Kolesterol Utflöde Analys

Summary

Kolesterol-analys är utformad för att kvantifiera graden av kolesterol utflöde från odlade celler och förmågan hos plasma-acceptorer att acceptera kolesterol utlösts från celler. Analysen består av märka celler med kolesterol, jämviktning av kolesterol hos intracellulära pooler och frisättning av kolesterol till en extracellulär acceptor.

Abstract

Kolesterolhalten i celler måste upprätthållas inom mycket snäva gränser, för mycket eller för lite kolesterol i en cell resulterar i avbrott av cellmembran, apoptos och nekros ^1. Celler kan källan kolesterol från intracellulär syntes och från plasma lipoproteiner, båda källorna är tillräckliga för att helt tillgodose cellernas krav på kolesterol. Processerna för kolesterolsyntes och upptag är hårt reglerad och bristerna hos kolesterol är sällsynta ^2. Överdriven kolesterol är vanligare problem ^3. Med undantag av hepatocyter och i viss utsträckning adrenokortikala celler, celler inte kan brytas ned kolesterol. Celler har två alternativ för att minska sin kolesterolhalt: att omvandla kolesterol till kolesterylestrar, ett alternativ med begränsad kapacitet som överbelasta cellerna med kolesterylestrar är också giftig, och kolesterol utflöde, ett alternativ med potentiellt obegränsad kapacitet. Kolesterol efflux är en specific process som regleras av ett antal intracellulära transportörer, såsom ATP-bindande kassett transportör proteiner A1 (ABCA1) och G1 (ABCG1) och elimineringsmedel receptortyp B1. Den naturliga acceptor av kolesterol i plasma är högdensitetslipoprotein (HDL) och apolipoprotein AI.

Kolesterol utflöde analys är utformad för att kvantifiera graden av kolesterol utflöde från odlade celler. Den mäter kapaciteten hos celler att upprätthålla kolesterol utflöde och / eller kapaciteten hos plasmat acceptorer att acceptera kolesterol utlösts från celler. Analysen består av följande steg. Steg 1: märkning cellulär kolesterol genom att tillsätta märkt kolesterol till serum-innehållande medium och inkubera med cellerna under 24-48 timmar. Detta steg kan kombineras med lastning av celler med kolesterol. Steg 2: inkubation av celler i serumfritt medium till jämvikt märkt kolesterol hos alla intracellulära kolesterol pooler. Detta steg kan kombineras med aktivering av cellulära cholesterol transportörer. Steg 3: inkubation av celler med extracellulär acceptor och kvantifiering av flödet av märkt kolesterol från celler till acceptorn. Om kolesterol prekursorer användes för att märka nyligen syntetiserade kolesterol,, ett fjärde steg, rening av kolesterol kan erfordras.

Analysen innehåller följande information: (i) hur en viss behandling (en mutation, en knock-down, ett överuttryck eller en behandling) påverkar förmågan hos cellen att utflöde kolesterol och (ii) hur kapaciteten av plasma acceptorer att acceptera kolesterol påverkas av en sjukdom eller en behandling. Denna metod används ofta i samband med kardiovaskulär forskning, metabola och neurodegenerativa sjukdomar, infektionssjukdomar och reproduktiva sjukdomar.

Protocol

1. Framställning av ^{[3H]-kolesterol}

1. I dragskåpet och dispensera den erforderliga mängden av ^{[3H]-kolesterol} i ett 1,5 ml mikrofugrör (0,5 pCi (19 kBq) per brunn krävs för en typisk analys).
2. Om ^{[3H]-kolesterol} suspenderas i toluen, torka den ned fullständigt med N2-gas och återsuspendera med 100% etanol till en slutlig koncentration av 1 ^ Ci (37 kBq / il. Vortex och blanda väl.

2. Plätering Celler och märkning Cellular Kolesterol

Detta protokoll har testats med användning av följande celltyper: humana monocyter ^4,5, THP-1-humana monocyt-makrofager ^6,7,8, RAW 264.7 murina makrofager ^5,9,10,11, HeLa-celler ^12, humana umbilikalvenendotelceller celler (HUVEC), BHK-21 celler ^9, mänskliga och musfibroblaster ^13,14, HepG2 mänskliga celler hepatokarcinom ¹⁵ och, i modifierad form, från trombocyter <sup> 16.

