Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Effektiv Differentiering av embryonala stamceller från mus till Motorneuroner

Published: June 9, 2012 doi: 10.3791/3813

Summary

Vi utvecklade ett nytt protokoll att förbättra effektiviteten av in vitro differentiering av mus embryonala stamceller i motoriska nervceller. De differentierade ES-cellerna förvärvade motoriska neuroner har, vilket framgår av uttryck av neuronala och motor neuron markörer med immunhistokemiska tekniker.

Abstract

Direkt differentiering av embryonala stamceller (ES-celler) till funktionella motoriska nervceller utgör en lovande källa för att studera sjukdomsmekanismer, att screena nya läkemedelssubstanser, och att utveckla nya behandlingar för motor neuron sjukdomar såsom spinal muskelatrofi (SMA) och amyotrofisk lateral skleros ( ALS). Många nuvarande protokoll använder en kombination av retinsyra (RA) och Sonic hedgehog (Shh) för att differentiera från mus embryonala stamceller (MES)-celler i motoriska neuroner 1-4. Har dock differentieringen effektiviteten i MES celler till motoriska neuroner endast mötas med måttlig framgång. Vi har utvecklat en två-stegs differentiering protokoll 5 som avsevärt förbättrar differentieringen effektivitet jämfört med för närvarande fastställda protokoll. Det första steget är att förbättra neuralization processen genom tillsats av noggin och fibroblasttillväxtfaktörer (FGF). Noggin är ett benmorfogenetiskt protein (BMP)-antagonist och är inblandad i neural induktion ennligt standard modell av neurogenes och resulterar i bildningen av främre neurala mönstring 6. FGF signalering fungerar synergistiskt med Noggin att framkalla nervvävnad bildas genom att främja en bakre neural identitet 7-9. I detta steg var MES-celler primade med noggin, bFGF, och FGF-8 i två dagar för att främja differentiering i riktning mot neurala cellinjer. Det andra steget är att förmå motorneuron specifikation. Noggin / FGF exponerade MES-celler inkuberades med RA och Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), för ytterligare 5 dagar för att underlätta motorneuron generation. Att övervaka differentiering av MES in motomeuroner, använde vi en linje ES-cell härledd från en transgen mus som uttrycker EGFP under kontroll av den motoriska neuron promotor HB9 1. Med denna robusta protokoll nådde vi 51 ± 0,8% av differentiering verkningsgrad (n = 3, p <0,01, Students t-test) 5. Resultaten från immunfluorescerandefärgning visade att GFP + celler uttrycker de motoriska neuron specifika markörer, Islet-1 och kolinacetyltransferas (ChAT). Våra två steg differentiering protokollet ger ett effektivt sätt att differentiera MES celler i ryggmärgen motoriska nervceller.

Protocol

1. Steg 1: Mouse embryonala stamceller (MES) Cell Culture (Timing: 3 dagar)

1. Plätering primära embryonala fibroblaster från mus (PMEF)

  1. Coat fyra 100-mm vävnadsodlingsskålar rätter med gelatin för PMEF vidhäftning. Tillsätt 8 ml 0,1% gelatinlösning (StemCell Technologies) till varje skål och inkubera under 30 min vid rumstemperatur.
  2. Ta bort överflödigt gelatin från rätter. Skölj inte disken.
  3. Späd en flaska Mitomycin C-inaktiverat PMEF (Millipore) som innehåller ca. 5 x 10 6-celler till 40 ml av PMEF medium (se receptet i Tabell 1) och plattan på fyra 100-mm vävnadsodlingsplattor. Den PMEF ger en matare lager för MES celler.
  4. PMEF bör beläggas minst en dag innan du lägger MES cellkulturer. PMEF kan användas upp till 1 vecka efter plätering.

2. Plätering MES Celler

Att övervaka effektiviteten av MES-cellsdifferentiering till motoriska neuroner, Använde vi HBG3, en ES-cellinje härledd från en transgen mus som uttrycker EGFP under kontroll av den motoriska neuron promotor HB9.

