Холестерин Анализ истечения

Summary

Холестерин анализ предназначен для количественного определения скорости оттока холестерина из культивируемых клеток и способность плазмы акцепторов принять холестерина выпустили из клеток. Анализ состоит из маркировки клеток холестерина, холестерина равновесия между внутриклеточными бассейны и выпуск холестерина внеклеточной акцептором.

Protocol

1. Подготовка ^[3 H]-холестерина

1. В вытяжной шкаф, отказаться от требуемого количества ^[3 H] холестерина в 1,5 мл микроцентрифужную трубки (0,5 мКи (19 кБк) в каждую лунку необходимо для типичного анализа).
2. Если ^[3 H]-холестерина приостановлена ​​в толуоле, высушите его полностью с N2 газ и ресуспендируют со 100%-ным этанолом до конечной концентрации 1 мкКи (37 кБк / мкл. Vortex и хорошо перемешать.

2. Покрытие клетки и маркировки сотовых Холестерин

Этот протокол был протестирован с помощью следующих типов клеток: человеческие моноциты ^4,5, THP-1 человеческих моноцитов-макрофагов ^6,7,8, RAW 264.7 мышиных макрофагов ^5,9,10,11, HeLa клетки ¹² человек эндотелия пупочной вены клеткам (HUVEC), ВНК-21 клеток ^9, человеческих и мышиных фибробластов ^13,14, HepG2 клетках человека гепатокарциномы ¹⁵ и в измененном виде, из тромбоцитов <sup> 16.

1. Ресуспендируйте клеток и их сосчитать. Пластина клеток в 12-луночных планшетов на конечной плотности 0.2x10 ⁶ клеток на лунку в 0,9 мл полной среды. Клетки будут продолжать расти и достигнет 0.8x10 ⁶ клеток на хорошо ко времени истечения эксперимента. Для клеток, которые не делятся, например, дифференцированный ТНР-1 клеток, плотности посева должна быть 0.8x10 ⁶ клеток на лунку. При использовании 6 - или 24-луночный, двойных или половину числа клеток на лунку соответственно. Количество скважин должна быть достаточной для определения четырех экземплярах для каждой экспериментальной состоянии.
2. Если дифференциация ТНР-1 клеток необходимо, добавьте PMA (конечная концентрация 0,1 мкг / мл) в средствах массовой информации в течение 48-72 часов.
3. Добавить небольшую аликвоту СМИ в отцентрифугировать пробирку с ^[3 H] холестерина.
4. Вымойте стороны трубки со средствами массовой информации, прежде чем добавлять ^[3 H] холестерина в отдельных аликвоту полный СМИ (100 мкл / лунку).
<LI> Добавить средах, содержащих ^[3 H] холестерина в лунки с клетками (конечный объем на одну скважину составляет 1 мл). При отсутствии лечения клеток необходимо до маркировки, клетки могут быть покрыты в ^[3 H] холестерина содержащей среде.
5. Инкубируйте клетки в течение 48 часов в культуре клеток инкубатор (37 ° C, 5% CO _2).

3. Уравновешивание Инкубационный

1. После 48 часов инкубации, проверьте клеток под микроскопом. Убедитесь, что они здоровы и находятся в примерно 80% слияния.
2. Удалить средах, содержащих ^[3 H] холестерина. Промойте клетки осторожно PBS. Повторите 3 раза стирки.
3. Подготовить бессывороточной СМИ. При необходимости активировать клетки, добавив LXR агониста (например, TO-901 317 на 1-4 ммоль / л) или цАМФ (0,3 ммоль / л, для клеток мышей происхождения только) в сыворотке крови свободной информации.
4. Добавить 500 мкл сыворотки свободных средств массовой информации в каждую лунку.
5. Выдержите в течение 18 часов в культуре клеток инкубатор (37 ° C, 5% CO _2).

<с классом = "jove_title"> 4. Холестерин Инкубационный истечение

1. После 18 часов инкубации в бессывороточной среде, проверьте клеток под микроскопом. Убедитесь, что они здоровы и сливной (минимум 80% слияния).
2. Подготовить решение холестерина истечения акцепторов в бессывороточной среде. Примерами акцепторов включают в себя:
   Аполипопротеина AI (апо-I) (конечная концентрация 10 мкг / мл)
   Липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (конечная концентрация 20 мкг / мл)
   Циклодекстрин (конечная концентрация 200 мкг / мл)
   Плазменные (конечная концентрация 1-2%)
3. Промойте клетки осторожно PBS.
4. Добавить 250 мкл сыворотки среде с акцепторами в каждую лунку.
5. Оставьте один набор скважин для определения фоне оттока (отток в сыворотке крови свободных средств массовой информации с NO акцептор)
6. Инкубируйте клетки в течение 2 часов в культуре клеток инкубатор (37 ° C, 5% CO _2). Срок истечения инкубационного может варьироваться от 30 минут до 8 часов, если требуется.

