Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kolesterol akışı Testi

Published: March 6, 2012 doi: 10.3791/3810
Automatic Translation
1, 1, 1
1Baker IDI Heart and Diabetes Institute

Summary

Kolesterol tahlilini kültürü hücrelerinden kolesterol akışı hızı ve hücreler serbest kolesterol kabul plazma alıcısının kapasitesi ölçmek için tasarlanmıştır. Tahlil içi havuzu ve ekstrasellüler alıcı için kolesterol serbest bırakılması arasında kolesterol kolesterol, denge ile hücrelerin etiketlenmesi oluşur.

Abstract

Hücrelerin kolesterol içeriği hücre zarının bozulması, apoptoz ve nekroz 1 bir hücreye sonuçları çok fazla veya çok az kolesterol, çok dar sınırlar içinde tutulmalıdır. Hücreler hücre içi sentezi ve plazma lipoprotein kaynak kolesterol, hem de kaynakları tamamen kolesterol için hücrelerin ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli olabilir. Kolesterol sentezi ve alım süreçleri sıkı regüle ve kolesterol eksikliği azdır 2 olarak uygulanır. Aşırı kolesterol daha yaygın sorun 3'tür. Hepatositlerin dışında ve bir dereceye adrenokortikal hücrelere, hücreler kolesterol düşmesine edemiyoruz. Hücreler kendi kolesterol miktarını azaltmak için iki seçeneğiniz var: aynı zamanda toksik kolesterol esterleri ile hücrelerin aşırı olarak kolesterol esterleri, sınırlı kapasiteli bir seçenek haline dönüştürmek kolesterol ve kolesterol akışı, potansiyel olarak sınırsız kapasiteye sahip bir seçenek. Kolesterol akışı bir specBöyle ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı proteinler A1 (ABCA1) ve G1 (ABCG1) ve çöpçü reseptör tip B1 gibi hücre içi nakliyeciler, bir dizi ile düzenlenmiştir IFIC süreci. Plazma kolesterol doğal alıcı yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) ve apolipoprotein AI olduğunu.

Kolesterol akışı assay kültürü hücrelerinden kolesterol akışı oranı ölçmek için tasarlanmıştır. Bu kolesterol akışı ve / veya hücre serbest kolesterol kabul plazma alıcıları kapasitesini korumak için hücre kapasitesi ölçer. Deneyi aşağıdaki adımlardan oluşur. Adım 1: serum içeren orta etiketli kolesterol ekleme ve 24-48 saat hücreleri ile kuluçkaya hücresel kolesterol etiketleme. Bu adımda kolesterol hücrelerinin yüklenmesi ile kombine edilebilir. Adım 2: bütün hücre içi kolesterol havuzlarına etiketli kolesterol dengelenmeye serum içermeyen aracı madde içinde hücrelerinin inkübasyon. Bu aşamada hücresel kanal aktivasyonu ile kombine edilebilirolesterol taşımacıları. Adım 3: ekstraselüler alıcı ve hücreler arası alıcı için etiketli kolesterol hareketinin kantitatif sahip hücrelerin inkübasyon. Kolesterol öncüleri yeni sentezlenen kolesterol etiketlemek için kullanılması durumunda, bir dördüncü aşama, kolesterol saflaştırma, gerekli olabilir.

Deneyi aşağıdaki bilgi sağlar: (i) belirli bir işlem (a mutasyonu, bir itici, aşağı, bir aşırı ekspresyonu ya da tedavi) efflux kolesterol hücre kapasitesi etkiler ve (ii) nasıl plazma alıcısının kapasitesi kolesterol kabul nasıl Bir hastalık veya bir tedavi tarafından etkilenir. Bu yöntem, çoğu zaman kardiyovasküler araştırmalar, metabolik ve nörodejeneratif hastalıklar, bulaşıcı hastalıklar ve üreme bağlamında kullanılır.

Protocol

1. [3H]-kolesterol hazırlanması

  1. Çeker ocak içinde bir 1.5 ml mikrofuj tüp (0,5 oyuk başına μCi (19 kBq) Tipik bir deney için gerekli olan) içine [3 H] kolesterol gerekli miktarda dağıtın.
  2. [3H]-Kolesterol tolüen içinde süspansiyon haline getirildiği takdirde, 1 μCi bir son konsantrasyon% 100 etanol ile N2 gaz ve Pastör pipetiyle (de 37 kBq / ul. Vorteks ve karışım ile tamamen aşağı kurutun.