  1. Avfrostning 1 injektionsflaska HBG3 MES celler (ca 1 x 10 7 bidrog av Dr Douglas Kerr, Johns Hopkins University) i ett 37 ° C vattenbad. Tillsätt 5 ml ES-medium (se recept i tabell 1) i en 15 ml-rör och centrifugera ned cellerna vid 800 rpm under 5 minuter.
  2. Aspirat supernatanten och återsuspendera MES-celler i 20 ml ES media med färskt tillsatt leukemi inhiberande faktor (LIF) vid en slutlig koncentration av 10 ng / ml. OBS: LIF bör läggas på dagen för användning och krävs för att bibehålla MES cellerna i en odifferentierad tillstånd.
  3. Avlägsna 10 ml PMEF media från PMEF i varje skål och tillsätt 10 ml av HBG3 ES cell-suspension till varje skål.
  4. 24 h efter plätering, MES-celler bildar små kolonier, ungefär samma storlek som den koloni som anges av pilen i figur 1B. 72 h efter plätering, Colonies ökning i storlek, varav många är ungefär 100 pm i diameter (figur 1B, som visas med pilar). Dessa celler är redo för differentiering. Media bör bytas dagligen för att bibehålla proliferation av celler.

2. Steg 2: neural induktion (Timing: 2 dagar)

För att inducera differentiering av MES-celler in motomeuroner, MES-celler måste separeras från PMEF och odlas i en suspension miljö. Gelatinbelagda kolvar används för att separera PMEF från MES-celler.

  1. När MES kolonier är redo för neural induktion (definierad som differentiering dag 0), kappa 2 T150-kolvar med 0,1% gelatin (18 ml / kolv) under 30 min vid rumstemperatur och sedan avlägsna överskottet av gelatin och tvätta med 1 x PBS tre gånger. OBS: Varje 100-mm skål kulturen behöver en T150-gelatin belagd kolv att separera PMEF.
  2. Ta försiktigt bort media genom aspiration, att se till att inte rubba löst bifogade kolonier. Tillsätt 10 ml PBS korthetly och ta sedan bort genom aspiration för att slutföra tvättsteg.
  3. Att separera MES celler från PMEF, tillsätt 0,25% trypsin / EDTA (3 ml / skål, StemCell Technologies) och inkubera under 3-5 min vid 37 ° C tills de stamceller och PMEF lossna från plattan. Tillsätt 15 ml nytt medium ES utan LIF och celler Pipettera upp och ned för att bryta kolonier (ca 15-20 gånger). Sedan lägga till en 0,1% gelatin-belagd T150 kolv och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C. Efter inkubation bör PMEF fästa till den gelatinerade yta medan ES-celler bör vara flytande. Samla upp flytande MES celler till en 50 ml-rör.
  4. Centrifugera ner vid 800 rpm och återsuspendera celler i 10 ml Neural differentieringsmedium (se receptet i Tabell 1).
  5. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer och därefter platta ca 2 x 10 6 MES celler på en 100-mm bakteriell eller suspension odlingsskål. Dessa plattor medger tillväxt av suspensionsodlingar och främja bildandet av embryoidkroppar (EBS).
  6. På differentieringtion dag 1, MES cellerna bildar små flytande aggregat (EBS) som är synliga under ett ljusmikroskop. Eventuell överföring PMEF fästa till skålen. Överföra suspensionsceller och media i en 15 ml-rör och centrifugera vid låg hastighet (500 rpm) under 3 minuter. Aspirera media försiktigt, tillsätt 10 ml färsk Neural Differentiering Medium till pelleterat EBS, och sedan platta celler i en ny bakteriell maträtt. Förutom fylla medierna, avlägsnar detta steg något PMEF som bär över från föregående steg.
  7. På differentiering dag 2, EBS är klara att induceras i motoriska neuroner.

