Effektiv differentiering af stamceller fra mus i Motoriske neuroner

Summary

Vi har udviklet en ny protokol for at forbedre effektiviteten af ​​in vitro differentiering af muse embryonale stamceller i motoriske neuroner. De differentierede ES-celler opnået motoriske neuroner har som vist ved ekspressionen af ​​neuronale og motorisk neuron markører under anvendelse immunohistokemiske teknikker.

Abstract

Direkte differentiering af embryoniske stamceller (ES)-celler i funktionelle motorneuroner repræsenterer en lovende ressource til at studere sygdomsmekanismer, at screene nye lægemiddelforbindelser, og at udvikle nye terapier for motoriske neuronsygdomme, såsom spinal muskulær atrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose ( ALS). Mange nuværende protokoller anvender en kombination af retinsyre (RA) og sonisk hedgehog (Shh) til at differentiere muse embryonale stamceller (MES)-celler i motorneuroner ^1-4. Imidlertid har differentiering effektiviteten af ​​MES celler i motorneuroner kun mødt med begrænset succes. Vi har udviklet et to-trins differentiering protokol ^5, der væsentligt forbedrer differentiering effektivitet sammenlignet med i dag etablerede protokoller. Det første trin er at forbedre neuralization processen ved tilsætning af noggin og fibroblastvækstfaktorer (FGF'er). Noggin er et knoglemorfogenetisk protein (BMP)-antagonist og er impliceret i neural induktion enccording til standard model neurogenese og resulterer i dannelsen af anterior neural mønsterdannelse ^6. FGF signalering virker synergistisk med Noggin i at fremkalde nervevæv dannelsen ved at fremme en posterior neural identitet ^7-9. I dette trin blev MES celler primet med noggin, bFGF og FGF-8 i to dage for at fremme differentiering til neurale cellelinier. Det andet skridt er at fremkalde motorisk neuron specifikation. Noggin / FGF'er eksponerede MES-celler blev inkuberet med RA og Shh-agonist, Smoothened agonist (SAG) i yderligere 5 dage for at lette motorneuroner generation. At overvåge differentiering af masse ved motoriske neuroner, anvendte vi en ES-cellelinie afledt fra en transgen mus, der udtrykker EGFP under kontrol af motorneuroner promotor Hb9 ^1. Anvendelse af denne robuste protokol, opnåede vi 51 ± 0,8% af differentiering virkningsgrad (n = 3, p <0,01, Student t-test) ^5. Resultaterne fra immunofluorescensfarvning viste, at GFP +-celler udtrykker motorneuroner specifikke markører, ø-1 og cholinacetyltransferase (ChAT). Vores to-trins differentiering protokol giver en effektiv måde at differentiere MES celler i spinale motoriske neuroner.

Protocol

1. Trin 1: Mouse embryonale stamceller (MES) Cell Culture (Timing: 3 dage)

1. Udpladning primære embryoniske musefibroblaster (PMEF)

1. Coat fire 100 mm vævskulturskåle med gelatine til PMEF adhæsion. Tilsættes 8 ml 0,1% gelatine-opløsning (StemCell Technologies) til hver skål, og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
2. Fjern overskydende gelatine fra retter. Må ikke skylle opvasken.
3. Fortyndes et hætteglas af mitomycin C-inaktiveret PMEF (Millipore), der indeholder ca. 5 x 10 ⁶ celler i 40 ml PMEF medium (se opskrift i tabel 1) og pladen på fire 100 mm vævskulturskåle. Det PMEF giver en feeder lag for MES celler.
4. PMEF skal udpladet mindst én dag før tilsætning MES cellekulturer. PMEF kan anvendes op til en uge efter udpladning.

2. Plating MES Celler

For at overvåge effektiviteten af ​​MES celledifferentiering i motoriske neuroner, Anvendte vi HBG3, en ES-cellelinien er afledt fra en transgen mus, der udtrykker EGFP under kontrol af motorneuroner promotor Hb9.

