Summary
我们开发了一个新的协议，以提高效率，在体外分化成运动神经元的小鼠胚胎干细胞。分化的胚胎干细胞获得运动神经元功能的神经元和运动神经元采用免疫组化技术标记表达证明。
Abstract
功能运动神经元分化成胚胎干细胞（ES细胞）的直接代表一个有前途的资源，研究疾病机理，筛选新的药物化合物，并制定，如脊肌萎缩症（SMA）和肌萎缩性侧索硬化症的运动神经元疾病的新疗法（ ALS）的。目前许多协议使用维甲酸（RA）和刺猬（SHH）的组合分化成运动神经元1-4小鼠胚胎干细胞（MES）。然而，mES细胞分化成运动神经元的效率只达到中等成功。我们已经开发了一个两步分化协议5，显着提高目前建立的协议相比，分化效率。第一步是Noggin与成纤维细胞生长因子（FGFs）的加入，以加强neuralization过程。 Noggin与骨形态发生蛋白（BMP）受体拮抗剂和被牵连在神经诱导1ccording神经发生和结果形成前神经图案6默认模型。 FGF信号协同诱导神经组织的形成，促进后神经身份7-9 Noggin的行为。在这一步，mES细胞被引两天，以促进对神经谱系分化与Noggin的，碱性成纤维细胞生长因子，FGF-8。第二步是诱发运动神经元的规范。 Noggin与/ FGFs暴露mES细胞培养与RA和Shh的激动剂，理顺激动剂（凹陷），再过5天，以促进运动神经元生成。为了监测乱七八糟的分化成运动神经元，我们使用胚胎干细胞系，从转基因小鼠表达EGFP派生控制下运动神经元特异性启动子HB9 1。使用这个强大的协议，我们实现了51±0.8％的分化效率（N = 3，P <0.01，学生t-检验）5。从免疫的结果染色表明，绿色荧光蛋白+细胞表达运动神经元的特异性标志物，胰岛-1和胆碱乙酰转移酶（CHAT）。我们两步分化协议mES细胞分化成脊髓运动神经元提供了一条有效途径。
Protocol
1。步骤1：小鼠胚胎干细胞（MES）文化（定时：3天）
1。电镀主小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）
- 大衣4个100毫米组织培养皿中，用明胶PMEF粘附。加入8毫升0.1％的明胶溶液（干细胞），每道菜，并在室温下30分钟的孵育。
- 去除多余的明胶从菜肴。不要冲洗碗碟。
- 稀包含约一小瓶丝裂霉素C灭活PMEF（Millipore公司）。 5×10 6细胞（配方见表1），到PMEF媒体40毫升到4个100毫米组织培养皿板。 PMEF提供一个mES细胞的饲养层。
- PMEF应镀加入MES细胞培养前至少一天。 PMEF可使用1周后镀。
2。电镀MES细胞
监察MES细胞分化成运动神经元的效率，我们使用HBG3，下控制运动神经元特异性启动子HB9表达EGFP转基因小鼠的胚胎干细胞系。
- 除霜1小瓶的HBG3 mES细胞在37℃水浴中（约1×10 7，由道格拉斯·克尔博士，美国约翰霍普金斯大学提供）。加入5毫升和15毫升管ES介质（配方见表1）降速为5分钟800转的细胞。
- 吸出上清液，重悬MES细胞的ES媒体20毫升新鲜新增的白血病抑制因子（LIF），在终浓度为10毫微克/毫升。注：应添加LIF的一天的使用，并须保持在未分化状态的细胞MES。
- 从每道菜的PMEF 10的毫升PMEF媒体和添加10毫升的HBG3胚胎干细胞悬液，每道菜。
- 24小时后，电镀，MES细胞形成小菌落，大小类似箭头表示在图1B殖民地。 72小时后，电镀，coloniES尺寸的增加，许多直径约100微米（ 图1B，用箭头表示）。这些细胞分化的准备。媒体应每天更换，以维持细胞的增殖。
2。第2步：神经诱导（定时：2天）
诱导分化成运动神经元的MES细胞，mES细胞需要分开从PMEF和悬挂的环境中培养。明胶涂层烧瓶用于分离mES细胞PMEF。
- 当MES殖民地准备神经诱导（分化第0天），涂0.1％明胶（18毫升/瓶），在室温为30分钟2 T150烧瓶，然后去除多余的明胶和用1X PBS三倍。注：每100毫米的菜文化需要一个T150-明胶涂层烧瓶分离PMEF。