3. Steg 3: Motor Neuron Specifikation (Timing: 5 dagar)

  1. På differentiering dag 2, snurra kulturen skålen och överför media och EBS i en 15 ml tub. Låt EB sedimentera genom gravitation (~ 10 min) eller genom centrifugering vid låg hastighet (500 rpm) under 3 minuter.
  2. Aspirera medelstora noggrant och återsuspendera EB i 10 ml Motor Neuron Differentiation (MND) medium (se recept i
  3. På differentiering dag 7, bör EB vara cirka 150 - 200 nm i diameter och bör uttrycka starka GFP signaler (Figur 1C). Dessa EB är redo att skiljas och ströks ut på poly-DL-ornithine/laminin belagda rätter eller täckglas.

4. Steg 4: Framställning av Poly-DL-ornithine/laminin belagda täckglas (Timing: 2 dagar)

Två dagar före dissociation EBS (dvs. differentiering dag 5), förbereda poly-DL-ornithine/laminin-coated täckglas.

  1. Ställe 12-mm runda täckglas (Warner Instruments) på undersidan av en 24-brunnsplatta. Lös 25 mg poly-DL-ornitin (Sigma-Aldrich) i 25 ml sterilt, dubbel-destillerat vatten (d. 2 H 2 O) för att erhålla en 10X stamlösning (1 mg / ml). När den är klar att använda, göra en 1/10 utspädning av poly-DL-ornitin med d 2 H 2 O för erhållande av concentranson av 100 | ig / ml. Tillsätt 0,5 ml till varje brunn i 24-brunnars platta och inkubera vid 4 ° C över natten.
  2. Följande dag (differentiering dag 6), aspirera poly-DL-ornitin och låt plattorna och täckglas luft torka i en vävnadsodling huva. Skölj brunnarna med d 2 H2O tre gånger. Låt lufttorka under en timme.
  3. Upplös 1 mg muslaminin (Millipore) i 5 ml iskylt kall 1 x PBS för att göra 100x stamlösning (200 pg / ml). När du är redo att använda, att 1/100 utspädning i iced-kallt 1X PBS (2 ug laminin / ml). Tillsätt 0,5 ml / brunn i en 24-brunnars platta och inkubera i 4 ° C över natten. Innan sådden celler bör överskottet laminin tas bort och brunnar sköljs med 1 x PBS två gånger. Täckglasen kan lagras i MND-medium (0,5 ml / brunn).

5. Steg 5: Axon Förlängning (Timing: 2 dagar)

  1. På differentiering dag 7, samla EB i en 15 ml rör och tillåta EB separera (omkring 3 minuter). Sug media och re-suspend EB i PBS. Låt EB att bosätta sig och sedan aspirera PBS. Upprepa detta steg 3 gånger. Tillsätt 1 ml Accumax (Millipore) till EBS, blanda försiktigt och inkuberas under 5 min vid rumstemperatur. Då aspirera utöver Accumax täcker EBS.
  2. Att dissociera EBS, tillsätt 3 ml MND medium. Pipettera upp och ned 20 gånger med användning av en 1 ml Eppendorf-mikropipett (blå spets) för att störa EBS. Inkubera under 2 min vid rumstemperatur. Överföra cellsuspension till en 12x75 mm rör med cellfilter lock (BD Falcon) för att erhålla en enkelcellsuspension. Upprepa detta dissociationssteget med återstående klumpar och celler som kvarhålles av filtret så att berika ett utbyte av enskilda celler. Den slutliga enkelcellssuspension blir 6 ml.
  3. Blanda försiktigt denna enda cellsuspension och räkna celler med användning av en hemocytometer. Späd celler i MND-medium (kompletterat med 10 ng / ml av vardera BDNF, GDNF, CNTF, och NT-3) till en täthet av 2x10 5 celler per ml. Tillsätt cellsuspension (0,5 ml / brunn) till 24-brunnsplattor innehållande poly-DL-ornithine/laminin belagda täckglas (tidigare framställd såsom beskrivits ovan). De differentierade cellerna sträcker långa neuriter efter 2 dagar i odling (Fig. 1D).