5. Обработка Samples

1. Через 2 часа инкубации проверить клетки под микроскопом.
2. Сбор СМИ в пробирки на 1,5 мл отцентрифугировать. Спиновая при 14000 оборотов в минуту в течение 1-10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить продукты распада клеток.
3. Передача 100 мкл среды на 7 флакон сцинтилляционных мл. Добавьте 5 мл Insta-гель Plus (PerkinElmer) и вихревой смеси. Хранить оставшихся образцов при температуре 4 ° C.
4. Установите плиты в морозилку на 30 минут. Добавить 500 мкл дН ₂ O в каждую лунку. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки подняли со дна скважины. Если все же сторонник, либо оставить пластины с дН ₂ O при температуре 4 ° С в течение ночи или царапина скважин.
5. После того как все клетки сняты, пипетка вверх и вниз, чтобы разбить ячейку сгустки. Передача 100 мкл на 7 флаконов мл сцинтилляционного. Добавьте 5 мл Insta-гель Plus (PerkinElmer) и вихревой смеси. Храните оставшиеся пластины при температуре 4 ° C.
6. Поместите сцинтилляционных флаконов на сцинтилляционных счетчиков. Настройка счетчика рассчитывать на ^[3 H] вDPM единиц.

6. Анализ результатов

1. Уровень холестерина истечения обычно выражается в виде доли от холестерина переехал из клетки акцептора. Используется следующая формула:

2. Конкретные истечения рассчитывается как разница между истечения в присутствии или отсутствии акцептора (пустой).

7. Хронология

8. Представитель Результаты

Пример результатов эксперимента холестерина истечения показано на рис. 1. В этом эксперименте THP-1 человека моноциты дифференцируются в макрофаги и холестерина истечение различных акцепторовиспытания. Холестерин истечения в среде с не акцепторами ("пустой") было 0,79%, и это значение рассматривается как неспецифический истечения и вычитается из других ценностей. Холестерин истечения для человеческого апо-I (конечная концентрация 30 мкг / мл) 4,75%. Образец ссылки плазма была включена в этот эксперимент, чтобы контролировать между экспериментальной изменчивости. Эталонного образца могут быть использованы для нормализации данных между большим числом экспериментов, но мы сочли разумным, чтобы повторить тест, если изменчивость высока. Пациент плазмы (конечная концентрация 2%) был испытан до и после пациент лечился с помощью лекарств. Сделан вывод, что у этого пациента препарат оказывает негативное воздействие на способность плазмы поддерживать холестерин истечения.

Другой пример результате истечения эксперимента приведена на рис. 2. В этом эксперименте RAW 264.7 макрофаги активирован или не активирован ночной инкубации с LXR агониста TO-901 317 (конечная концентрация1 мкмоль / л) и холестерина истечения в том же образце плазмы крови человека (2%) была проверена. Был сделан вывод, что активация клеточного выражение перевозчиков ABC с агонистов LXR увеличивает пропускную способность клеток к выпуску холестерина внеклеточной акцептором.

Рисунок 1. Холестерин истечение из ТНР-1 клеток различных акцепторов. Процент холестерина истечения (т.е. доля меченых холестерин перемещается из клеток к указанной акцептор) показана после вычитания из пустых значений. Среднее ± стандартное отклонение в четырех экземплярах определений, * р <0,05.

Рисунок 2. Холестерин истечение из RAW 264.7 активирован или не активирован с LXR агониста плазмы крови человека. Процент холестерина истечения (т.е. доля меченых холестерина переехал из клеткиуказанные акцептор) показана после вычитания пустые значения. Среднее ± стандартное отклонение в четырех экземплярах определений, * р <0,001.

Discussion

Описанный метод измерения холестерина истечения предназначен для измерения движения холестерина из клеток внеклеточную акцептором холестерина. Есть несколько важных соображений, в понимании этой методологии.

Маркировка и равновесия

В описанной методологии меченых холестерина добавляют сыворотку содержащих сыворотки. Хотя никогда не исследовал в деталях, то предполагается, что холестерин включается в сыворотке липопротеидов, и они принимаются к клеткам. Важно, чтобы обеспечить достаточное время для липопротеинов, которые будут рассматриваться и холестерина, чтобы перейти от липопротеинов в клеточные мембраны. Обычно 24 часов маркировки достаточно, но маркировка в течение 48 ч достигает более высокой удельной активности внутриклеточного холестерина. Следует учитывать, что если ^[14 C] холестерин используется вместо ^[3 H] холестерина (например, в экспериментах двойной маркировки), конкретные действияivity бывшего является очень низким и добавить достаточно помечены холестерина для достижения намеченных удельную активность может изменить содержимое ячейки холестерина и таким образом повлиять на результат. Важно также, что (я) нет меченых холестерина липопротеинов или неспецифически удерживается на поверхности клеток, так как это холестерин будет быстро включить акцептором через неспецифические передачу, и (II), меченных холестерин находится в равновесии между различными внутриклеточными бассейнах. Хотя по нашему опыту, 24 ч инкубации равновесия в бессывороточной среде достаточно для достижения этих целей, как правило, через 48 ч инкубации используются. Многие типы клеток не выживают в течение 48 часов или даже 24 часов в бессывороточной среде. В этом случае 0,1% BSA (в основном жирных кислот) может выступать в качестве замены. Липопротеинов обедненный сыворотки или различные сыворотки замена добавки могут быть использованы в качестве последнего средства, но важно признать, что липопротеин-дефицитные сыворотки и сыворотки делает замены добавки могут сontain аполипопротеинов и которые могут повлиять на результат. К сожалению, производители часто не раскрывают состав добавки.