1. Resuspendera celler och räkna dem. Plattan celler i 12-brunnsplattor vid den slutliga densiteten hos 0.2x10 ⁶ celler per brunn i 0,9 ml komplett medium. Cellerna fortsätter att växa och kommer att nå 0.8x10 ^6-celler per brunn vid tiden för utflödet experimentet. För celler som inte delar sig, såsom differentierade THP-1 celler, bör såddtäthet vara 0.8x10 ⁶ celler per brunn. Vid användning av 6 - eller 24-brunnsplattor, dubbel-eller hälften av antalet celler per brunn resp. Antalet brunnar bör vara tillräcklig för fyrfaldiga bestämningar för varje experimentbetingelse.
2. Om differentiering av THP-1 celler krävs, tillsätt PMA (slutlig koncentration 0,1 ng / ml) till mediet under 48-72 timmar.
3. Tillsätt en liten alikvot av medium in i mikrocentrifugrör innehållande ^{[3H]-kolesterol.}
4. Tvätta sidor av röret med medium före tillsats av ^{[3H]-kolesterol} i en separat alikvot av komplett medium (100 | il / brunn).
<li> Lägg till media som innehåller ^[3 H] kolesterol till brunnarna med celler (slutlig volym per brunn är 1 ml). Om ingen behandling av celler krävs innan märkning, kan celler ströks ut i ^{[3H]-kolesterol-innehållande} medium.
5. Inkubera cellerna i 48 timmar i cellkultur inkubator (37 ° C, _5% CO2).

3. Jämviktning Inkubation

1. Efter 48 timmars inkubation, ta celler under mikroskop. Se till att de är friska och ligger på cirka 80% konfluens.
2. Avlägsna media innehållande ^{[3H]-kolesterol.} Tvätta cellerna försiktigt med PBS. Upprepa 3 tvätt gånger.
3. Framställ serumfria medier. Om så erfordras, aktivera celler genom tillsats av LXR-agonist (t.ex. TO-901.317 vid 1-4 mmol / L) eller cAMP (0,3 | imol / L; för celler av musursprung endast) till serumfritt-medium.
4. Tillsätt 500 pl serumfritt medium till varje brunn.
5. Inkubera under 18 h i cellkulturen inkubator (37 ° C, _5% CO2).

<p class = "jove_title"> 4. Kolesterol Utflöde Inkubation

1. Efter 18 timmars inkubation i serum-fritt medium, ta celler under mikroskop. Se till att de är friska och sammanflytande (minst 80% sammanflytning).
2. Bered lösningen av kolesterol efflux acceptorer i serum-fritt medium. Exempel på acceptorer innefattar:
   Apolipoprotein AI (apo A-I) (slutlig koncentration 10 | ig / ml)
   Högdensitetslipoprotein (HDL) (slutlig koncentration 20 | ig / ml)
   Cyklodextrin (slutlig koncentration 200 pg / ml)
   Plasma (slutlig koncentration 1-2%)
3. Tvätta cellerna försiktigt med PBS.
4. Tillsätt 250 pl serumfritt medium med acceptorer till varje brunn.
5. Lämna en uppsättning av brunnar för att bestämma bakgrund utflöde (utflöde till serumfritt media med NO acceptor)
6. Inkubera cellerna under 2 h i cellkultur inkubator (37 ° C, _5% CO2). Varaktighet av utflödet inkubation kan variera från 30 min till 8 h. om så erfordras.

5. Bearbetning Samples

1. Efter 2 timmars inkubation kontrollera celler under mikroskop.
2. Samla material i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Snurra vid 14000 rpm under 1-10 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna cellulärt skräp.
3. Överför 100 | il medium i 7 ml scintillationsampull. Tillsätt 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) och virvel-blandning. Lagra återstående proven vid 4 ° C.
4. Placera plattor i frysen i 30 minuter. Tillsätt 500 pl dHaO ₂ O i varje brunn. Ta celler under mikroskop för att säkerställa att alla celler har lyfts från botten av brunnarna. Om du fortfarande anhängare, antingen lämna plattor med dH ₂ O vid 4 ° C över natten eller skrapa brunnar.
5. När väl alla celler har lyfts bort, pipettera upp och ner för att bryta upp cellklumpar. Överför 100 | il i 7 ml scintillationsflaskor. Tillsätt 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) och virvel-blandning. Lagra återstående plattorna vid 4 ° C.
6. Placera scintillationsflaskor på scintillationsräknare. Konfigurera räknaren att räkna för ^[3 H] idpm enheter.