6. Representativa resultat

Figur 1A visar en översikt av protokollet. I steg 1, är MES celler odlas på PMEF och kompletterat med LIF för att förhindra spontan differentiering. I allmänhet odifferentierade kolonier MES är runda och kompakt, och har klart definierade kanter. Kolonierna är inte i kontakt med varandra. Normalt bör MES celler delas med ett 1:4 förhållande var 2 ~ 3 dagar. Emellertid kommer varje individuell cell-linje växa i en annan hastighet och delningsfaktorn måste bestämmas empiriskt. Pilarna i figur 1B visar det typiska utseendet av MES-celler efter odling på en PMEF matarskikt under 3 dagar. Dessa kolonier är stora (50-100 ^ m i diameter), men fortfarande bibehålla runda och definierad kants. I detta skede kolonierna är redo för differentiering eller subkultur. En pilspets i figur 1B visar en liten MES koloni som du vanligtvis hittar 24 timmar efter plätering. Fyra dagar efter plätering, MES celler blir igen. De visar en tillplattad utseende och förlust av definierade gränser, vilket indikerar att de börjar differentiera. Sådana celler är inte optimala för differentiering till neuronala celler.

Att differentiera MES celler i motoriska nervceller, MES celler måste odlas i suspension förhållanden för att möjliggöra EB bildas. I steg 2, är ES-celler överfördes till en kultur yta utan ett matarskikt för att främja bildningen EB. I detta steg är de inkuberas i Neural Differentiering medium kompletterat med noggin, bFGF, och FGF-8 i 2 dagar för att rikta celler till en neuralt härstamning. Små EB kan observeras under mikroskop vid dag 1 av differentiering. De bör vara flytande i mediet. Överföring PMEF kan också hittas på dag 1av differentiering och måste avlägsnas. Dessa celler följa bakteriella rätter är så elimineras när EB passeras till en ny bakteriell maträtt. Sålunda, vid dag 2 av differentiering, bör få eller inga PMEF ses i odlingsskålen. I steg 3, fortsatt överföring av EBS nya rätter bör säkerställa att avlägsna eventuell kvarvarande PMEF. EB odlas i Motor Neuron differentiering (MND)-medium kompletterat med RA och SAG under 5 dagar för att differentiera cellerna i motoriska neuroner. Under kultur, EBS fortsätter att växa i storlek och kan ses med blotta ögat vid differentiering dag 3 ~ 4. Figur 1C visar mikroskopiska utseende EBS på differentiering dag 7. Till skillnad från de odifferentierade cellerna, EBS visar stark fluorescens på grund av uttryck av GFP. Dessa EB är optimalt differentierade och är redo för dissociation. Flödescytometri visade att 51% ± 0,8% av cellerna från den dissocierade EB hade differentieras till GFP-uttryckande celler 5. I 5 steg kultur these motoriska neuroner i närvaro av GDNF, CNTF, BDNF och NT3 resulterar i förlängning av långa axonala projektioner. Figur 1D visar utseendet av differentierade celler 2 dagar efter utstrykning av dissocierad EBS. Notera långa neuriter som sträcker sig från cell kroppar pläterade cellerna. Immunfluorescensfärgning visar att GFP + celler uttrycker pan-neuronala markör (neurofilament-medellång kedja) och två motoriska neuron specifika markörer (Islet-1 och kolinacetyltransferas, figur 2).

Figur 1
Figur 1. Differentiering av MES-celler i motoriska neuroner (bild modifierad från Wu et al. 5). A) Schema om differentiering protokollet från MES celler till motoriska nervceller. B) Odifferentierade celler MES bilda runda kolonier på toppen av en fibroblast-matarskikt. De har svag GFP-uttryck. C) MES celler separerades från matarskikt och Culturött på låg fastsättning rätter att bilda EBS. Under de första två dagarna av differentieringsprocessen, exponerades celler för 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF och 20 ng / ml FGF-8. Därefter sattes de inducerades att differentiera med 1 | iM retinsyra och 1 | iM sonic hedgehog-agonist SAG under 5 dagar. Differentierade MES celler uttryckte starkt GFP fluorescens. D) Efter 7-dagars differentiering var EB dissocierades och utströks på poly-DL-ornithine/laminin belagda plattor. De differentierade cellerna förlängd långa neurala processer efter 2 dagar i odling. Skalstreck = 200 nm. MN = motor neuron. B, C och D är ljusa fält bilder och B ', C och D' är motsvarande fluorescensbilder.