Срок истечения инкубационного

Холестерин оттока приводит к загрузке холестерина внеклеточной акцептора и истощение холестерина в клетках. Изменения в содержании холестерина из клеток и как акцептор может повлиять на скорость и другие свойства холестерина истечения. Кроме того, если акцептор содержит холестерина (HDL, например) может перейти от акцептора клетки и если удельная активность холестерина в акцептором становится заметным, что усложняет интерпретацию результатов. Таким образом, лучше всего держать истечения инкубационного как можно короче, позволяя однако время достаточное количество меченого холестерина, чтобы перейти от клетки к акцептору чтобы надежного обнаружения. Обычно 2-6 ч является рекомендуемой времени. Инкубацию более 24 ч будет отражать состояние равновесияравновесии и, следовательно, будет свидетельствовать о качестве акцептора накапливать холестерин, а не скорость истечения холестерина.

Акцептор

Различные акцепторами являются специфическими для разных путей оттока холестерина. Для измерения удельной истечения холестерина, апо-I используется для отражения ABCA1 зависит от истечения в то время как ЛПВП или восстановленных ЛПВП для ABCG1 и SR-B1-зависимые пути. Циклодекстрин часто используется для оценки неспецифической истечения. Важно включить в эксперимент «пустой» образца, который не содержит акцепторные на все, чтобы измерить вклад неспецифической распада холестерина и холестерина, освобождается от отмерших клеток распадается.

Концентрация акцепторных

Холестерин истечения включает в себя (я) выпуск холестерина клетками и (II), поглощение его акцептором, как шаги могут быть ограничения скорости. Если экспериментальная цель состоит в изучении изменений вспособности клеток к выпуску холестерина (например, после трансфекции или нокдаун), то концентрация акцептора не должно быть ограничения скорости. Для апо-I и ЛПВП концентрации 30-50 мкг / мл, как правило, без ограничения скорости. Если емкость акцептора поддерживать холестерин истечения цель исследования (например, создание изолированных HDL или плазмы крови от больных животных или поддерживать холестерин истечение), то концентрация акцептора должно быть ограничение скорости. Для апо-I и ЛПВП это, как правило, 10 мкг / мл, для плазмы крови обычно это 1-2%, но предварительные дозы зависимость экспериментировать, чтобы найти правильную концентрацию необходимо выбрать дозу.

Активация клеток

Ключевые элементы, отвечающие за конкретные истечения холестерина два ABC транспортеров, ABCA1 и ABCG1. Как регулируется LXR и предварительной инкубации клеток с агонистом LXR (самый популярный соединения К-901 317 можно получить Sigма), используемых при концентрации 1-4 мкмоль / л существенно возрастает доля конкретных отток холестерина. Клетки мыши происхождения, таких как RAW 264.7 или J774, также могут быть активированы цАМФ (0,3 ммоль / л).

Погрузка клеток с холестерином

Погрузка клеток с холестерином путем предварительного инкубирования их или ацетилированный окисленный LDL или циклодекстрин холестерина комплекс также стимулирует отток холестерина. Следует иметь в виду, что загрузка клеток, макрофагов, особенно с холестерином изменения многих аспектов их жизнедеятельности. Выбор модели (холестерин загружены по сравнению с холестерином не загружается) зависит от научной цели исследования.

Представление результатов

Как правило, результаты эксперимента холестерина истечения представлены в процентах от холестерина выпустили из клеток: это исключает изменчивость от количества клеток в отдельных скважинах и в эффективность маркировки. Тем не менее, мбудет только справедливо, если лечение не влияет на уровень холестерина поглощения и оттока в отсутствие акцептора (пустой). Эти два условия должны быть экспериментально доказано.

Теоретически этот метод может быть использован для изучения истечения любого сотового группы для внеклеточных акцептором. Если, в отличие от холестерина, такое соединение метаболизируется, то аналитический этап очистки должен быть включен. Кроме того, если соединение синтезируется в клетке, синтетические предшественники могут быть использованы для маркировки. Так, например, ^[14 C] ацетат и ^[3 H] воду для изучения истечения вновь синтезированного холестерина и ^[14 C] холат для изучения истечения фосфолипидов. В этом случае вновь синтезированного холестерина должно быть отделено от предшественников и промежуточных продуктов, как правило, с помощью тонкослойной хроматографии.