6. Analys av resultat

1. Graden av kolesterol utflöde uttrycks oftast som en del av kolesterol flyttade från celler till acceptom. Följande formel används:

2. Den specifika efflux beräknas som skillnaden mellan utflödet i närvaro eller frånvaro av acceptorn (blank).

7. Tidslinje

8. Representativa resultat

Ett exempel på en resultat av en kolesterol-utflöde experiment visas i figur. 1. I detta experiment THP-1 humana monocyter differentieras till makrofager och kolesterol efflux till olika acceptorer vartestas. Kolesterol efflux till medium utan acceptorer ("blank") var 0,79%, och detta värde ansågs som en icke-specifik utflöde och var subtraheras från andra värden. Kolesterol utflöde till humant apo A-I (slutlig koncentration 30 | ig / ml) var 4,75%. En referens plasmaprov infördes i detta experiment för att övervaka mellan experimentell variabilitet. Ett referensprov kan användas för normalisering av data över ett stort antal experiment, men vi fann det klokt att upprepa analysen om variationen är hög. En patient plasma (slutkoncentration 2%) testades före och efter det att patienten behandlades med läkemedel. Drogs slutsatsen att i denna patient medicin hade en negativ inverkan på förmågan av plasma för att stödja kolesterol efflux.

Ett annat exempel på en resultat av utflödet experiment visas i figur. 2. I detta experiment RAW 264.7 makrofager aktiverades eller inte aktiverats genom inkubering över natt med LXR agonist TO-901.317 (slutlig koncentration1 | imol / L) och kolesterol utflöde till samma prov av humanplasma (2%) testades. Man drog slutsatsen att aktivering av cellulär expression av ABC-transportörer med LXR-agonist ökar kapaciteten hos celler att frigöra kolesterol till extracellulär acceptom.

Figur 1. Kolesterol utflöde från THP-1 celler till olika acceptorer. Procent kolesterol utflöde (dvs andelen av märkt kolesterol förflyttas från celler till den specificerade acceptom) visas efter subtraktion av blankvärden. Medelvärde ± SD av fyrfaldiga bestämningar, * p <0,05.

Figur 2. Kolesterol utflöde från RAW 264,7 aktiverat eller inte aktiveras med LXR-agonist för human plasma. Andel av kolesterol utflöde (dvs. andelen märkta kolesterol flyttas från cellerna tillspecificerade acceptor) visas efter subtraktion av tomma värden. Medelvärde ± SD av fyrfaldiga bestämningar, * p <0,001.

Discussion

Den beskrivna metoden för att mäta kolesterol utflöde är utformad för att mäta förflyttning av kolesterol ur celler till en extracellulär kolesterol-acceptor. Det finns flera viktiga faktorer för att förstå denna metod.

Märkning och jämvikt

I den beskrivna metoden märkt kolesterol tillsättes till serum-innehållande serum. Dock aldrig undersökts i detalj, antas det att kolesterol ingår i serum lipoproteiner och de tas upp av celler. Det är viktigt att ge tillräcklig tid för lipoproteiner som tas upp och att kolesterol att gå från lipoproteiner till cellmembran. Vanligen 24 h märkning är tillräcklig, men märkning under 48 timmar uppnår högre specifik aktivitet av intracellulär kolesterol. Det måste beaktas att om ^[14 C]-kolesterol användes i stället för ^{[3H]-kolesterol} (t ex i dubbla märkningsexperimenten), den specifika handlingivity av den tidigare är mycket låg och att lägga tillräckligt märkta kolesterol för att uppnå avsett specifik aktivitet kan ändra innehåll cell kolesterol och därmed påverka resultatet. Det är också viktigt att (i) det finns ingen märkt kolesterol eller lipoprotein ospecifikt infångade på cellytan, eftersom detta kolesterol kommer att snabbt införlivas genom en acceptor via icke-specifik överföring, och (ii) märkt kolesterol jämviktas mellan olika intracellulära pooler. Även om vår erfarenhet 24 timmar jämvikt inkubation i serum-fritt medium är tillräcklig för att uppnå dessa mål, är oftast 48 h inkubation används. Många celltyper överlever inte under 48 h eller till och med 24 h i serumfritt medium. I detta fall 0,1% BSA (i huvudsak fettsyra-fri) kan verka som substitut. Lipoprotein-utarmade serum eller olika serum-ersättning tillskott kan användas som en sista utväg, men det är viktigt att inse att lipoprotein-brist i serum gör och serum-ersättning tillskott kan contain apolipoproteiner och som kan påverka resultatet. Tyvärr tillverkarna ofta inte avslöjar inte sammansättningen av tillskott.