Figur 2
Figur 2. Karakterisering av MES-cellerna motomeuroner. Immunofluorescens-färgning för neurofilament medellång kedja (NF-M, röd), ChAT (röd) och Islet-1 (röd) sammanföll med GFP (grön) uttryckession. DAPI (blå) användes för att identifiera kärnor. Skalstreck = 50 pm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvaliteten av MES-celler är den mest kritiska parametern för effektiv generering av motomeuroner. MES celler måste odlas på PMEF att förhindra spontan differentiering. Tillsats av LIF hjälper till att upprätthålla de MES-celler i ett odifferentierat tillstånd. Som MES celler delar varje 12-15 h, odlingsmediet blir slut snabbt och måste bytas dagligen.

Effektiv aktivering av Shh reaktionsvägen är en kritisk parameter som krävs för att inducera motorneuron-specifikationen. Shh protein (R & D System) och Shh signalering agonister såsom Hh agonist HhAg1.3 (Curis, Inc.), purmorphamine (Calbiochem) och SAG (EMD Chemicals) har alla använts för att främja bildandet av motoriska neuroner 1-3 , 10,11. Vi fann SAG vara ett mer effektivt molekyl än purmorphamine att skilja cellerna mot en motor neuronala fenotyp 5. 1 till 2,5 M purmorphamine med 1 M RA gav aldrig en differentiering verkningsgrad på mer än 20%. Emellertidi våra händer en kombination av 1 | iM av RA och 1 pM av SAG gav en differentiering effektivitet av ca 25% i försök utan en neural induktion steg.

För att ytterligare förbättra differentiering effektivitet lägger vi en 2-dagars neural induktion steg innan motorn neuron specifikationen steg. Denna strategi tar fördel av det faktum att både Noggin och signalering FGF är avgörande för tidigt skede av neural induktion då embryonala cellerna först in i neurala linjen 6-9. Förutom neural induktion, hävdar FGF signalering kulturer som neurala prekursorceller. Överexpression av FGF8 i u mitthjärnan leder till en dramatisk ökning av den neurala prekursor befolkningen i den ventrikulära zonen 12. En kombination av FGF och Noggin fungerar synergistiskt för att inducera nervvävnad bildas genom att främja en bakre neural identitet 9. Sålunda 2-dagars neural induktion steg är utformat för att rikta MES celler motneural linjen före initiering av processen för motorneuron specifikation.