2. Kaplama Hücreler ve Etiketleme Hücresel kolesterol

Insan monosit 4,5, THP-1 insan monosit-makrofajlar 6,7,8, RAW 264.7 murin makrofajlar 5,9,10,11, HeLa hücrelerinde 12, endotel insan umbilikal ven: Bu protokol, aşağıdaki hücre tipleri kullanılarak test edilmiştir trombositler hücreleri (HUVEC), BHK-21 hücreleri 9, insan ve fare fibroblastlar 13,14, HepG2 hücrelerinde insan hepatokarsinoma 15 ve modifiye formunda, <> 16 sup.

  1. Hücreleri yeniden süspanse edin ve onları saymak. 0.9 ml tam medyum içinde oyuk başına 6 0.2x10 hücre nihai yoğunlukta 12 oyuklu plakalar haline plakası hücreleri. Hücreler büyümeye devam edecek ve efflux deney zaman iyi başına 0.8x10 6 hücre ulaşacak. Gibi farklılaştırılmış THP-1 hücreleri gibi bölmek değil hücreler için, ekim yoğunluğu başına iyi 0.8x10 6 hücre olmalıdır. Sırasıyla veya 24 de plaka, çift ya da başına hücre sayısının yarısından - 6 kullanıyorsanız. Kuyu sayısı her deneysel koşul için dört nüsha tayini için yeterli olmalıdır.
  2. THP-1 hücrelerinin farklılaşmasını gerekli ise, 48-72 saat boyunca ortam PMA (nihai konsantrasyon 0.1 ug / ml) ilave edilir.
  3. [3H] kolesterol içeren mikrofüj tüpe ortam küçük bir alikotu ekleyin.
  4. Tam kültür ortamı ayrı bir alikotu (100 ul / kuyucuk) içine [3H] kolesterol eklemeden önce ortamı ile iki tüpün yıkanır.
    5. <li> hücreleri (çukur başına son hacim 1 ml) ile kuyucuklara [3 H] kolesterol içeren ortam ekleyin. Hücrelerinde hiçbir tedavi etiketlenmesi önce gerekli ise, hücreler [3 H] kolesterol içeren orta kaplama olabilir.
  5. (37 ° C'de,% 5 CO2) hücre kültürü inkübatöre 48 saat boyunca inkübe hücreleri.

3. Denge Kuluçka

  1. 48 saat inkübasyondan sonra, mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Sağlıklı oldukları ve yaklaşık% 80 izdiham olduğundan emin olun.
  2. Ortam [3 H] kolesterol içeren çıkarın. PBS ile hafifçe hücreleri yıkayın. 3 yıkama kez tekrarlayın.
  3. Serumsuz ortam hazırlayın. Serum serbest-medya; Gerekirse, LXR agonist (örneğin 1-4 mMol / L 'TO-901317 gibi) veya cAMP (sadece fare kökenli hücreler için 0.3 mmol / L) ekleyerek hücrelerini aktive eder.
  4. Her kuyuya 500 mikrolitre serum serbest Medya ekle.
  5. (37 ° C'de,% 5 CO2) hücre kültürü inkübatöre 18 saat boyunca inkübe edilir.
<p class = "jove_title"> 4. Kolesterol akışı Kuluçka

  1. Serum içermeyen aracı madde içinde 18 saatlik inkübasyondan sonra, mikroskop altında hücreleri kontrol. (En az% 80 konfluense) sağlıklı ve birleşik olduğundan emin olun.
  2. Serum içermeyen aracı madde içinde kolesterol akışı alıcısının çözeltisi hazırlayın. Muhatapları örnekler:
    Apolipoprotein AI (apoA-I) (son konsantrasyonu 10 mg / ml)
    Yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) (son konsantrasyonu 20 mg / ml)
    Siklodekstrin (nihai konsantrasyon 200 ug / ml)
    Plazma (son konsantrasyon% 1-2)
  3. PBS ile hafifçe hücreleri yıkayın.
  4. Her bir kuyuya muhatapları ile serumsuz medya 250 ul ekleyin.
  5. Arka plan efflux (NO alıcı ile serum serbest medya efflux) belirlemek için kuyu bir takım bırakın
  6. Hücre kültürü inkübatörde 2 saat boyunca hücreleri (37 ° C'de,% 5 CO2) inkübe. Gerekirse efflux inkübasyon süresi 30 dakika ile 8 saat değişebilir.