- 小心取出，通过抽吸的介质，确保不打跑松散的连接菌落。添加10毫升PBS简要LY然后愿望删除完成清洗步骤。
- 分开从PMEF的MES细胞，加入0.25％胰蛋白酶/ EDTA（3毫升/碟，干细胞技术），并在37°C孵育3-5分钟，直到干细胞和PMEF脱离板。无LIF和吸管细胞加入15毫升新鲜的ES媒体向上和向下突破殖民地（约15-20倍）。然后，添加0.1％的明胶涂层T150烧瓶，孵育30分钟，在37°C。孵化后，PMEF应重视糊化表面，而胚胎干细胞应漂浮。收集到50毫升管浮动mES细胞。
- 降速在10毫升的神经分化培养基（配方见表1），在800 rpm和重悬细胞。
- 使用到100毫米的细菌或暂停培养皿1血细胞计数板约2×10 6 mES细胞的细胞计数。这些板块允许悬浮培养的生长，促进形成胚状体（EBS）。
- 上分化TION第1天，MES细胞形成的小浮动总量（EBS），光学显微镜下可见。任何结转PMEF附加菜。悬浮细胞和媒体转移到了15毫升管和低速离心3分钟（500转）。仔细吸干媒体，添加10毫升新鲜的神经分化培养基颗粒胚，然后板细胞中一种新的细菌菜。在除了补益媒体，这一步删除任何PMEF，从之前的步骤进行。
- 分化第2天，EBS是随时可以诱导成运动神经元。
3。第三步：运动神经元规格（定时：5天）
- 在分化第2天，漩涡培养皿和15毫升管转移到媒体和EBS。让胚比重（约10分钟），或在低速离心3分钟（500转）定居。
- 在10毫升（国防部）中型运动神经元分化的培养基认真吸重悬胚（见配方
- 在分化第7天，EBS应该在直径约150 - 200微米，并应对此表示强烈的绿色荧光信号（ 图1C）。这些胚准备涂层菜或盖玻片上poly-DL-ornithine/laminin分离和镀金。
4。第4步：制备Poly-DL-ornithine/laminin涂层盖玻片（定时：2天）
前两天游离胚（即在分化第5天），准备poly-DL-ornithine/laminin-coated盖玻片。
- 地方12毫米的圆形盖玻片的24孔板底部（华纳仪器）。溶解聚-DL-鸟氨酸（Sigma-Aldrich公司），25毫升25毫克无菌双蒸水（D 2·H 2 O）的获得10倍的股票解决方案（1毫克/毫升）。当准备使用，使H 2 O 2与D 1/10稀释的聚-DL-鸟氨酸获得concent口粮100微克/毫升。加入0.5毫升，每4°C间良好的24孔板孵育过夜。
- 翌日（分化第6天），吸聚-DL-鸟氨酸，让组织文化罩板和盖玻片空气干燥。 D 2 H 2 O三次冲洗液体。让我们为一个小时，空气干燥。
- 1毫克小鼠层粘连蛋白（Millipore公司）溶于5毫升冰冷的1×PBS 100X原液（200微克/毫升）。当准备使用，使在冰冷的1X PBS（粘连2微克/毫升）稀释1/100。添加0.5毫升/ 24孔板孵育4℃过夜。播种前细胞，多余的粘连应该被删除，并两次用1X PBS冲洗井。盖玻片可以存储在国防部中等（0.5毫升/孔）。
5。第5步：轴突伸长率（执行时间：2天）
- 在分化的第7天，收集到15毫升管EBS和允许胚定居（约3分钟）。抽吸媒体和重新-S在PBS uspend胚。允许胚定居，然后吸PBS。重复此步骤3次。加入1毫升到EBS Accumax（Millipore公司），轻轻混匀，静置室温5分钟。然后吸过剩Accumax涵盖了EBS。
- 游离EBS，添加3毫升国防部介质。吸取了上下20次使用1毫升的Eppendorf微量（蓝色提示）扰乱胚。孵育室温2分钟。悬浮细胞与细胞过滤帽（屋宇署猎鹰）转移到12x75毫米管，获得单细胞悬液。重复此剩余的团块，并保留通过过滤器，以丰富的单细胞产量细胞的分离步骤。最后的单细胞悬液，将6毫升。
- 轻轻混匀这个单细胞悬液，用血球计数细胞。稀释细胞密度2×10 5细胞每毫升入国防部培养基（辅以10毫微克/毫升每个脑源性神经营养因子GDNF的，睫状神经营养因子，和NT-3）。 24孔板含宝加入细胞悬液（0.5毫升/）ly-DL-ornithine/laminin涂层盖玻片（事先准备好的如上所述）。分化的细胞扩大培养后2天（ 图1D）长突起。