Protokollet som beskrivs här är en modifiering och förstärkning av den etablerade ursprungliga protokollet som tidigare beskrivits 1. Även tidslinjen att generera motoriska nervceller är samma, har vi gjort ett antal ändringar för att effektivisera förfarandet och förbättra utbytet av motoriska nervceller. Genom att lägga till en neural induktion steg till differentiering protokollet kan vi öka differentiering effektivitet från 25% till 50%. Vår protokollet utgör ett effektivt tillvägagångssätt för att berika motoriska nervceller som härrör från MES celler. Motoriska nervceller inte kan erhållas från SMA patienter och dålig hälsa av primära motoriska nervceller från SMA möss utesluter isolering av celler i tillräcklig mängd, kvalitet och renhet för att utföra kvantitativa analyser av proteiner påverkas i denna sjukdom. Genom att använda denna MES cell protokoll kunde vi få en motor population neuroncellen tillräckligt Quanidentitet och renhet för en proteomic undersökning för att identifiera molekylära vägar påverkas i spinal muskelatrofi 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta manuskript är tillägnad minnet av Dr Wenlan Wang som gick bort den 26 maj 2011. Vi tackar dr Douglas A. Kerr för generöst tillhandahålla HBG3 MES celler som används i denna studie. Detta arbete har finansierats av Nemours, ett bidrag (2 RR016472-10) under INBRE programmet för National Center for Research Resources (NCRR) och en Cobre för beviljande av bidrag från NCRR (5 P20 RR020173-05) för att stödja Centrum för Pediatric Forskning vid Alfred I. duPont Barn-, Wilmington, Delaware, USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PMEF EMD Millipore PMEF-H N.A.
DMEM Invitrogen 11965-118 N.A.
FBS Invitrogen 16140-071 10%
L-glutamine Invitrogen 25030-081 1%
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15240-063 1%
DMEM Stem Cell Technologies 36250 N.A.
ES Cell-Qualified FBS Invitrogen 16141-079 15%
GlutaMax-I Invitrogen 35050-061 1%
Non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1%
Nucleosides EMD Millipore ES-008-D 1%
β-mercapt–thanol EMD Millipore ES-007-E 0.1 mM
Penicillin/streptomycin EMD Millipore TMS-AB2-C 1%
LIF EMD Millipore LIF2010 10 ng/ml
DMEM Stem Cell Technologies 36250 N.A.
ES Cult FBS Stem Cell Technologies 06905 15%
Non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1%
Mono-thio glycerol Sigma-Aldrich M-6145 1mM
Noggin Invitrogen PHC1506 50 ng/ml
FGF-8 Invitrogen PHG0274 20 ng/ml
bFGF Invitrogen PHG0024 20 ng/ml
ES-Cult Basal Medium-A Stem Cell Technologies 5801 N.A.
Knockout serum replacement Invitrogen 10828-028 10%
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 1%
ITS Supplement-B Stem Cell Technologies 07155 1%
Ascorbic acid Stem Cell Technologies 07157 1%
Penicillin/streptomycin EMD Millipore TMS-AB2-C 1%
GlutaMax-I Invitrogen 35050-061 1%
D-glucose Sigma-Aldrich G-8270 0.15% in d2H2O
Fibronectin Stem Cell Technologies 07159 5 μg/ml
Heparin Sigma-Aldrich H3149 20 μg/ml in d2H2O
β-mercapt–thanol EMD Millipore ES-007-E 0.1 mM
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R-2625 1 μM
SAG EMD Millipore 566660 1 μM
ES-Cult Basal Medium-A Stem Cell Technologies 5801 N.A.
Knockout serum replacement Invitrogen 10828-028 10%
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 1%
ITS Supplement-B Stem Cell Technologies 07155 1%
Ascorbic acid Stem Cell Technologies 07157 1%
Penicillin/streptomycin EMD Millipore TMS-AB2-C 1%
GlutaMax-I Invitrogen 35050-061 1%
D-glucose Sigma-Aldrich G-8270 0.15% in d2H2O
Fibronectin Stem Cell Technologies 07159 5 μg/ml
Heparin Sigma-Aldrich H3149 20 μg/ml in d2H2O
β-mercapt–thanol EMD Millipore ES-007-E 0.1 mM
BDNF R&D Systems 248-BD-005/CF 10 ng/ml
CNTF R&D Systems 257-NY-010/CF 10 ng/ml
GDNF R&D Systems 212-GD-010/CF 10 ng/ml
NT-3 R&D Systems 267-N3-005/CF 10 ng/ml
N.A. = Non-applicable
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation
0.1% Gelatin Stem Cell Technologies 07903 N.A.
Poly-DL-ornithine Sigma-Aldrich P0421 0.1 mg/ml in d2H2O
Mouse laminin EMD Millipore CC095 2 μg/ml in PBS
0.25% Trypsin/EDTA Stem Cell Technologies 07901 N.A.
Accumax EMD Millipore SCR006 N.A.
N.A. = Non-applicable
Table 2. Reagents for coating and dissociation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
  2. Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
  3. Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
  4. Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
  5. Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
  6. McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
  7. Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
  8. Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
  9. Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
  10. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
  11. Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).

Tags

Stem Cell Biology Mus embryonala stamceller nervceller motoriska ryggmärg HB9 neurovetenskap retinsyra Sonic hedgehog Islet-1 kolinacetyltransferas.
Effektiv Differentiering av embryonala stamceller från mus till Motorneuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, C. Y., Whye, D., Mason, R. W.,More

Wu, C. Y., Whye, D., Mason, R. W., Wang, W. Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons. J. Vis. Exp. (64), e3813, doi:10.3791/3813 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter