Effektiv Differensiering av mus embryonale stamceller i motoriske nevroner

Summary

Vi utviklet en ny protokoll for å forbedre effektiviteten av in vitro differensiering av mus embryonale stamceller inn i motoriske nevroner. De differensierte ES celler kjøpt motor nevroner har bevist ved uttrykk av nevrale og motor neuron markører med immunhistokjemiske teknikker.

Abstract

Direkte differensiering av embryonale stamceller (ES) celler i funksjonelle motoriske nevroner representerer en lovende ressurs for å studere sykdomsmekanismer, for å skjerme nye stoffet forbindelser, og å utvikle nye behandlingsmetoder for motor neuron sykdommer som spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose ( ALS). Mange nåværende protokoller bruke en kombinasjon av retinsyre (RA) og sonic hedgehog (Hysj) for å skille mus embryonale stamceller (MES) celler inn i motor nevroner ^1-4. Imidlertid har differensiering effektiviteten av MES celler i motor nevroner bare møtt med moderat suksess. Vi har utviklet et to-trinns differensiering protokoll ⁵ som vesentlig forbedrer differensiering effektivitet sammenlignet med for tiden etablerte protokoller. Det første trinnet er å forbedre neuralization prosessen ved å legge Noggin og fibroblast vekstfaktorer (FGFs). Noggin er en Benmorfogenetiske protein (BMP) antagonist og er innblandet i nevrale induksjon enccording til standard modell av neurogenesis og resulterer i dannelse av fremre nevrale mønster ^seks. FGF-signalering virker synergistisk med Noggin i inducing nevrale vev dannelse ved å fremme en posterior neural identitet ^7-9. I dette trinnet, ble MES celler primet med Noggin, bFGF, og FGF-8 for to dager for å fremme differensiering mot nevrale linjene. Det andre trinnet er å indusere motor neuron spesifikasjonen. Noggin / FGFs utsatte MES celler ble inkubert med RA og en Shh agonist, glattes agonist (SAG) for ytterligere 5 dager for å lette motoriske nervecellen generasjon. For å overvåke differensiering av rotet til motoriske nevroner, brukte vi en ES celle linje stammer fra en transgen mus som uttrykker eGFP under kontroll av den motoriske nervecellen spesifikk promoter Hb9 ^en. Ved hjelp av denne robuste protokollen, oppnådde vi 51 ± 0,8% av differensiering effektivitet (n = 3, p <0,01, Student t-test) ^5. Resultater fra immunofluorescentfarging viste at GFP + celler uttrykker de motoriske nervecellen spesifikke markører, Islet-1 og kolin acetyltransferase (chat). Vår to-trinns differensiering protokollen gir en effektiv måte å skille MES celler i spinal motoriske nerveceller.

Protocol

1. Trinn 1: Mouse Embryonic Stem (MES) Cell Culture (Timing: 3 dager)

1. Kontaktflate primære embryonale mus fibroblaster (PMEF)

1. Coat fire 100-mm vevskulturstudier retter med gelatin for PMEF vedheft. Legg 8 ml av 0,1% gelatin løsning (StemCell Technologies) til hver rett og Inkuber i 30 min ved romtemperatur.
2. Fjern overflødig gelatin fra retter. Ikke skyll oppvasken.
3. Fortynn en ampulle med mitomycin C-inaktivert PMEF (Millipore) som inneholder ca. 5 x 10 ⁶ celler i 40 ml PMEF media (se oppskrift i tabell 1) og plate på fire 100-mm vevskulturstudier retter. Den PMEF gi en mater lag for MES celler.
4. PMEF bør belagt minst en dag før du legger MES cellekulturer. PMEF kan brukes opp til en uke etter plating.

2. Kontaktflate MES Celler

For å overvåke effektiviteten av MES celledifferensiering til motoriske nevroner, Brukte vi HBG3, en ES celle linje stammer fra en transgen mus som uttrykker eGFP under kontroll av den motoriske nervecellen spesifikk promoter Hb9.

