Cholesterol efflux Assay

Summary

De cholesterol test is ontworpen om de snelheid van cholesterol efflux uit gekweekte cellen en de capaciteit van plasma acceptoren cholesterol afgegeven door de cellen te accepteren kwantificeren. De test bestaat uit het etiketteren van cellen met cholesterol, evenwicht van cholesterol tussen de intracellulaire zwembaden en het vrijgeven van cholesterol aan een extracellulaire acceptor.

Abstract

Cholesterolgehalte van cellen moet binnen de zeer nauwe grenzen te veel ofte weinig cholesterol in een cel resulteert in ontwrichting van cellulaire membranen, apoptose en necrose ^1. Cellen kunnen de bron cholesterol uit intracellulaire synthese en uit plasma lipoproteïnen, beide bronnen voldoende zijn om volledig te voldoen aan cellen 'voor cholesterol. De processen van cholesterol synthese en opname wordt strak gereguleerd en tekortkomingen van cholesterol zijn zeldzaam ^2. Te veel cholesterol komt vaker voor probleem ^3. Met uitzondering van hepatocyten en enigszins bijnierschors, cellen niet kunnen cholesterol breken. Cellen hebben twee opties om hun cholesterol te verlagen: het cholesterol om te zetten in cholesterylesters, een optie met een beperkte capaciteit als overbelasting van cellen met cholesterylesters is ook giftig, en cholesterol efflux, een optie met potentieel onbeperkte capaciteit. Cholesterol efflux is een specIFIC proces dat wordt gereguleerd door een aantal intracellulaire vervoerders, zoals de ATP-bindende cassette transporter eiwitten A1 (ABCA1) en G1 (ABCG1) en scavenger receptor type B1. De natuurlijke acceptor van cholesterol in het plasma is high density lipoproteïne (HDL) en apolipoproteïne AI.

De cholesterol efflux test is ontworpen om de snelheid van cholesterol efflux uit gekweekte cellen te kwantificeren. Het meet het vermogen van cellen te handhaven cholesterol efflux en / of de capaciteit van plasma acceptoren cholesterol afgegeven door de cellen te accepteren. De test bestaat uit de volgende stappen. Stap 1: etiketteren van cellulaire cholesterol door het toevoegen van het label cholesterol aan serum-bevattend medium en incubatie met cellen voor 24-48 uur. Deze stap kan worden gecombineerd met het laden van cellen met cholesterol. Stap 2: incuberen van cellen in serum-vrij medium gelabelde cholesterol evenwicht tussen alle intracellulair cholesterol zwembaden. Deze fase kan worden gecombineerd met activering van cellulaire lolesterol transporteurs. Stap 3: incuberen van cellen met extracellulaire acceptor en kwantificering van beweging van gelabelde cholesterol uit cellen van de acceptor. Als cholesterolprecursors werden gebruikt om cholesterol nieuw gesynthetiseerde label, een vierde stap, zuivering van cholesterol, nodig zijn.

De test levert de volgende informatie: (i) hoe een bepaalde behandeling (een mutatie, een knock-down, een overexpressie of een behandeling) de capaciteit van de cel invloed op cholesterol efflux en (ii) hoe de capaciteit van de plasma-acceptoren te accepteren cholesterol wordt beïnvloed door een ziekte of een behandeling. Deze methode wordt vaak gebruikt in de context van cardiovasculair onderzoek, metabole en neurodegeneratieve aandoeningen, infectieziekten en reproductieve ziekten.

Protocol

1. Bereiding van ^{[3H]-cholesterol}

1. In de zuurkast, afzien van de benodigde hoeveelheid ^[3 H] cholesterol in een 1,5 ml microfugebuis (0,5 pCi (19 kBq) per putje is nodig voor een typische test).
2. Als ^[3 H]-cholesterol wordt gesuspendeerd in tolueen, droog het volledig naar beneden met N2 gas en resuspendeer met 100% ethanol tot een uiteindelijke concentratie van 1 uCi (37 kBq / ul. Vortex en meng goed.

