Ensaio de efluxo do colesterol

Summary

O ensaio de colesterol é concebido para quantificar a taxa de efluxo de colesterol a partir de células cultivadas e da capacidade de plasma aceitadores para aceitar o colesterol libertado a partir de células. O ensaio consiste de marcação das células com o equilíbrio do colesterol, de colesterol entre pools intracelulares e libertação de colesterol para um aceitador extracelular.

Abstract

Teor de colesterol de células deve ser mantida dentro dos limites muito apertados, muito ou pouco colesterol em alguns resultados de células em ruptura das membranas celulares, a apoptose e necrose ^1. As células podem colesterol fonte da síntese intracelular e de lipoproteínas plasmáticas, ambas as fontes são suficientes para satisfazer plenamente as necessidades de células para o colesterol. Os processos de síntese de colesterol e absorção são fortemente regulados e deficiências de colesterol são ² raro. Excesso de colesterol é de ³ problema mais comum. Com a excepção dos hepatócitos e para algumas células grau adrenocorticais, as células são incapazes de degradar o colesterol. As células têm duas opções para reduzir seu teor de colesterol: para converter colesterol em ésteres de colesterol, uma opção com capacidade limitada como sobrecarga células com ésteres de colesterol também é tóxico, e efluxo do colesterol, uma opção com capacidade potencialmente ilimitado. Efluxo do colesterol é uma especificaçãoprocesso ific que é regulada por uma série de transportadores intracelulares, tais como ligação de ATP cassete transportador proteínas A1 (ABCA1) e G1 (ABCG1) e B1 eliminador de tipo de receptor. O aceitador de natural de colesterol no plasma é de lipoproteína de alta densidade (HDL) e da apolipoproteína AI.

O ensaio de efluxo de colesterol é concebido para quantificar a taxa de efluxo de colesterol a partir de células cultivadas. Mede a capacidade das células para manter o efluxo de colesterol e / ou a capacidade de plasma aceitadores para aceitar o colesterol libertado a partir de células. O ensaio consiste nos passos seguintes. Passo 1: etiquetagem colesterol celular por adição de colesterol rotulados para meio contendo soro e incubando com células de 24-48 h. Este passo pode ser combinado com o carregamento de células com colesterol. Passo 2: a incubação das células em meio isento de soro para equilibrar o colesterol marcado entre todos os pools de colesterol intracelular. Esta fase pode ser combinado com a activação do celular CHtransportadores olesterol. Passo 3: a incubação de células com aceitador extracelular e quantificação de movimento do colesterol a partir de células marcadas para o aceitador. Se precursores de colesterol foram utilizados para etiquetar o colesterol recém-sintetizado, um quarto passo, a purificação do colesterol, pode ser necessária.

O ensaio proporciona a seguinte informação: (i) como um tratamento particular (uma mutação, um knock-baixo, a superexpressão um ou um tratamento) afecta a capacidade da célula para o colesterol de efluxo e (ii) como a capacidade de aceitadores de plasma para aceitar o colesterol é afectada por uma doença ou um tratamento. Este método é geralmente usado no contexto de pesquisas cardiovasculares, doenças metabólicas e neurodegenerativas, infecciosas e doenças reprodutivas.

Protocol

1. Preparação de ^[3 H]-colesterol

1. Na hotte, dispensar a quantidade necessária de ^[3 H] colesterol em um tubo de microcentrífuga 1,5 ml (0,5 uCi (19 kBq) por poço é necessário para um ensaio típico).
2. Se ^[3 H]-colesterol é suspenso em tolueno, secá-la para baixo completamente com N2 gás e ressuspender com etanol a 100% para uma concentração final de 1 uCi (37 kBq / uL Vortex. E ​​misturar bem.

2. Células proteções e Rotulagem colesterol celular

Este protocolo foi testado utilizando os seguintes tipos de células: monócitos humanos ^4,5, THP-1 humanos monócitos-macrófagos ^6,7,8, RAW 264.7 macrófagos murinos ^5,9,10,11, células HeLa ^12, de veia umbilical humana endotelial As células (HUVEC) e células BHK-21 ^9, fibroblastos humanos e rato ^13,14, células HepG2 humanas hepatocarcinoma ¹⁵ e, na forma modificada, a partir de plaquetas <sup> 16.