1. Defrost 1 hetteglass HBG3 MES celler (ca. 1 x 10 ^7, bidratt av Dr. Douglas Kerr, Johns Hopkins University) i en 37 ° C vannbad. Tilsett 5 ml ES media (se oppskrift i tabell 1) i en 15 ml tube og spinner ned celler på 800 rpm i 5 min.
2. Aspirer supernatanten og Resuspender MES cellene i 20 ml av ES media med fersk lagt leukemi hemmende faktor (LIF) på en endelig konsentrasjon på 10 ng / ml. MERK: LIF bør legges ved bruk og er nødvendig for å opprettholde MES cellene i en udifferensiert tilstand.
3. Ta 10 ml PMEF media fra PMEF i hver tallerken og legg 10 ml HBG3 ES cellesuspensjon til hver rett.
4. 24 timer etter plating, MES celler danner små kolonier, tilsvarende i størrelse til kolonien indikeres av pilspissen i figur 1B. 72 timer etter plating, colonies økning i størrelse, mange blir ca 100 mikrometer i diameter (Figur 1B, angitt med piler). Disse cellene er klar for differensiering. Media bør skiftes daglig for å opprettholde spredning av celler.

2. Trinn 2: Neural Induksjon (Timing: 2 dager)

Å indusere differensiering av MES celler i motoriske nevroner, MES cellene trenger for å bli separert fra PMEF og dyrket i en suspensjon miljø. Gelatin belagt kolber brukes til å skille PMEF fra MES celler.

1. Når MES kolonier er klare for nevrale induksjon (definert som differensiering dag 0), frakk 2 T150 kolber med 0,1% gelatin (18 ml / kolbe) i 30 min ved romtemperatur, og deretter fjerne overflødig gelatin og vask med 1x PBS tre ganger. MERK: Hver 100-mm parabolen kultur vil trenge en T150-gelatin belagt kolbe å skille PMEF.
2. Fjern forsiktig media ved aspirasjon, å sørge for ikke å løsne løst vedlagte kolonier. Tilsett 10 ml PBS kortly og fjern deretter ved aspirasjon å fullføre vasketrinn.
3. For å skille MES celler fra PMEF, legg 0,25% trypsin / EDTA (3 ml / parabol, StemCell Technologies) og inkuberes for 3-5 minutter ved 37 ° C inntil stamceller og PMEF løsner fra platen. Tilsett 15 ml fersk ES media uten LIF og pipette celler opp og ned for å bryte kolonier (ca 15-20 ganger). Deretter legger du til en 0,1% gelatin-belagt T150 kolbe og Inkuber i 30 min ved 37 ° C. Etter inkubasjon, bør PMEF feste til gelatinized overflate mens ES celler skal flyte. Samle de flytende MES cellene inn i en 50 ml tube.
4. Spinn ned ved 800 rpm og Resuspender celler i 10 ml av Neural Differensiering Medium (se oppskrift i tabell 1).
5. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og deretter plate ca 2 x 10 ⁶ MES celler på en 100-mm bakteriell eller suspensjon kultur parabolen. Disse platene tillater vekst av suspensjon kulturer og fremme dannelse av embryoid organer (EBS).
6. På differentiasjon dag 1, MES cellene danner små flytende tilslag (EBS) som er synlig under et lysmikroskop. Enhver carryover PMEF feste til parabolen. Overføre hjuloppheng cellene og media til en 15 ml tube og sentrifuger ved lav hastighet (500 rpm) for 3 min. Sug media nøye, tilsett 10 ml fersk Neural Differensiering Medium til pelletert EBS, og deretter tallerken celler i en ny bakteriell parabolen. I tillegg til å fylle mediene, fjerner dette trinnet noen PMEF som bærer over fra den tidligere trinn.
7. På differensiering dag 2, EBS er klare til å bli overtalt til motoriske nerveceller.

3. Trinn 3: Motor Neuron Specification (Timing: 5 dager)

1. På differensiering dag 2, virvel kulturen fatet og overføre media og EBS i en 15 ml tube. La EBS løse ved tyngdekraften (~ 10 min) eller ved sentrifugering på lav hastighet (500 rpm) for 3 min.
2. Aspirer medium nøye og resuspender EBS i 10 ml Motor Neuron Differensiering (MND) medium (se oppskrift i
3. På differensiering dag 7, bør EBS være ca 150 - 200 mikrometer i diameter og skal uttrykke sterke GFP signaler (figur 1C). Disse EBS er klar til å bli skilt og belagt på poly-DL-ornithine/laminin belagt retter eller Dekkglass.

4. Trinn 4: Utarbeidelse av Poly-DL-ornithine/laminin Malte Dekkglass (Timing: 2 dager)

To dager før skilte EBS (dvs på differensiering dag 5), forberede poly-DL-ornithine/laminin-coated Dekkglass.