Varaktighet efflux inkubationen

Kolesterol efflux leder till lastning av kolesterol till en extracellulär acceptor och utarmning av kolesterol i celler. Förändringar i kolesterolhalt av både celler och acceptorställen kan påverka hastigheten och andra egenskaper av kolesterol utflöde. Dessutom, om acceptorn innehåller kolesterol (t.ex. HDL) kan röra sig från acceptom till celler, och om specifika aktiviteten av kolesterol i acceptom blir betydande, kommer att komplicera tolkningen av resultaten. Sålunda är det bäst att hålla utflödet inkubation så kort som möjligt, så att emellertid tiden för tillräcklig mängd märkt kolesterol för att flytta från celler till acceptom för att möjliggöra en pålitlig detektering. Generellt 2-6 timmar är den rekommenderade tiden. Inkubationer längre än 24 timmar skulle spegla ett tillstånd av equilibrium och kommer därför vara ett tecken på förmåga acceptor ackumulera kolesterol snarare än graden av kolesterol efflux.

Acceptor

Olika acceptorer är specifika för olika vägar för kolesterol utflöde. För mätning av specifik kolesterol utflöde, apo A-I används för att reflektera ABCA1-beroende HDL utflöde medan eller rekonstituerad HDL till ABCG1 och SR-B1-beroende reaktionsvägar. Cyklodextrin används ofta för att utvärdera icke-specifik utflöde. Det är viktigt att inkludera i experimentet en "blank" prov, som inte innehåller någon acceptor alls, för att mäta bidraget av icke-specifik dissociation av kolesterol och kolesterol frigörs från sönderfallande döda celler.

Koncentrationen av acceptorn

Kolesterol utflöde innefattar (i) frisättning av kolesterol genom celler och (ii) dess upptag av en acceptor, kan båda stegen är hastighetsbegränsande. Om den experimentella målet är att undersöka förändringar ikapaciteten hos celler att frigöra kolesterol (t ex efter transfektion eller knock-down), så är koncentrationen av acceptorn inte bör vara hastighetsbegränsande. För apo A-I och HDL koncentrationerna av 30-50 pg / ml är vanligen icke hastighetsbegränsande. Om kapaciteten hos acceptorn för att stödja kolesterol utflöde är målet för undersökningen (t.ex. förmågan hos isolerade HDL eller plasmaprov från patienter eller djur för att stödja kolesterol utflöde), så är koncentrationen av acceptorn bör vara hastighetsbegränsande. För apo A-I och HDL detta görs vanligen 10 | ig / ml, för plasmaprover detta är vanligtvis 1-2%, men en preliminär dos-beroende experiment för att finna en korrekt koncentration är viktigt att välja den dos.

Aktivering av celler

De centrala delarna är ansvariga för specifik kolesterol utflödet är två ABC-transportörer och ABCA1 och ABCG1. Båda regleras av LXR och förinkubering av celler med LXR-agonist (mest populära föreningen är TILL-901.317 tillgänglig från Sigma) vid koncentrationer 1-4 | imol / l signifikant ökar den andel av specifika kolesterol utflöde. Celler av musursprung, såsom RAW 264,7-eller J774, kan också aktiveras genom cAMP (0,3 mmol / L).

Laddning av cellerna med kolesterol

Lastning av celler med kolesterol genom pre-inkubering dem med acetylerat eller oxiderade LDL eller cyklodextrin-kolesterol komplex stimulerar också kolesterol efflux. Det måste hållas i minnet att lastning celler, speciellt makrofager med kolesterol förändringar många aspekter av deras metabolism. Val av modell (kolesterol laddad kontra inte kolesterol laddad) beror på vetenskaplig Målet med studien.

Presentation av resultaten

Vanligtvis resultatet av kolesterol utflöde experiment presenteras som procent av kolesterol frigörs från cellerna, vilket eliminerar variationen från cellantalet i individuella brunnar och effektivitet av märkning. Emellertid: eär gäller endast om behandlingen inte påverkade kolesterol upptag och utflödet i frånvaro av acceptorn (blank). Dessa två villkor måste vara experimentellt bevisad.

Teoretiskt denna metod kan användas för att studera utflöde av någon cellulär valkrets för en extracellulär acceptor. Om, till skillnad från kolesterol, är en sådan förening metaboliseras sedan en analytisk reningssteg behöver ingå. Vidare, om den förening syntetiseras i cellen, kan syntetiska prekursorer användas för märkning. Till exempel, ^[14 C]-acetat och ^[3H] vatten användes för att studera utflödet av nysyntetiserade kolesterol och ^[14 C] cholat för att studera utflödet av fosfolipider. I detta fall nysyntetiserade kolesterol måste separeras från prekursorer och mellanprodukter, vanligtvis med hjälp av tunnskiktskromatografi.