1. Ressuspender as células e contá-las. Células da placa em 12 poços na densidade final de 0.2x10 ⁶ células por poço em 0,9 ml de meio completo. Células irá continuar a crescer e atingirá 0.8x10 ⁶ células por poço por o tempo da experiência de efluxo. Para as células que não se dividem, tais como diferenciadas células THP-1, a densidade de sementeira deve ser 0.8x10 ⁶ células por poço. Se usando 6 - ou placas de 24 poços, duplo ou metade do número de células por poço, respectivamente. O número de poços deve ser suficiente para determinações quadruplicado para cada condição experimental.
2. Se a diferenciação de células THP-1 é necessária, adicionar PMA (concentração final de 0,1 ug / ml) aos meios de comunicação para 48-72 h.
3. Adicionar uma pequena alíquota de meios para dentro do tubo de microcentrífuga contendo o ^[3 H] colesterol.
4. Lavar os lados do tubo com os meios de antes da adição de ^[3 H] colesterol em uma alíquota separada de meio completo (100 uL / poço).
<li> Adicionar os meios contendo ^[3 H] colesterol para os poços com células (volume final por alvéolo é de 1 ml). Se nenhum tratamento de células é necessária antes de rotulagem, as células podem ser colocadas em [H ^3] meio contendo colesterol.
5. Incubar as células durante 48 horas em cultura de células incubadora (37 ° C CO, 5% _2).

3. Incubação de equilíbrio

1. Após 48 horas de incubação, verificar células ao microscópio. Garantir que eles são saudáveis ​​e estão em confluência de aproximadamente 80%.
2. Remova a mídia contendo ^[3 H] colesterol. Lave as células cuidadosamente com PBS. Repita 3 vezes de lavagem.
3. Preparar meios isentos de soro. Se necessário, ativar as células adicionando agonista LXR (como TO-901317 a 1-4 mMol / L) ou AMPc (0,3 mmol / L; para células de origem do mouse apenas) para soro livre-media.
4. Adicionar 500 ul de soro meios de comunicação livres para cada poço.
5. Incubar durante 18 horas na célula incubadora de cultura (37 ° C CO, 5% _2).

<p class = "jove_title"> 4. Incubação efluxo do colesterol

1. Após 18 horas de incubação em meio isento de soro, vá células ao microscópio. Garantir que eles são saudáveis ​​e confluente (mínimo de 80% de confluência).
2. Preparar uma solução de colesterol aceitadores de efluxo em meio isento de soro. Exemplos de aceitadores incluem:
   A apolipoproteína AI (apo AI) (concentração final 10 ug / ml)
   Lipoproteína de alta densidade (HDL) (concentração final 20 ug / ml)
   Ciclodextrina (concentração final 200 ug / ml)
   Plasma (concentração final de 1-2%)
3. Lave as células cuidadosamente com PBS.
4. Adicionar 250 uL de meios isentos de soro com aceitadores a cada poço.
5. Deixar um conjunto de poços para determinar fundo de efluxo (efluxo de mídia livre com soro NO aceitante)
6. Incubar as células durante 2 horas em cultura de células incubadora (37 ° C, 5% de CO _2). Duração da incubação pode variar de efluxo 30 min a 8 h, se necessário.

5. Processamento Samples

1. Após 2 horas de incubação verificar células ao microscópio.
2. Colete mídia em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Girar a 14.000 rpm para min 1-10 à temperatura ambiente para remover os restos celulares.
3. Transferir 100 uL meios em 7 ml frasco de cintilação. Adicionar 5 ml de gel de Insta-Plus (PerkinElmer) e mistura de vórtice. Armazenar amostras restantes a 4 ° C.
4. Colocar as placas no congelador durante 30 minutos. Adicionar 500 uL _de dH2O a cada poço. Verificar as células sob microscópio para assegurar que todas as células têm levantada a partir do fundo dos poços. Se ainda aderente, deixe placas com dH ₂ O a 4 ° C poços durante a noite ou arranhão.
5. Uma vez que todas as células têm levantado, pipetar cima e para baixo para quebrar aglomerados celulares. Transferir 100 uL em frascos de cintilação 7 ml. Adicionar 5 ml de gel de Insta-Plus (PerkinElmer) e mistura de vórtice. Armazenar placas restantes a 4 ° C.
6. Coloque frascos de cintilação em contador de cintilação. Configurar contador para contar para ^[3 H] emunidades DPM.