2. Plating Cellen en etikettering Cellular Cholesterol

Dit protocol is getest met behulp van de volgende celtypes: de menselijke monocyten ^4,5, THP-1-menselijke monocyten-macrofagen ^6,7,8, RAW 264,7 murine macrofagen ^5,9,10,11, HeLa-cellen ^12, humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC), BHK-21 cellen ⁹ mens en de muis fibroblasten ^13,14 HepG2 menselijke levercarcinoom cellen ¹⁵ en in gewijzigde vorm van bloedplaatjes <sup> 16.

1. Resuspendeer cellen en tel ze. Plaat cellen in 12-well platen met de uiteindelijke dichtheid van 0.2x10 ⁶ cellen per well in 0,9 ml compleet medium. Cellen blijft groeien en 0.8x10 ⁶ cellen per putje bereiken de tijd van de uitstroomtijden experiment. Voor cellen die geen delen, zoals gedifferentieerde THP-1-cellen, moet de zaaien dichtheid 0.8x10 ⁶ cellen per well. Bij gebruik 6 - of 24-putjes, dubbel of helft van het aantal cellen per putje respectievelijk. Het aantal putjes voldoende voor viervoud bepalingen voor elke experimentele voorwaarden.
2. Als differentiatie van THP-1-cellen vereist toevoegen PMA (eindconcentratie 0,1 ug / ml) aan de media gedurende 48-72 uur.
3. Voeg een kleine hoeveelheid van media in de microfugebuis met de ^[3 H] cholesterol.
4. Was zijden van de buis met media voor toevoeging ^[3H] cholesterol in een afzonderlijke portie volledig media (100 ul / well).
<li> toevoegen medium met ^[3H] cholesterol in de putjes met cellen (eindvolume per putje 1 ml). Indien geen behandeling van cellen voordat kenmerken kunnen cellen worden uitgeplaat in ^[3H] cholesterol-bevattend medium.
5. Incubeer cellen gedurende 48 uur in celkweek incubator (37 ° C, _5% CO2).

3. Equilibreren Incubatie

1. Na 48 uur incubatie, controleer dan cellen onder de microscoop. Zorg ervoor dat ze gezond zijn en zijn op ongeveer 80% confluentie.
2. Verwijder de media die ^[3 H] cholesterol. Voorzichtig te wassen cellen met PBS. Herhaal 3 keer wassen.
3. Bereid serum-vrije media. Desgewenst activeren cellen door toevoeging LXR agonist (zoals 901317 TO bij 1-4 mmol / L) of cAMP (0,3 umol / l, voor cellen van de muis oorsprong) aan serumvrij-media.
4. Voeg 500 ul serum vrije media in elk putje.
5. Incubeer 18 uur in de celcultuur incubator (37 ° C, _5% CO2).

<p class = "jove_title"> 4. Cholesterol efflux Incubatie

1. Na 18 uur incubatie in serum-vrij medium, controleert cellen onder de microscoop. Zorg ervoor dat ze gezond zijn en de samenvloeiing (minimum 80% confluentie).
2. Bereid oplossing van cholesterol efflux acceptoren in serum-vrij medium. Voorbeelden van acceptoren zijn:
   Apolipoproteïne AI (apoA-I) (eindconcentratie 10 ug / ml)
   High density lipoproteïne (HDL) (eindconcentratie 20 pg / ml)
   Cyclodextrine (eindconcentratie 200 pg / ml)
   Plasma (eindconcentratie 1-2%)
3. Voorzichtig te wassen cellen met PBS.
4. Voeg 250 pi serum-vrij medium met acceptoren in elk putje.
5. Laat een set van de putten op de achtergrond efflux (uitstroom aan serum vrije media met NO acceptor) te bepalen
6. Incubeer cellen gedurende 2 uur in celkweek incubator (37 ° C, _5% CO2). Duur van de uitstroming incubatie kan variëren van 30 min tot 8 uur indien nodig.

5. Verwerking Samples

1. Na 2 uur incubatie check-cellen onder de microscoop.
2. Verzamel media in 1,5 ml microfugebuisje buizen. Spin bij 14.000 rpm voor 1-10 min bij kamertemperatuur om cellulaire vuil te verwijderen.
3. Breng 100 ul medium in 7 ml scintillatieflesje. Voeg 5 ml van Insta-gel Plus (PerkinElmer) en vortex mengsel. Opslaan overige monsters bij 4 ° C.
4. Plaats de platen in de vriezer voor 30 minuten. Voeg 500 ul dH ₂ O aan elke well. Controleer cellen onder microscoop dat alle cellen opgetild van de bodem van putjes. Als nog steeds aanhanger, ofwel laat platen met dH ₂ O bij 4 ° C 's nachts of schrapen putten.
5. Als alle cellen zijn gestart en pipetteer op en neer te breken cel klonten. Breng 100 pl in 7 ml scintillatieflesjes. Voeg 5 ml van Insta-gel Plus (PerkinElmer) en vortex mengsel. Bewaar de resterende platen bij 4 ° C.
6. Plaats scintillatieflesjes op scintillatieteller. Configureren teller te tellen voor ^[3 H] indpm eenheden.

6. Het analyseren van de resultaten

1. De snelheid van cholesterol efflux wordt meestal uitgedrukt als een percentage van cholesterol verplaatst van cellen naar de acceptor. De volgende formule wordt gebruikt:

2. De specifieke efflux wordt berekend als het verschil tussen de efflux in de aanwezigheid of afwezigheid van de acceptor (blanco).

7. Tijdlijn

8. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van een resultaat van een cholesterol efflux experiment wordt getoond in Fig. 1. In dit experiment THP-1 humane monocyten werden onderscheiden in macrofagen en cholesterol efflux verschillende acceptoren isgetest. Cholesterol efflux tot medium zonder acceptoren ("lege") was 0,79% en deze waarde werd als een niet-specifieke efflux en afgetrokken van andere waarden. Cholesterol efflux menselijke apoA-I (eindconcentratie 30 ug / ml) was 4,75%. Een verwijzing plasma monster werd opgenomen in dit experiment de inter-experimentele variabiliteit te controleren. Een referentiemonster kan worden gebruikt voor normalisering van de gegevens over een groot aantal experimenten, maar we vonden het verstandig om de test te herhalen als de variabiliteit hoog is. Een patiënt plasma (eindconcentratie 2%) werd getest voor en na de patiënt behandeld met medicijnen. De conclusie was dat bij deze patiënt medicatie een negatieve invloed op de capaciteit van het plasma om cholesterol efflux te ondersteunen had.

Een ander voorbeeld van een resultaat van de uitstroomtijden experiment wordt getoond in Fig. 2. In dit experiment RAW 264,7 macrofagen werden geactiveerd of niet geactiveerd door incubatie gedurende de nacht met de LXR agonist TO-901317 (eindconcentratie1 umol / l) en cholesterol efflux in dezelfde monster van humaan plasma (2%) werd getest. Geconcludeerd werd dat activering van cellulaire expressie van ABC transporters met LXR agonist het vermogen van cellen om cholesterol vrij te extracellulaire acceptor toeneemt.

Figuur 1. Cholesterol efflux van THP-1-cellen aan verschillende acceptors. Percentage cholesterol efflux (de verhouding van gelabelde cholesterol verplaatst van cellen aan de gespecificeerde acceptor) wordt na aftrek van lege waarden. Gemiddelde ± SD van bepalingen viervoud, * p <0,05.

Figuur 2. Cholesterol efflux van RAW 264,7 geactiveerd of niet geactiveerd met LXR agonist voor de menselijke plasma. Percentage van cholesterol efflux (dat wil zeggen het deel van de gelabelde cholesterol verplaatst van cellen aan degespecificeerd acceptor) is weergegeven na aftrek van lege waarden. Gemiddelde ± SD van viervoud bepalingen, * p <0,001.

Discussion

De beschreven methode om cholesterol efflux te meten is ontwikkeld om beweging van cholesterol te meten van de cellen een extracellulaire cholesterol acceptor. Er zijn verschillende kritische beschouwingen bij het begrijpen van deze methodologie.

Etikettering en evenwicht

In de beschreven methode gemerkte cholesterol wordt toegevoegd serum bevattend serum. Hoewel niet in detail onderzocht, wordt aangenomen dat cholesterol wordt opgenomen in serum lipoproteïnen en worden door cellen. Het is belangrijk om voldoende tijd lipoproteïnen te nemen en voor cholesterol van lipoproteïnen naar celmembranen. Meestal 24 uur etikettering is voldoende, maar de etikettering gedurende 48 uur bereikt hogere specifieke activiteit van intracellulair cholesterol. Het moet rekening worden gehouden dat, als ^[14 C]-cholesterol wordt gebruikt in plaats van ^[3 H]-cholesterol (bijvoorbeeld in dubbele etikettering experimenten), de specifieke handelingivity van het eerste is erg laag en het toevoegen van voldoende gelabeld cholesterol is aan het beoogde specifieke activiteit te verwezenlijken kunnen veranderen cel cholesterolgehalte en dus van invloed op de uitkomst. Het is ook belangrijk dat (i) geen cholesterol gelabeld of niet-specifiek lipoproteïnen gevangen op het celoppervlak dit cholesterol snel worden opgenomen door een acceptor via niet-specifieke overdracht en (ii) gelabelde cholesterol geëquilibreerd tussen verschillende intracellulaire zwembaden. Hoewel in onze ervaring 24 uur incubatie equilibratie in serum-vrij medium voldoende is om deze doelen te bereiken wordt gewoonlijk 48 uur incubatie gebruikt. Veel celtypen niet overleven 48 uur of 24 uur in serum-vrij medium. In dit geval 0,1% BSA (hoofdzaak vrij vetzuur) kan als alternatief. Lipoproteïne-uitgeput serum of verschillende serum-vervanging van supplementen kan worden gebruikt als een laatste redmiddel, maar het is belangrijk te erkennen dat lipoproteïne-deficiënt serum doet en serum-vervanging toeslagen van contain apolipoproteïnen en dat kan het resultaat beïnvloeden. Helaas fabrikanten vaak geen informatie over de samenstelling van de supplementen.

Duur van de efflux incubatie

Cholesterol efflux leidt tot het laden van cholesterol tot een extracellulair acceptor en uitputting van de cholesterol in de cellen. Veranderingen in de cholesterol gehalte van zowel cellen als acceptor invloed kunnen zijn op de snelheid en andere eigenschappen van cholesterol efflux. Bovendien, als acceptor cholesterol bevat (bijvoorbeeld HDL) kan verplaatsen van acceptor van cellen en als specifieke activiteit van cholesterol in de acceptor significant wordt, dat de interpretatie van de resultaten bemoeilijken. Zo is het best efflux incubatie zo kort mogelijk, waardoor echter tijd voldoende hoeveelheid gemerkte cholesterol om van cellen naar de acceptor op een betrouwbare detectie mogelijk te maken. Over het algemeen 2-6 h is de aanbevolen tijd. Incubaties langer dan 24 uur zou wijzen op een staat van equilibrium en zal daarom een ​​indicatie van de capaciteit van de acceptor om cholesterol te verzamelen in plaats van de snelheid van cholesterol efflux.

Acceptant

Verschillende acceptoren zijn specifiek voor verschillende wegen van cholesterol efflux. Voor het meten van specifieke cholesterol efflux, apoA-I wordt gebruikt om ABCA1-afhankelijk efflux terwijl HDL of gereconstitueerd HDL voor ABCG1 en SR-B1-afhankelijke routes weer te geven. Cyclodextrine wordt vaak gebruikt om niet-specifieke efflux te beoordelen. Het is belangrijk in het experiment een "blanco" monster dat geen acceptor bevat, anders de bijdrage van niet-specifieke dissociatie van cholesterol en cholesterol vrijgegeven desintegreren dode cellen gemeten.

Concentratie van de acceptor

Cholesterol efflux omvat (i) afgifte van cholesterol in cellen en (ii) de opname van een acceptor, kunnen beide maatregelen worden snelheidsbeperkende. Als de experimentele doel te onderzoeken veranderingen in devan cellen op cholesterol vrij (bv. na transfectie of X-down) en de concentratie van de acceptor mag niet snelheidsbeperkende. Voor apoA-I en HDL de concentraties van 30-50 ug / ml zijn meestal niet snelheidsbeperkende. Als de capaciteit van de acceptant om cholesterol efflux te ondersteunen is het doel van onderzoek (bijv. een geïsoleerde HDL-of plasma-monsters van patiënten of van dieren om cholesterol efflux te ondersteunen), dan is de concentratie van de acceptor zou moeten zijn snelheidsbeperkende. Voor apoA-I HDL dit meestal 10 pg / ml voor plasmamonsters dit meestal 1-2%, maar een eerste dosis afhankelijkheid experiment een juiste concentratie vinden essentieel is voor de dosering te selecteren.

Activering van cellen

De belangrijkste elementen die verantwoordelijk zijn voor specifieke cholesterol efflux zijn twee ABC-transporters, ABCA1 en ABCG1. Beide worden gereguleerd door LXR en pre-incubatie van cellen met LXR agonist (meest populaire verbinding is TO-901317 die beschikbaar zijn vanaf Sigma) gebruikt in concentraties 1-4 mol / L verhoogt het percentage specifieke cholesterol efflux. Cellen van muizenafkomst zijn, zoals RAW 264,7 J774 of kan ook worden geactiveerd door cAMP (0,3 mmol / L).

Het laden van de cellen met cholesterol

Het laden van de cellen met cholesterol door pre-incubatie ze met geacetyleerd of geoxideerd LDL-cholesterol of cyclodextrine complex stimuleert ook cholesterol efflux. Het moet in gedachten worden gehouden dat het laden van cellen, vooral macrofagen met cholesterol veranderingen vele aspecten van hun metabolisme. Keuze van het model (cholesterol geladen versus niet cholesterol geladen) is afhankelijk van wetenschappelijk doel van het onderzoek.

Presentatie van de resultaten

Gewoonlijk de resultaten van cholesterol efflux experiment zijn weergegeven als een percentage van cholesterol afgegeven door de cellen: elimineert variabiliteit van het aantal cellen in afzonderlijke putjes en de efficiëntie van labeling. Echter, thwordt is alleen geldig als de behandeling had geen invloed op cholesterol opname en de uitstroom in de afwezigheid van de acceptor (blanco). Deze twee voorwaarden moeten experimenteel bewezen.

Theoretisch methode kan worden gebruikt om efflux van cellulaire constituency bestuderen een extracellulair acceptor. Als, in tegenstelling cholesterol, dergelijke verbinding wordt omgezet, wordt een analytische zuivering moet worden opgenomen. Verder, als de verbinding gesynthetiseerd in de cel, kunnen synthetische uitgangsstoffen worden gebruikt voor het labelen. Bijvoorbeeld, ^[14C] acetaat en ^[3H] water werden gebruikt om de uitstroomtijden van nieuw gesynthetiseerde cholesterol bestuderen en ^[14C] cholaat voor het bestuderen van de uitstroom van fosfolipiden. In dit geval nieuw gesynthetiseerde cholesterol moet worden gescheiden van precursoren en tussenproducten, gewoonlijk door dunnelaagchromatografie.