1. Afrimning 1 hætteglas HBG3 MES celler (ca. 1 x 10 ^7, bidraget af Dr. Douglas Kerr, Johns Hopkins University) i et 37 ° C vandbad. Tilsættes 5 ml ES medier (se opskrift i tabel 1) i et 15 ml rør og spin ned celler ved 800 rpm i 5 min.
2. Aspirer supernatanten og resuspender MES celler i 20 ml ES medium med frisk tilsat leukæmiinhiberende faktor (LIF) ved en slutkoncentration på 10 ng / ml. BEMÆRK: LIF skal lægges på den dag i brug og er forpligtet til at opretholde MES cellerne i en udifferentieret tilstand.
3. Fjern 10 ml PMEF medier fra PMEF i hver skål og tilsæt 10 ml af HBG3 ES cellesuspensionen til hver skål.
4. 24 timer efter udpladning danner MES celler små kolonier, svarende i størrelse til kolonien angivet ved pilespids i figur 1B. 72 timer efter udpladning, colonies forøgelse i størrelse, og mange er ca 100 um i diameter (figur 1B, angivet med pile). Disse celler er klar til differentiering. Medier bør udskiftes dagligt for at opretholde proliferation af celler.

2. Trin 2: Neural Induktion (Timing: 2 dage)

Til at inducere differentiering af MES celler i motorneuroner, MES celler skal adskilles fra PMEF og dyrket i en suspension miljø. Gelatineovertrukne kolber anvendes til at separere PMEF fra MES-celler.

1. Når MES kolonier er klar til neural induktion (defineret som differentiering dag 0), coat 2 T150 kolber med 0,1% gelatine (18 ml / kolbe) i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter fjerne overskydende gelatine og vaskes med 1X PBS tre gange. BEMÆRK: Hver 100-mm-skål kultur skal en T150-gelatine belagt kolbe at adskille PMEF.
2. Fjern forsigtigt medier ved aspiration, sørg for ikke at fjerne løst tilknyttede kolonier. Tilsæt 10 ml PBS kortly og fjern derefter ved aspiration til at fuldføre vasketrin.
3. At adskille MES celler fra PMEF tilsættes 0,25% trypsin / EDTA (3 ml / skål, StemCell Technologies) og inkuberes i 3-5 min ved 37 ° C, indtil stamceller og PMEF løsnes fra pladen. Der tilsættes 15 ml frisk ES medium uden LIF og Pipetter celler op og ned for at bryde kolonier (15-20 gange). Derefter tilsættes en 0,1% gelatine-coatede T150 kolbe og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Efter inkubation, skal PMEF tillægger gelatinerede overfladen, mens ES-celler skal flyde. Indsamle de flydende MES cellerne i et 50 ml rør.
4. Vågeblus ved 800 rpm og resuspender cellerne i 10 ml neural differentiering medium (se opskrift i tabel 1).
5. Tæl cellerne med et hæmocytometer, og derefter plade omkring 2 x 10 ⁶ MES celler på en 100 mm bakteriel eller suspension dyrkningsskål. Disse plader tillader vækst af suspension kulturer og fremme dannelsen af ​​embryoide organer (EBS).
6. På differentietion dag 1, MES celler danner små flydende aggregater (EBS), der er synlige under et lysmikroskop. Enhver fremførsel PMEF lægger til fadet. Overfør suspensionen celler og medier i et 15 ml rør og centrifugeres ved lav hastighed (500 rpm) i 3 minutter. Aspirer medier omhyggeligt, tilsæt 10 ml frisk neural differentiering Medium til det pelleterede EBS, og derefter plade celler i en ny bakteriel parabol. Ud over efterfyldning medierne fjerner dette trin helst PMEF der overførsel fra det forudgående trin.
7. På differentiering dag 2, er EB klar til at blive induceret i motorneuroner.

3. Trin 3: Motor Neuron Specifikation (Timing: 5 dage)

1. På differentiering dag 2, hvirvel dyrkningsskålen og overføre medierne og EBS i et 15 ml rør. Lad EB løse ved hjælp af tyngdekraften (~ 10 min) eller ved centrifugering ved lav hastighed (500 rpm) i 3 minutter.
2. Aspirer medium omhyggeligt og resuspender EB'er i 10 ml Motor Neuron Differentiering (MND) medium (se opskrift på
3. På differentiering dag 7, bør EB være cirka 150 - 200 um i diameter og skal udtrykke stærke GFP signal (figur 1C). Disse EB'er er klar til at skille ad og udplades på poly-DL-ornithine/laminin coatede retter eller dækglas.

4. Trin 4: Udarbejdelse af Poly-DL-ornithine/laminin overtrukne dækglas (Timing: 2 dage)

To dage før adskille EBS (dvs. differentiering dag 5), forberede poly-DL-ornithine/laminin-coated dækglas.