6. Analisando os resultados

1. A taxa de efluxo de colesterol é geralmente expressa como uma proporção de colesterol movido a partir de células para o aceitador. A fórmula seguinte é utilizado:

2. O efluxo específica é calculada como a diferença entre o efluxo na presença ou ausência do aceitador (branco).

7. Linha do tempo

8. Os resultados representativos

Um exemplo de um resultado de uma experiência de efluxo de colesterol é mostrado na fig. 1. Nesta experiência THP-1 monócitos humanos foram diferenciadas em macrófagos e de efluxo de colesterol para aceitadores diferentes foitestado. Efluxo de colesterol e médio sem receptores ("em branco") foi de 0,79% e este valor foi considerado como um efluxo não específico e foi subtraído de outros valores. Efluxo de colesterol para a saúde humana apoA-I (concentração final 30 ug / ml) foi de 4,75%. Uma amostra de plasma de referência foram incluídos nesta experiência para controlar inter-experimentais variabilidade. Uma amostra de referência pode ser utilizado para a normalização de dados através de um grande número de experiências, mas que encontramos prudente repetir o ensaio se a variabilidade é alta. Um plasma do paciente (concentração final de 2%) foi testada antes e depois de o paciente foi tratado com a medicação. Concluiu-se que neste medicação do paciente teve um impacto negativo sobre a capacidade do plasma para suportar o efluxo de colesterol.

Outro exemplo de um resultado da experiência de efluxo é mostrado na fig. 2. Neste experimento RAW 264.7 de macrófagos foram ativados ou não ativados por incubação durante a noite com LXR agonista TO-901317 (concentração final1 mmol / L) e de efluxo de colesterol para a mesma amostra de plasma humano (2%) foi testado. Concluiu-se que a activação da expressão celular de transportadores ABC com agonista LXR aumenta a capacidade das células para libertar o colesterol para o aceitador extracelular.

Figura 1. Efluxo de colesterol a partir de células THP-1 a receptores de vários. Percentagem de efluxo de colesterol (isto é, a proporção de colesterol marcado movido a partir de células para o aceitador especificado) é mostrada após subtracção dos valores em branco. Média ± DP de determinações quadruplicado, * p <0,05.

Figura 2. Efluxo de colesterol a partir de 264,7 Percentagem activado ou não activado com LXR agonista ao plasma humano. RAW de efluxo de colesterol (isto é, a proporção de colesterol marcado movido a partir de células àaceitador especificado) é mostrada após subtracção dos valores em branco. Média ± DP de determinações quadruplicado, * p <0,001.

Discussion

O método descrito para medir o efluxo de colesterol é concebido para medir o movimento do colesterol a partir de células de um aceitador de colesterol extracelular. Há várias considerações críticas na compreensão desta metodologia.

Rotulagem e de equilíbrio

Na metodologia descrita colesterol marcado é adicionado ao soro contendo soro. Embora nunca investigada em detalhe, presume-se que o colesterol é incorporado nas lipoproteínas do soro e são absorvidas pelas células. É importante para permitir tempo suficiente para lipoproteínas a tomar-se e para o colesterol para se deslocar de lipoproteínas às membranas celulares. Normalmente 24 h rotulagem é suficiente, mas rotulagem durante 48 h atinge maior actividade específica de colesterol intracelular. Tem de ser tido em conta que se ^[14 C] colesterol é utilizado em vez de ^[3 H] colesterol (por exemplo, em experiências de rotulagem duplas), o acto específicoivity do primeiro é muito baixa e adicionando colesterol suficiente rotulados para atingir destina actividade específica pode alterar o conteúdo celular de colesterol e assim influenciar o resultado. É também importante que (i) não há colesterol rotulada ou lipoproteínas não-especificamente aprisionados na superfície da célula como este colesterol será rapidamente incorporada por um aceitador de via não-específica de transferência, e (ii) o colesterol marcado é equilibrada entre intracelular vários piscinas. Embora na nossa experiência de incubação 24 h de equilíbrio em meio isento de soro é suficiente para alcançar estes objectivos, geralmente 48 h de incubação é usado. Muitos tipos de células não sobrevivem durante 48 h ou até mesmo 24 h em meio isento de soro. Neste caso 0,1% de BSA (essencialmente de ácidos gordos livres) podem actuar como substituto. Lipoproteína-empobrecido de soro ou vários soro de substituição-suplementos podem ser usados ​​como um último, mas é importante reconhecer que o soro deficiente em lipoproteínas faz e substituição de soro e de suplementos podem contain apolipoproteínas e que podem afetar o resultado. Infelizmente os fabricantes muitas vezes não revelam a composição dos suplementos.

Duração da incubação de efluxo

Efluxo de colesterol leva a carga de colesterol para um aceitador extracelular e depleção de colesterol nas células. Alterações no conteúdo de colesterol de ambas as células e aceitadores podem afectar a taxa e outras propriedades do efluxo do colesterol. Além disso, se o aceitador contém colesterol (por exemplo, HDL) pode mover-se a partir de aceitador para as células e se a actividade específica de colesterol no aceitador torna-se significativo, que vai complicar a interpretação dos resultados. Assim, é melhor manter a incubação de efluxo tão curto quanto possível, permitindo no entanto o tempo para uma quantidade suficiente de colesterol rotulados para mover a partir de células para o aceitador, para permitir uma detecção fiável. Geralmente 2-6 h é o tempo recomendado. Incubações mais longos do que 24 horas seria refletir um estado de equilibrium e, portanto, será indicativo da capacidade de aceitador para acumular o colesterol, em vez de a taxa de efluxo de colesterol.

Aceitante

Aceitadores diferentes são específicos para diferentes vias de efluxo de colesterol. Para a medição efluxo de colesterol específico, apoA-I é utilizada para reflectir ABCA1-dependente HDL, enquanto o efluxo ou HDL reconstituído para ABCG1 e SR-B1-dependentes vias. Ciclodextrina é frequentemente utilizado para avaliar não específica de efluxo. É importante incluir no experimento uma amostra "branco", que não contém aceitador em tudo, para medir a contribuição de não-específica dissociação de colesterol e colesterol liberado de desintegração das células mortas.

A concentração do aceitador

Efluxo de colesterol inclui (i) a libertação de colesterol por células e (ii) a sua absorção por um aceitador, ambas as etapas podem ser limitante da velocidade. Se o objetivo é investigar mudanças nocapacidade das células para libertar o colesterol (por exemplo, após a transfecção ou knock-down), então a concentração do aceitador não deve ser limitante da taxa. Para apoA-I e as concentrações de HDL 30-50 ug / ml são geralmente não limitante da velocidade. Se a capacidade do aceitador para suportar o efluxo de colesterol é o objectivo da investigação (por exemplo, capacidade de HDL isolado ou amostras de plasma de pacientes ou animais para suportar o efluxo de colesterol), então a concentração do aceitador deve ser limitante da velocidade. Para apoA-I e HDL isto é, normalmente 10 ug / ml, para amostras de plasma este é geralmente de 1-2%, mas de uma experiência de dose-dependência preliminar para encontrar uma concentração correcta é essencial para escolher a dose.

Ativação de células

Os principais elementos responsáveis ​​pelo efluxo do colesterol específico são dois transportadores ABC, ABCA1 e ABCG1. Ambos são regulados por LXR e pré-incubação de células com agonista LXR (composto mais popular é a TO-901317 disponível a partir de SigMA) utilizada em concentrações 1-4 mmol / L aumenta significativamente a proporção de efluxo de colesterol específico. Células de origem do rato, tais como 264,7 RAW ou J774, podem também ser activado por cAMP (0,3 mmol / L).

Carregamento de células com o colesterol

O carregamento de células com colesterol por pré-incubando-as com complexo acetilado ou LDL oxidada ou ciclodextrina-colesterol também estimula o efluxo de colesterol. Tem de ser mantido em mente que o carregamento de células, especialmente macrófagos com mudanças de colesterol muitos aspectos do seu metabolismo. Escolha do modelo (colesterol carregado contra o colesterol não carregado) depende objetivo científico do estudo.

A apresentação dos resultados

Normalmente, os resultados da experiência de efluxo de colesterol são apresentados como uma percentagem de colesterol libertado a partir de células: isto elimina a variabilidade a partir do número de células em poços individuais e na eficiência de marcação. No entanto th,é só é válido se o tratamento não afecta a absorção do colesterol e do efluxo na ausência do aceitador (branco). Estas duas condições precisam ser comprovada experimentalmente.

Teoricamente este método pode ser usado para estudar o efluxo de qualquer constituinte celular para um aceitador extracelular. Se, ao contrário de colesterol, tal composto é metabolizado, em seguida, uma etapa de purificação analítica necessita de ser incluída. Além disso, se o composto é sintetizado na célula, precursores sintéticos podem ser usados ​​para rotulagem. Por exemplo, ^[14 C] acetato e ^[3 H] água foram utilizados para estudar o efluxo de colesterol recém-sintetizado e ^[14 C] colato para estudar o efluxo de fosfolípidos. Neste caso o colesterol recém-sintetizado precisa ser separados a partir de precursores e intermediários, geralmente por meio de cromatografia de camada fina.