1. Plasser 12 mm-runde Dekkglass (Warner Instruments) på bunnen av en 24-brønns plate. Oppløs 25 mg poly-DL-ornithine (Sigma-Aldrich) i 25 ml sterilt, dobbelt destillert vann (d ₂ H ₂ O) for å få en 10X stamløsning (1 mg / ml). Når du er klar til bruk, lage en 1/10 fortynning av poly-DL-ornithine med d ₂ H ₂ O for å få Samtykkerasjon på 100 mikrogram / ml. Tilsett 0,5 ml til hver brønn på 24-brønnen plate og inkuber ved 4 ° C for natten.
2. Dagen etter (differensiering dag 6), aspirer poly-DL-ornithine og la platene og deksel slips lufttørke i en vevskultur hette. Skyll plate brønner med d ₂ H ₂ O tre ganger. La lufttørke i en time.
3. Oppløs 1 mg mus laminin (Millipore) i 5 ml iset-kald 1X PBS til å gjøre 100x stamløsning (200 mikrogram / ml). Når du er klar til bruk, lage 1/100 fortynningen i iset-kaldt 1X PBS (2 mikrogram laminin / ml). Tilsett 0,5 ml / brønn i en 24-brønns plate og inkuber i 4 ° C for natten. Før såing celler, bør overflødig laminin fjernes og brønner skylles med 1X PBS to ganger. Dekkglass kan lagres i MND medium (0,5 ml / brønn).

5. Trinn 5: Axon Forlengelse (Timing: 2 dager)

1. På differensiering dag 7, samle EBS i en 15 ml tube og la EBS å bosette (ca 3 min). Aspirer media og re-suspend EBS i PBS. Tillat EBS å bosette og deretter aspirer PBS. Gjenta dette trinnet 3 ganger. Tilsett 1 ml Accumax (Millipore) til EBS, Bland forsiktig og inkuberes i 5 minutter i romtemperatur. Så aspirer overflødig Accumax dekker EBS.
2. For å distansere EBS, tilsett 3 ml MND medium. Pipet opp og ned 20 ganger med en 1 ml Eppendorf mikropipette (blå tips) å forstyrre EBS. Inkuber i 2 min ved romtemperatur. Overføring cellesuspensjon til en 12x75 mm rør med celle sil cap (BD Falcon) for å få en enkelt celle suspensjon. Gjenta dette dissosiasjon trinnet med gjenværende klumper og celler beholdes av filteret slik berike avkastningen av enkeltceller. Den endelige enkelt celle suspensjon vil være 6 ml.
3. Bland forsiktig denne singelen cellesuspensjon og telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Fortynn cellene i MND medium (supplert med 10 ng / ml av hver BDNF, GDNF, CNTF, og NT-3) til en tetthet av 2x10 ⁵ celler per ml. Legg cellesuspensjon (0,5 ml / brønn) til 24-brønners plater som inneholder poly-DL-ornithine/laminin belagt Dekkglass (tidligere utarbeidet som beskrevet ovenfor). De differensierte cellene utvide lange neurites etter 2 dager i kultur (figur 1D).

6. Representative Resultater

Figur 1a viser en skisse av protokollen. I trinn 1 er MES celler dyrket på PMEF og supplert med LIF for å hindre spontan differensiering. Generelt udifferensierte MES kolonier er runde og kompakte, og har klart definerte kanter. Koloniene er ikke i kontakt med hverandre. Vanligvis bør MES cellene deles ved en 1:04 ratio hver 2 ~ 3 dager. Imidlertid vil hver enkelt celle linje vokse i et annet tempo og Delingsforholdet må bestemmes empirisk. Pilene i Figur 1B viser typisk utseende av MES cellene etter dyrkning på en PMEF mater lag i 3 dager. Disse koloniene er stor (50-100 mikrometer i diameter), men likevel opprettholde runde og definert kants. På dette stadiet koloniene er klare for differensiering eller subkultur. En pilspiss i figur 1B viser en liten MES koloni som du vanligvis finner 24 timer etter plating. Fire dager etter plating, MES celler blir overgrodd. De viser en flat utseende og tap av definerte grenser, noe som indikerer at de begynner å differensiere. Slike celler er ikke optimal for differensiering i nevrale celler.

For å skille MES celler i motoriske nevroner, MES cellene må dyrkes i suspensjon vilkår for å tillate EB formasjon. I trinn 2, blir ES celler overført til en kultur overflate uten en mater lag for å fremme EB formasjon. I dette trinnet, er de inkuberes i Neural Differensiering medium supplert med Noggin, bFGF, og FGF-8 for 2 dager til direkte celler til en neural avstamning. Liten EBS kan observeres under mikroskop på dag 1 av differensiering. De bør flyte i mediet. Carryover PMEF kan også bli funnet på dag 1av differensiering og må fjernes. Disse cellene holder seg til bakterielle retter så elimineres når EBS er passaged til en ny bakteriell parabolen. Dermed dag 2 av differensiering, bør få eller ingen PMEF sees i kulturen fatet. I trinn tre, fortsatte overføring av EBS til nye retter bør sørge for fjerning av eventuelle gjenværende PMEF. EBS dyrkes i motoriske nevroner differensiering (MND) media supplert med RA og SAG i 5 dager for å skille cellene i motoriske nevroner. Under kultur, EBS fortsette å vokse i størrelse og kan ses med det blotte øye ved differensiering dag 3 ~ 4. Figur 1C viser den mikroskopiske utseendet av EBS på differensiering dag 7. I motsetning til de udifferensierte celler, EBS viser sterk fluorescens grunn uttrykk for GFP. Disse EBS er optimalt differensiert og er klar for dissosiasjon. Flowcytometri viste at 51% ± 0,8% av celler fra dissosiert EBS hadde differensiert i GFP uttrykke celler ^fem. I fem trinn, kultur thESE motoriske nevroner i nærvær av GDNF, CNTF, BDNF, og NT3 resulterer i forlengelse av lange aksonale projeksjoner. Figur 1D viser utseendet av differensierte celler 2 dager etter plating av dissosiert EBS. Merk lange neurites strekker seg fra cellen kroppene til gullbelagte cellene. Immunofluorescent farging viser at GFP + celler uttrykker pan-nevronale markør (neurofilament-medium chain) og to motoriske nervecellen spesifikke markører, (Islet-1 og kolin acetyltransferase, figur 2).

Figur 1. Differensiering av MES celler i motoriske nevroner (bildet endret fra Wu et al. ^5). A) Scheme av differensiering protokollen fra MES celler til motoriske nerveceller. B) Udifferensiert MES cellene danner runde kolonier på toppen av en fibroblast mater lag. De har svake GFP uttrykk. C) MES celler ble separert fra mater lag og culturød på lav-vedlegg retter å danne EBS. I løpet av de to første dagene av differensiering prosessen ble cellene eksponert for 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF, og 20 ng / ml FGF-8. Deretter ble de overtalt til å differensiere med en mM retinsyre og 1 mM sonic hedgehog agonist SAG i 5 dager. Differensiert MES cellene uttrykte sterk GFP fluorescens. D) Etter syv-dagers differensiering, var EBS skilt og belagt på poly-DL-ornithine/laminin belagte plater. De differensierte cellene forlenget lange nevrale prosesser etter 2 dager i kultur. Scale bar = 200 mikrometer. MN = motor neuron. B, C og D er lyse felt bilder og B ', C' og D 'er tilsvarende fluorescens bilder.

Figur 2. Karakterisering av MES celle-deriverte motoriske nerveceller. Immunfluorescens farging for neurofilament medium chain (NF-M, rød), chat (rød), og Islet-1 (rød) var sammenfallende med GFP (green) expression. DAPI (blå) ble brukt for å identifisere kjernen. Scale bar = 50 mikrometer.

Discussion

Kvaliteten av MES celler er den mest kritiske parameteren for effektiv produksjon av motoriske nerveceller. MES cellene må dyrkes på PMEF å hindre spontan differensiering. Tilsetting av LIF bidrar til å opprettholde beskjeden cellene i en udifferensiert tilstand. Som MES celler deler hver 12-15 timer, kulturen medium blir utarmet raskt og må skiftes daglig.

Effektiv aktivering av Hysj veien er en kritisk parameter for å indusere motor neuron spesifikasjonen. Hysj protein (R & D System), og Hysj signalering agonister som Hh agonist HhAg1.3 (Curis, Inc.), purmorphamine (Calbiochem), og SAG (EMD Kjemikalier) har alle blitt brukt til å fremme dannelsen av motor nevroner ^{1-3 , 10,11.} Vi fant SAG å være en mer effektiv molekyl enn purmorphamine i differensierende celler mot en motor neuronal fenotype ^5. 1 til 2,5 mM purmorphamine med en mM RA aldri ga en differensiering effektivitet på mer enn 20%. Imidlertidi våre hender en kombinasjon av 1 mM av RA og 1 mikrometer av SAG ga en differensiering effektivitet på ca 25% i prosedyrer uten en neural induksjon steg.

For ytterligere å øke differensieringen effektivitet, legger vi en to-dagers nevrale induksjon skritt før den motoriske nervecellen spesifikasjonen trinn. Denne tilnærmingen tar nytte av det faktum at både Noggin og FGF signalering er avgjørende for tidlig stadium av nevrale induksjon da embryonale celler først inn i nevrale avstamning ^6-9. I tillegg til nevrale induksjon, opprettholder FGF-signalering kulturer som nevrale forløper celler. Overuttrykte Fgf8 i utviklingsland midbrain fører til en dramatisk utvidelse av nevrale forløper befolkningen i ventrikulær sone ^12. En kombinasjon av FGFs og noggin virker synergistisk i inducing nevrale vev dannelse ved å fremme en posterior neural identitet ^9. Dermed 2-dagers nevrale induksjon trinnet er utformet for å dirigere MES cellene motdet nevrale avstamning før oppstart av prosessen med motoriske nervecellen spesifikasjonen.

Protokollen er beskrevet her er en modifikasjon og forbedring av det opprinnelige etablerte protokoll beskrevet tidligere ^en. Selv tidslinjen generere motoriske nevroner er den samme, har vi gjort en rekke endringer for å effektivisere prosedyren og forbedre avkastningen av motoriske nerveceller. Ved å legge en neural induksjon skritt til differensiering protokollen, er vi i stand til å øke differensiering effektivitet fra 25% til 50%. Vår protokoll gir en effektiv tilnærming for å berike motoriske nevroner avledet fra MES celler. Motoriske nerveceller kan ikke hentes fra SMA pasienter og dårlig helse av primære motoriske nerveceller fra SMA mus utelukker isolering av celler med tilstrekkelig mengde, kvalitet og renhet til å utføre kvantitative analyser av proteiner berørt i denne sykdommen. Ved hjelp av denne MES cellen protokollen, klarte vi å få en motor nevron celle befolkning tilstrekkelig kvantity og renhet for en proteomikk studie for å identifisere molekylære stier berørt i spinal muskelatrofi ^5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMEF	EMD Millipore	PMEF-H	N.A.
DMEM	Invitrogen	11965-118	N.A.
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	1%
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15240-063	1%
DMEM	Stem Cell Technologies	36250	N.A.
ES Cell-Qualified FBS	Invitrogen	16141-079	15%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleosides	EMD Millipore	ES-008-D	1%
β-mercapt–thanol	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
Penicillin/streptomycin	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	EMD Millipore	LIF2010	10 ng/ml
DMEM	Stem Cell Technologies	36250	N.A.
ES Cult FBS	Stem Cell Technologies	06905	15%
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-thio glycerol	Sigma-Aldrich	M-6145	1mM
Noggin	Invitrogen	PHC1506	50 ng/ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng/ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng/ml
ES-Cult Basal Medium-A	Stem Cell Technologies	5801	N.A.
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	Stem Cell Technologies	07155	1%
Ascorbic acid	Stem Cell Technologies	07157	1%
Penicillin/streptomycin	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% in d2H2O
Fibronectin	Stem Cell Technologies	07159	5 μg/ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml in d2H2O
β-mercapt–thanol	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
Retinoic Acid	Sigma-Aldrich	R-2625	1 μM
SAG	EMD Millipore	566660	1 μM
ES-Cult Basal Medium-A	Stem Cell Technologies	5801	N.A.
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	Stem Cell Technologies	07155	1%
Ascorbic acid	Stem Cell Technologies	07157	1%
Penicillin/streptomycin	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% in d2H2O
Fibronectin	Stem Cell Technologies	07159	5 μg/ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml in d2H2O
β-mercapt–thanol	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
BDNF	R&D Systems	248-BD-005/CF	10 ng/ml
CNTF	R&D Systems	257-NY-010/CF	10 ng/ml
GDNF	R&D Systems	212-GD-010/CF	10 ng/ml
NT-3	R&D Systems	267-N3-005/CF	10 ng/ml
N.A. = Non-applicable
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation
0.1% Gelatin	Stem Cell Technologies	07903	N.A.
Poly-DL-ornithine	Sigma-Aldrich	P0421	0.1 mg/ml in d2H2O
Mouse laminin	EMD Millipore	CC095	2 μg/ml in PBS
0.25% Trypsin/EDTA	Stem Cell Technologies	07901	N.A.
Accumax	EMD Millipore	SCR006	N.A.
N.A. = Non-applicable
Table 2. Reagents for coating and dissociation