1. Sted 12 mm runde dækglas (Warner Instruments) på bunden af ​​en 24-brønds plade. Opløs 25 mg poly-DL-ornithin (Sigma-Aldrich) i 25 ml sterilt, dobbeltdestilleret vand (d _{2 H2O)} til opnåelse af en 10X stamopløsning (1 mg / ml). Når de er klar til brug, at en 1/10 fortynding af poly-DL-ornithin _med d2 _H2O til opnåelse concentration af 100 ug / ml. Tilsæt 0,5 ml til hver brønd i 24-brønds plade og inkuber ved 4 ° C natten over.
2. Den følgende dag (differentiering dag 6), aspirat poly-DL-ornithin og lad pladerne og dækslet glider lufttørre i en vævskultur hætte. Skyl de pladebrøndene med d ₂ H ₂ O-tre gange. Lad det lufttørre i en time.
3. Opløs 1 mg muselaminin (Millipore) i 5 ml isafkølet-kold 1X PBS for at 100x stamopløsning (200 ug / ml). Når de er klar til brug, at 1/100 fortynding i isafkølet-kold 1X PBS (2 ug laminin / ml). Tilsæt 0,5 ml / brønd i en plade med 24 brønde og inkuber ved 4 ° C natten over. Før såning celler bør overskydende laminin fjernes og brøndene blev skyllet med 1X PBS to gange. Dækglas kan lagres i MND medium (0,5 ml / brønd).

5. Trin 5: Axon Forlængelse (Timing: 2 dage)

1. På differentiering dag 7 samle EB i et 15 ml rør og tillade EB at afgøre (ca. 3 minutter). Aspirer medier og re-suspend EB'er i PBS. Tillad EB'er at bosætte sig og derefter aspirer PBS. Gentag dette trin 3 gange. Tilsæt 1 ml Accumax (Millipore) til EBS forsigtigt blandes og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter aspirere overskydende Accumax dækker EBS.
2. For at adskille EBS, tilsættes 3 ml MND medium. Pipetter op og ned 20 gange med en 1 ml Eppendorf mikropipetten (blå spids) at afbryde EBS. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur. Overførsel cellesuspension til et 12x75 mm rør med cellefilter hætte (BD Falcon) for at opnå en enkelt cellesuspension. Gentage denne dissociation trin med de resterende klumper og celler tilbageholdt af filteret, således at berige udbyttet af enkeltceller. Den endelige enkelt cellesuspension er 6 ml.
3. Forsigtigt blander denne enkelt cellesuspension og tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer. Fortynd cellerne i MND medium (suppleret med 10 ng / ml af hver BDNF, GDNF, CNTF, og NT-3) til en densitet på 2x10 ⁵ celler pr. Tilsættes cellesuspensionen (0,5 ml / brønd) til 24-brønds plader indeholdende poly-DL-ornithine/laminin overtrukne dækglas (tidligere fremstillet som beskrevet ovenfor). De differentierede celler strækker lange neuritter efter 2 dage i kultur (figur 1D).

6. Repræsentative resultater

Figur 1A viser en skitse af protokollen. I trin 1 er MES celler dyrket på PMEF og suppleret med LIF at forhindre spontan differentiering. I almindelighed er udifferentierede MES kolonier runde og kompakt, og har klart definerede kanter. Kolonierne ikke er i kontakt med hinanden. Typisk bør MES celler opdeles i et 1:4 forhold hver 2 ~ 3 dage. Imidlertid vil hver enkelt cellelinje vokse ved en forskellig hastighed og delingsforholdet skal bestemmes empirisk. Pile i Figur 1B viser den typiske udseende af MES-celler efter dyrkning på et PMEF fødelag i 3 dage. Disse kolonier store (50-100 um i diameter), men stadig opretholde rundt og defineret kantsek. På dette stadium kolonierne er klar til differentiering eller subkultur. En pilespids på figur 1B viser en lille MES koloni, som man typisk finde 24 timer efter udpladning. Fire dage efter udpladning, MES celler gror. De udviser en flad udseende og tab af definerede grænser, hvilket indikerer, at de begynder at differentiere. Sådanne celler ikke er optimale for differentiering til neuronale celler.