5.. İşleme Samples

  1. 2 saat sonra kuluçka mikroskop altında hücrelerin kontrol edin.
  2. 1.5 ml mikrofuge'de tüpler içine medya toplayın. Hücresel enkaz kaldırmak için oda sıcaklığında 1-10 dakika 14.000 rpm'de Spin.
  3. 7 ml sintilasyon şişeye 100 ul medya aktarın. 5 Insta-jel Plus mls (Perkin Elmer) ve vorteks karışımı ekleyin. 4 ° C'de geri kalan örnekleri depolamak
  4. 30 dakika için dondurucuya plakaları yerleştirin. Her kuyucuğa 500 ul dH 2 O ekleyin. Tüm hücreleri kuyu dibinden kaldırdı emin olmak için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hala yapışık ise, 4 ° C de bir gece veya sıyrık kuyularında dH 2 O ile plakalar bırakın ya.
  5. Tüm hücreler kaldırdı sonra, hücre kümeleri kırmak için aşağı ve yukarı Pipeti. 7 ml sintilasyon vial içine 100 ul aktarın. 5 Insta-jel Plus mls (Perkin Elmer) ve vorteks karışımı ekleyin. 4 ° C'de geri kalan plakaları depolamak
  6. Sintilasyon sayacı sintilasyon şişelerine yerleştirin. [3 H] için saymak için sayaç yapılandırındpm birimleri.

6. Sonuçları analiz

  1. Kolesterol akışı oranı, genellikle kolesterol bir oranda hücrelerinden alıcı taşınır olarak ifade edilir. Aşağıdaki formül kullanılır:

Denklem 1

  1. Belirli bir akış alıcı (boşluk) varlığında veya yokluğunda, akış arasındaki fark olarak hesaplanır.

Denklem 2

7. Timeline

Şekil 1

8. Temsilcisi Sonuçlar

Bir kolesterol akışı deneyde bir sonucu bir örneği, Şek. 1. Bu deneyde THP-1 insan monosit oldu farklı kabul eden makrofaj ve kolesterol akışı içine ayırtlanmıştırtest edilmiştir. Hiçbir alıcıları ("boş") ile orta kolesterol akışı% 0.79 idi ve bu değer bir non-spesifik akış olarak kabul edilmiş ve diğer değerleri çıkarıldı. İnsan ApoA-I (nihai konsantrasyon 30 ug / ml) ile kolesterol akışı% 4.75 olmuştur. Bir başvuru plazma örneği arası deneysel değişkenlik izlemek için, bu deney dahil edildi. Bir referans örnek deney boyunca çok sayıda veri normalizasyon için kullanılır, ama değişkenliği yüksek olup olmadığını test tekrar bu ihtiyatlı bulunabilir. Hastanın ilacı ile muamele edilmiş, önce ve sonra bir hasta plazma (son konsantrasyon% 2) test edilmiştir. Bu hastada ilaç kolesterol akışı desteklemek için plazma kapasitesi üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğu sonucuna varılmıştır.

Efflux deneyde bir sonucu başka bir örneği şekil gösterilmektedir. 2. Bu deneyde RAW 264.7 makrofaj LXR agonisti TO-901.317 ile birlikte bir gece inkübasyon (son konsantrasyon ile aktive veya devreye alınmadı1 mmol / L) ve insan plazma aynı örnek (% 2) kolesterol akışı test edildi. Bu LXR agonisti ile ABC taşıyıcıları hücresel ifade aktivasyon ekstrasellüler alıcı için kolesterol serbest hücrelerinin kapasitesini artırır sonucuna varılmıştır.

Şekil 1
Şekil 1.. Çeşitli alıcıları için THP-1 hücrelerinden kolesterol akışı. Kolesterol akışı yüzdesi (yani etiketli kolesterol oranı hücrelerinden belirtilen alıcı taşındı) boş değerler çıkarma sonra gösterilmiştir. Ortalama ± dörderli tayin SD, * p <0.05.

Şekil 2
Şekil 2. Kolesterol akışı RAW 264.7 insan plazma LXR agonisti ile aktif ya da aktif değil. Yüzde (yani etiketli kolesterol oranı ile kolesterol akışı hücrelerden taşındıbelirtilen alıcı) boş değerler çıkarma sonra gösterilmiştir. Ortalama ± dörderli tayin SD, * p <0.001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kolesterol akışı ölçmek için açıklanan yönteme hücreleri bir hücre dışı kolesterol alıcı için kolesterol hareketinin ölçülmesi için tasarlanmıştır. Bu metodoloji anlamada çok önemli hususlar vardır.

