrensende. Dersom kapasiteten på akseptor for å støtte kolesterol utstrømming er målet for undersøkelsen (f.eks antall isolerte HDL-eller plasmaprøver fra pasienter eller dyr for å støtte kolesterol utstrømming), da konsentrasjonen av akseptor bør være hastighetsbegrensende. For apoA-I og HDL dette er vanligvis 10 mikrogram / ml, for plasmaprøver dette er vanligvis 1-2%, men en foreløpig dose-avhengighet eksperiment for å finne en riktig konsentrasjon er viktig å velge dosen.

Aktivering av celler

De viktigste elementene som er ansvarlige for spesifikk kolesterol utstrømming er to ABC transportører, ABCA1 og ABCG1. Begge er regulert av LXR og pre-inkubering av celler med LXR agonist (mest populære forbindelsen er TIL-901317 tilgjengelig fra SigMA) brukes ved konsentrasjoner 1-4 mikromol / L signifikant øker andelen spesifikk kolesterol utstrømming. Celler av mus opprinnelse, for eksempel RAW 264,7 eller J774, kan også aktiveres ved cAMP (0,3 mmol / L).

Lasting av celler med kolesterol

Lasting av celler med kolesterol ved pre-inkubasjon dem med acetylert eller oksidert LDL eller cyclodextrin-kolesterol kompleks stimulerer også kolesterol utstrømming. Det må holdes i bakhodet at lasting celler, spesielt makrofager med kolesterol endringer mange aspekter av metabolisme deres. Valg av modell (kolesterol lastet versus ikke kolesterol lastet) avhenger vitenskapelige målet med studien.

Presentasjon av resultatene

Vanligvis resultatene av kolesterol utstrømming forsøket blir presentert som en prosentandel av kolesterol løslatt fra cellene: dette eliminerer variasjonen fra celle nummer i individuelle brønner og i effektivitet av merking. Men ther er bare gyldig dersom behandlingen ikke påvirker kolesterolet opptak og utstrømming i fravær av den akseptor (blank). Disse to forholdene må være eksperimentelt bevist.

Teoretisk denne metoden kan brukes til å studere effluks av enhver cellulær valgkrets til en ekstracellulær akseptor. Dersom, i motsetning til kolesterol, er slik sammensatt metaboliseres, deretter en analytisk rensingen må inkluderes. Videre, hvis det sammensatte syntetiseres i cellen, kan syntetiske forløpere brukes til merking. For eksempel, ^[14 C] acetat og ^[3 H] vann ble brukt for å studere effluks av nylig syntetisert kolesterol og ^[14 C] cholate for å studere effluks av fosfolipider. I dette tilfellet nylig syntetisert kolesterol må skilles fra prekursorer og mellomprodukter, vanligvis ved tynt lag kromatografi.