At differentiere MES celler i motorneuroner, MES celler skal dyrkes i suspension betingelser for at tillade EB-dannelse. I trin 2 er ES-celler overføres til en kultur overflade uden et fødelag for at fremme EB-dannelse. I dette trin bliver de inkuberes i neural differentiering medium suppleret med noggin, bFGF og FGF-8 i 2 dage til direkte celler til et neuralt afstamning. Lille EB kan iagttages under mikroskop på dag 1 af differentiering. De bør være flydende i mediet. Fremførsel PMEF kan også findes på dag 1differentiering og skal fjernes. Disse celler klæber til bakterielle retter, så er elimineret, når EB er passager til en ny bakteriel parabol. Således på dag 2, differentiering, bør få eller ingen PMEF ses i dyrkningsskålen. I trin 3, fortsatte overførsel af EBS til nye retter skal sikre fjernelse af eventuel resterende PMEF. EB dyrkes i motorneuroner differentiering (MND) medium suppleret med RA og SAG i 5 dage for at skelne mellem celler i motorneuroner. Under dyrkning fortsat EB at vokse i størrelse og kan ses med det blotte øje ved differentiering dag 3 ~ 4. Figur 1C viser mikroskopiske udseende af EBS på differentiering dag 7. I modsætning til de udifferentierede celler, udviser EB stærk fluorescens skyldes ekspression af GFP. Disse EB'er er optimalt differentierede og er klar til dissociation. Flowcytometri viste, at 51% ± 0,8% af cellerne fra det dissocierede ESS differentieret i GFP-udtrykkende celler ^5. I trin 5, kultur thEse motoriske neuroner i nærværelse af GDNF, CNTF, BDNF, NT3 og resulterer i forlængelse af lange axonale projektioner. Figur 1D viser udseendet af differentierede celler 2 dage efter udpladning af dissocieret EBS. Bemærk lange neuritter strækker sig fra cellelegemerne i udpladede celler. Immunofluorescent farvning viser, at GFP +-celler udtrykker pan-neuronale markør (neurofilament-medium kæde) og to motorneuroner specifikke markører, (ø-1 og cholinacetyltransferase, figur 2).

Figur 1. Differentiering af MES-celler i motoriske neuroner (figur modificeret fra Wu et al. ^5). A) Skema om differentiering protokol fra MES celler til motoriske neuroner. B) Udifferentierede MES celler danner runde kolonier på toppen af ​​en fibroblast fødelag. De har svage GFP-ekspression. C) MES-celler blev separeret fra fødelag og culturød på lav-vedhæftede retter at danne EBS. I de første to dage af differentieringsprocessen, blev cellerne eksponeret for 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF og 20 ng / ml FGF-8. Efterfølgende blev de induceres til at differentiere med 1 uM retinsyre og 1 uM sonisk pindsvin agonist SAG i 5 dage. Differentierede MES celler udtrykte stærk GFP-fluorescens. D) efter 7 dages differentiering var EB dissocieret og udpladet på poly-DL-ornithine/laminin coatede plader. De differentierede celler forlænget lange neurale processer efter 2 dage i kultur. Målestokken = 200 um. MN = motor neuron. B, C og D er lyse felt billeder og B ', C' og D 'er tilsvarende fluorescensbilleder.

Figur 2. Karakterisering af MES-celle-afledte motorneuroner. Immunofluorescens-farvning for neurofilament med middellang kædelængde (NF-M, rød), ChAT (rød) og Islet-1 (rød) var sammenfaldende med GFP (grønt) udtrykession. DAPI (blå) blev anvendt til at identificere kerner. Målestokken = 50 um.

Discussion

Kvaliteten af ​​MES-celler er den mest kritiske parameter for effektiv produktion af motorneuroner. MES-celler skal dyrkes på PMEF at forhindre spontan differentiering. Tilsætningen af ​​LIF hjælper med at bevare MES cellerne i en udifferentieret tilstand. Som MES cellerne deler hver 12-15 timer, dyrkningsmediet bliver nedbrydes hurtigt og skal udskiftes dagligt.

Effektiv aktivering af Shh pathway er en kritisk parameter for at inducere motorneuroner specifikation. Shh-protein (R & D System), og SHH signalering agonister såsom Hh agonist HhAg1.3 (curis, Inc.), purmorphamine (Calbiochem), og SAG (EMD Chemicals) er blevet benyttet til at fremme dannelsen af motoriske neuroner ^{1-3 , 10,11.} Vi har fundet SAG at være en mere effektiv molekyle end purmorphamine i differentierende celler til en motor neuronal fænotype ^5. 1 til 2,5 uM purmorphamine med 1 pM RA aldrig gav en differentiering virkningsgrad på mere end 20%. Meni vore hænder en kombination af 1 uM RA og 1 uM af SAG gav en differentiering effektivitet på cirka 25% i procedurer uden et neuralt induktion skridt.

For yderligere at øge differentiering effektivitet, vi tilføje en 2-dages neurale induktion trin forud for motor neuron specifikationen skridt. Denne fremgangsmåde drager fordel af det faktum, at både Noggin og FGF signalering er afgørende for den tidlige fase af neural induktion, når embryonale celler først indtaste neurale afstamning ^6-9. Ud over neural induktion fastholder FGF signalering kulturer som neurale precursorceller. Overekspression af FGF8 i udviklingslandene midthjernen fører til en dramatisk forøgelse af neurale precursor-population i den ventrikulære zone ^12. En kombination af FGF'er og noggin virker synergistisk at inducere neuralt væv formation ved at fremme en posterior neural identitet ^9. Således 2 dage neurale induktion trin er konstrueret til at dirigere MES cellerne modDen neurale linie før initiering af processen for motor neuron specifikation.

Protokollen beskrevet her er en modifikation og forbedring af den oprindelige etableret protokol beskrevet tidligere ^1. Selv tidslinjen at generere motoriske neuroner er den samme, har vi lavet en række ændringer for at strømline proceduren og forbedre udbyttet af motoriske neuroner. Ved tilsætning af en neural induktion trin til differentiering protokol, er vi i stand til at øge differentiering effektivitet fra 25% til 50%. Vores protokol giver en effektiv metode til at berige motoriske neuroner afledt af MES celler. Motoriske neuroner ikke kan opnås fra SMA patienter og dårligt helbred af primære motoriske neuroner fra SMA mus hinder for isolation af celler i tilstrækkelig mængde, kvalitet og renhed at foretage kvantitative analyser af proteiner påvirkes på denne sygdom. Brug af denne MES celle protokol, vi var i stand til at opnå en motor neuron cellepopulation af tilstrækkelig mængdermængde og renhed for en proteomisk undersøgelse for at identificere molekylære veje ramt i spinal muskelatrofi ^5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMEF	EMD Millipore	PMEF-H	N.A.
DMEM	Invitrogen	11965-118	N.A.
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	1%
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15240-063	1%
DMEM	Stem Cell Technologies	36250	N.A.
ES Cell-Qualified FBS	Invitrogen	16141-079	15%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleosides	EMD Millipore	ES-008-D	1%
β-mercapt–thanol	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
Penicillin/streptomycin	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	EMD Millipore	LIF2010	10 ng/ml
DMEM	Stem Cell Technologies	36250	N.A.
ES Cult FBS	Stem Cell Technologies	06905	15%
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-thio glycerol	Sigma-Aldrich	M-6145	1mM
Noggin	Invitrogen	PHC1506	50 ng/ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng/ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng/ml
ES-Cult Basal Medium-A	Stem Cell Technologies	5801	N.A.
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	Stem Cell Technologies	07155	1%
Ascorbic acid	Stem Cell Technologies	07157	1%
Penicillin/streptomycin	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% in d2H2O
Fibronectin	Stem Cell Technologies	07159	5 μg/ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml in d2H2O
β-mercapt–thanol	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
Retinoic Acid	Sigma-Aldrich	R-2625	1 μM
SAG	EMD Millipore	566660	1 μM
ES-Cult Basal Medium-A	Stem Cell Technologies	5801	N.A.
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	Stem Cell Technologies	07155	1%
Ascorbic acid	Stem Cell Technologies	07157	1%
Penicillin/streptomycin	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% in d2H2O
Fibronectin	Stem Cell Technologies	07159	5 μg/ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml in d2H2O
β-mercapt–thanol	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
BDNF	R&D Systems	248-BD-005/CF	10 ng/ml
CNTF	R&D Systems	257-NY-010/CF	10 ng/ml
GDNF	R&D Systems	212-GD-010/CF	10 ng/ml
NT-3	R&D Systems	267-N3-005/CF	10 ng/ml
N.A. = Non-applicable
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation
0.1% Gelatin	Stem Cell Technologies	07903	N.A.
Poly-DL-ornithine	Sigma-Aldrich	P0421	0.1 mg/ml in d2H2O
Mouse laminin	EMD Millipore	CC095	2 μg/ml in PBS
0.25% Trypsin/EDTA	Stem Cell Technologies	07901	N.A.
Accumax	EMD Millipore	SCR006	N.A.
N.A. = Non-applicable
Table 2. Reagents for coating and dissociation