6。代表结果
图1A显示了一个协议的轮廓。在第1步，MES细胞培养PMEF LIF的补充，以防止自发分化。在一般情况下，未分化的MES殖民地是圆而紧凑，并有明确界定的边缘。殖民地是不能彼此接触。通常情况下，应mES细胞分裂1:4的比例，每2〜3天。然而，每个人的细胞会以不同的速率增长，必须凭经验确定分流比。在图1B箭头指示后，在3天的PMEF饲养层培养mES细胞的典型外观。这些殖民地是大（直径在50-100微米），但仍保持轮和界定边缘第在这个阶段的殖民地分化或亚文化。在图1B箭头显示一个小的MES殖民地您通常电镀后24小时。电镀后4天，MES细胞变得杂草丛生。他们表现出一个扁平的外观和损失定义的边界，这表明他们已经开始分化。这种细胞分化成神经细胞的最佳。
mES细胞分化成运动神经元，mES细胞需要培养悬浮条件允许的EB形成。在第2步，胚胎干细胞被转移到无饲养层，以促进EB形成一种文化表面。在这一步，他们培养Noggin的，碱性成纤维细胞生长因子，FGF-8辅以2天直接向神经系细胞的神经分化中等。小EBS可以分化第1天在显微镜下观察。他们应漂浮在培养基。也可以在第1天发现结转PMEF分化，必须拆除。坚持这些细胞被淘汰时胚代到一个新的细菌菜细菌菜肴。因此，分化2天，很少或根本没有PMEF应看到，在培养皿中。在第3步，继续EBS转移到新的菜肴，应确保去除任何剩余PMEF的。胚培养运动神经元分化（国防部）与RA补充媒体和凹陷分化成运动神经元细胞为5天。在培养过程中，EBS继续扩大规模，并可以通过肉眼看到，在分化第3天〜4次。 图1C显示EBS的分化第7天的微观外观。不同的是未分化的细胞，EBS显示较强的荧光，由于GFP的表达。这些胚是最佳的分化和分离的准备。流式细胞仪检测表明，51％±0.8％游离胚细胞分化成绿色荧光蛋白表达细胞5。在步骤5中，日文化ESE电机神经元GDNF的，睫状神经营养因子，脑源性神经营养因子，延长长期性轴索预测和NT3结果存在。 图1D显示分化细胞分离胚电镀后第2天的外观。注意镀细胞的细胞体延伸的长突起。免疫荧光染色显示，GFP +细胞表达泛神经元标记（神经丝蛋白中链）和两个运动神经元的特异性标志物，（胰岛-1和胆碱乙酰转移酶， 图2）。
图1。mES细胞分化成运动神经元（从武等图片修改。5）。 a）计划mES细胞运动神经元的分化协议。二）MES的未分化细胞形成的成纤维细胞饲养层的顶部的圆形菌落。他们有弱的绿色荧光蛋白表达。 c）MES细胞分开饲养层和cultu在低附着菜红，形成胚。在第一天的分化过程中，细胞暴露于50毫微克/毫升Noggin的20毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子，20 ng / ml的FGF-8。随后，他们被诱导分化为1μm维甲酸和1μM的5天的刺猬激动剂凹陷。 MES的分化细胞中表达GFP荧光强。 d）经过7天的分化，胚分离poly-DL-ornithine/laminin涂层板镀。分化的细胞延长2天中文化后的很长的神经过程。比例尺= 200微米。百万=电机的神经元。 B，C和D是亮场图像和乙'，C'和D'是相应的荧光图像。
图2 MES细胞衍生的运动神经元表征。免疫荧光染色神经丝蛋白中链NF-M（红色），聊天（红色），胰岛-1（红色）与GFP（绿色）expr的重合分裂国家。的DAPI（蓝色）被用来确定原子核。比例尺= 50微米。
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Discussion
mES细胞的质量是最关键的参数为运动神经元的高效发电。 mES细胞必须培养，对PMEF防止自发分化。此外LIF的帮助mES细胞保持在未分化状态。由于MES细胞分裂每12至15小时，培养基变得枯竭迅速，必须每天更换。
高效活化Shh的途径是一个关键的参数，需要引起运动神经元的规范。 Shh蛋白（研发体系），Shh信号激动剂，如HH激动剂HhAg1.3（Curis公司），purmorphamine（Calbiochem公司），凹陷（EMD的化学品），都被用来促进运动神经元的形成1-3 ，10,11。我们发现凹陷是一个更有效的分子比purmorphamine在分化细胞迈向运动神经元型5。 1 - 2.5μM的1μM天雨purmorphamine从未放弃的分化效率超过20％。然而在我们手中，RA和1微米，1微米的凹陷的组合，都没有神经诱导步骤分化过程中的约25％的效率。
为了进一步加强分化的效率，我们添加了一个为期2天的神经感应步前运动神经元的规范步骤。这种方法需要Noggin与FGF信号是至关重要的早期神经诱导胚胎干细胞时首次进入神经 系6-9的优势。 FGF信号在神经诱导，维持神经前体细胞的培养。在发展中国家中脑FGF8过度导致的神经前体的人口在急剧扩张的脑室区12。 FGFs和Noggin的组合协同作用在诱导神经组织的形成，促进后神经身份9。因此，在为期2天的神经感应步旨在引导mES细胞对神经系的运动神经元的规范的过程开始之前。
这里描述的协议是先前描述1成立的原始协议的修改和增强。虽然运动神经元产生的时间轴是相同的，我们已经做了一些修改，以简化程序，提高运动神经元的收益。通过添加一个神经诱导分化协议的步骤，我们是能够提高分化效率从25％到50％。我们的协议提供了一个有效的方法，以丰富mES细胞衍生的运动神经元。运动神经元不能得到SMA患者和健康状况不佳的主要运动神经元从SMA的小鼠排除足够的数量，质量和纯度，这种疾病影响的蛋白质进行定量分析细胞的分离。使用这个MES细胞的协议，我们能够获得足够的权运动神经元细胞人口tity和纯度的蛋白组学的研究，以确定在脊肌萎缩症5影响的分子途径。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这手稿是致力于到文澜王博士的记忆2011年05月26日，通过了。我们感谢道格拉斯A·克尔博士慷慨提供的HBG3 MES在这项研究中使用的细胞。这项工作是由内穆尔，赠款（2 RR016472-10）根据国家研究资源中心（NCRR），和1 COBRE补助金从NCRR（5 P20的RR020173-05），以支持中心的INBRE方案儿童，美国特拉华州威尔明顿，在阿尔弗雷德一，杜邦医院的儿科研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMEF | EMD Millipore | PMEF-H | N.A. |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | EMD Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | EMD Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | Stem Cell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Millipore | 566660 | 1 μM |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation | |||
| 0.1% Gelatin | Stem Cell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | EMD Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | EMD Millipore | SCR006 | N.A. |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 2. Reagents for coating and dissociation | |||
References
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