Etiketleme ve alışım

Tarif metodolojide etiketli kolesterol serumu içeren serum ilave edilir. Ayrıntılı olarak incelenmiştir asla rağmen, kolesterol serum lipoprotein içine dahil edilmiştir ve hücreleri tarafından alınmasını kabul edilir. Bu lipoproteinler için yeterli zaman kadar alınacak izin ve kolesterol için hücre zarlarına lipoproteinler taşımak için önemlidir. Genellikle 24 saat etiketleme yeterli olan, fakat 48 saat süre ile etiketlenmesi intraselüler kolesterolü yüksek özgül aktivite sağlar. Bu dikkate alınması gerektiğini [14 C] kolesterol, (çift etiketleme deneyler örneğin) [3 H] kolesterol yerine kullanılan özel hareket halindeeski ivity çok düşük ve amaçlanan spesifik aktivite ulaşmak için yeterli etiketli kolesterol ekleyerek olan hücre kolesterol içeriği değiştirebilir ve böylece sonuçları etkileyebilir. Bu, herhangi bir etiketli kolesterol veya bu kolesterol hızla spesifik olmayan transfer yoluyla bir alıcı tarafından dahil edilecektir gibi non-spesifik hücre yüzeyi üzerinde sıkışmış bulunmaktadır lipoproteinlerin (i) da önemlidir; ve (ii) etiketli kolesterol, çeşitli hücre içi arasındaki dengelenmiş olan havuzları. Bizim deneyim serumsuz ortamda 24 saat alışım inkübasyon bu hedeflere ulaşmak için yeterli olsa da, genellikle 48 saat inkübasyon kullanılır. Birçok hücre tipleri bile 48 saat veya serumsuz ortamda 24 saat boyunca hayatta kalmak istemiyorum. Bu durumda% 0.1 BSA (esas olarak yağ-asitsiz) yedek olarak hareket edebilir. Serum veya çeşitli serum yerine takviyeleri son çare olarak kullanılabilir lipoprotein-tüketilmiş, ama o lipoprotein eksikliği serum yapar ve serum-yedek takviyeleri tanımak önemlidir c olabilirapolipoprotein ontain ve sonucu etkileyebilir. Ne yazık ki üreticileri genellikle takviyeleri kompozisyonu ifşa etmiyoruz.

Efflux kuluçka süresi

Kolesterol akışı hücrelere bir hücre dışı alıcı ve kolesterolün azalması için kolesterol yükleme yol açar. Hücreleri ve alıcı hem kolesterol içeriği değişiklikler kolesterol akışı oranı ve diğer özelliklerini etkiler. Dahası alıcı kolesterol içeriyorsa, (örneğin, HDL) bu hücreler için alıcı doğru hareket edebilir ve alıcı kolesterol spesifik aktivite belirgin hale gelmesi durumunda, bu sonuçlar yorumlanması karmaşık hale getirecektir. Böylece, güvenilir bir algılama etkinleştirmek için hücrelerden alıcı geçmek için etiketli kolesterol yeterli miktarda ancak zaman kalması mümkün olduğunca kısa efflux inkübasyon tutmak en iyisidir. Genelde 2-6 saat önerilen zamandır. 24 saat daha uzun inkubasyon equili bir devlet yansıtacakbrium ve bu nedenle çok kolesterol akışı oranı daha kolesterol birikmesine alıcı kapasitesini işaret olacaktır.

Alıcı

Farklı alıcıları kolesterol akışı farklı yollar için özeldir. Belirli kolesterol akışı ölçmek için, apoA-I ABCA1 bağımlı akış esnasında HDL veya ABCG1 ve SR-B1-bağımlı yolların sulandırılmış HDL yansıtmak için kullanılır. Siklodekstrin genellikle spesifik olmayan akış değerlendirmek için kullanılmıştır. Ölü hücreleri parçalanıyor salınan kolesterol ve kolesterol non-spesifik ayrışma katkısını ölçmek için hiç alıcı içeren deney "boş" bir örnek, dahil etmek önemlidir.

Alıcı konsantrasyonu

Kolesterol akışı (i) hücreleri tarafından kolesterol serbest bırakılması ve bir alıcı ile (ii) uptake içermektedir, her iki adım oran-sınırlayıcı olabilir. Deneysel amaç değişiklikleri araştırmak için ise(örn. transfeksiyon ya zincirleme aşağı sonra) serbest kolesterol hücrelerinin kapasitesi, daha sonra alıcı konsantrasyonunun kuru sınırlama olmamalıdır. ApoA-I ve HDL 30-50 mcg / ml konsantrasyonları genellikle non için hız sınırlama. Kolesterol akışı desteklemek için alıcı ile kapasitesi soruşturma hedefi (kolesterol akışı desteklemek için hastalara veya hayvanlara gelen izole HDL veya plazma numuneleri, örneğin kapasitesi) ise, o zaman alıcı konsantrasyonu oran-sınırlayıcı olması gerekir. Için apoA-I ve HDL bu genellikle 10 mg / ml, plazma numuneleri için bu genellikle% 1-2, ancak doğru bir konsantrasyon bulmak için bir ön doza bağımlı deney dozu seçmek önemlidir edilir.

Hücrelerinin aktivasyonu

Belirli kolesterol akışı sorumlu kilit unsurları iki ABC taşıyıcıları, ABCA1 ve ABCG1 vardır. Hem LXR ve LXR agonisti ile hücrelerin ön inkübasyon tarafından düzenlenir (en popüler bileşik Sig gelen TO-901.317 mevcutturkonsantrasyonları 1-4 kullanılan ma) mol / L önemli ölçüde spesifik kolesterol akışı oranı arttırır. , RAW 264.7 veya J774 gibi fare kökenli hücreler, aynı zamanda cAMP (0.3 mmol / L) aktif hale getirilebilir.

Kolesterol olan hücrelerin yüklenmesi

Onları asetillenmiş veya okside LDL-kolesterol veya siklodekstrin kompleksi ile önceden kuluçkaya kolesterol hücre yükleme de kolesterol akışı uyarır. Bu kolesterol değişiklikler metabolizması birçok yönleri ile özellikle hücreler, makrofajlar yükleme akılda tutulması gerekir. Model seçimi (kolesterol karşı kolesterol değil yüklenen yüklü) çalışmanın bilimsel hedefe bağlıdır.

Sonuçlar Sunumu

Genellikle kolesterol akışı deney sonuçları hücrelerinden salınan kolesterol yüzdesi olarak sunulmaktadır: Bu bireysel kuyularda ve etiketleme verim hücre sayısı kadar değişkenlik ortadan kaldırır. Bununla birlikte, thTedavi alıcı (boş) yokluğunda kolesterol alımı ve efflux etkilemedi yalnızca geçerlidir. Bu iki koşul deneysel olarak kanıtlanmış olması gerekir.

Teorik olarak, bu yöntem, bir hücre dışı alıcı için herhangi bir hücresel seçmenlerinin efflux incelemek için kullanılabilir. Kolesterol farklı olarak, bu bileşik, metabolize olur, eğer, daha sonra bir analitik saflaştırma adım dahil edilmesi gerekmektedir. Bileşik hücrede ise, daha fazla sentez edilir, sentetik öncüleri etiketlenmesi için kullanılabilir. Örneğin, [14 C] asetat ve [3 H] su yeni sentezlenen kolesterol efflux incelemek için kullanılabilir ve [14 C] fosfolipidlerin efflux çalışmak için kolat. Bu durumda, yeni sentezlenen kolesterol genelde ince tabaka kromatografi ile, öncüleri ve ara ürün olarak ayrılması gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bu çalışma ile ilgili hiçbir çatışan çıkarları beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma Victoria Hükümeti'nin OIS Programı tarafından Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (526.615 ve 545.906) gelen ve kısmen hibe ile desteklenmiştir. DS NHMRC bir üyesidir.

References

  1. Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
  2. Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
  3. Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
  4. Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
  5. Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
  6. Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  7. Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
  8. Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
  9. D'Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
  10. Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
  11. Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
  12. Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).
  13. Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
  14. Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
  15. Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
  16. Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).

Tags

Tıp Sayı 61 lipidler lipoproteinler ateroskleroz kaçakçılık kolesterol
Kolesterol akışı Testi
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Low, H., Hoang, A., Sviridov, D.… More

Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. J. Vis. Exp. (61), e3810, doi:10.3791/3810 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter