Summary
Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen voor
Abstract
Microglia met ongeveer 12% van het totale cellulaire populatie in de hersenen van zoogdieren. Hoewel neuronen en astrocyten worden beschouwd als de belangrijkste celtypes van het zenuwstelsel, microglia een belangrijke rol spelen in de normale hersenfysiologie door het bewaken van weefsel voor vuil en ziekteverwekkers en onderhouden van homeostase in het parenchym via fagocytaire activiteit 1,2. Microglia worden geactiveerd tijdens een aantal van letsel en aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekte, traumatisch hersenletsel, en het zenuwstelsel infectie 3. Onder deze activerende voorwaarden, microglia verhogen hun fagocytische activiteit, ondergaan morpohological en proliferatieve veranderingen, en het actief scheiden reactieve zuurstof en stikstof soorten, pro-inflammatoire cytokines en chemokines, vaak het activeren van een paracriene of autocriene lus 4-6. Aangezien deze microglia responsen bijdragen aan de ziekte pathogenese in neurologische aandoeningen, onderzoek gericht op microglia is gerechtvaardigd.
Door de cellulaire heterogeniteit van de hersenen, is technisch moeilijk om voldoende microgliale monstermateriaal verkrijgen met hoge zuiverheid in in vivo experimenten. De huidige onderzoek naar de neuroprotectieve en neurotoxische functies van microglia vereisen een routine technische methode om consistent te genereren zuivere en gezonde microglia met voldoende rendement voor de studie. We presenteren, in tekst en video, een protocol om zuiver primaire microglia isoleren van gemengde glia culturen voor een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen. Kortom, deze techniek maakt gebruik van gescheiden hersenweefsel van neonatale rat pups te produceren gemengde gliale celculturen. Na de gemengde gliale culturen te bereiken confluentie, worden primaire microglia mechanisch geïsoleerd van de cultuur door een korte duur van schudden. De microglia worden geplaat bij hoge zuiverheid voor experimenteel onderzoek.
Het principe en het protocol van deze methodiek zijnbeschreven in de literatuur 7,8. Daarnaast zijn alternatieve methoden voor het primaire microglia isoleren goed 9-12 beschreven. Gehomogeniseerde hersenweefsel kan worden gescheiden door dichtheid gradiënt centrifugatie de primaire microglia 12 opleveren. De centrifugeren is gemiddelde lengte (45 min) en kan cellulaire schade en activering, alsmede, veroorzaken verrijkte microglia en andere cellulaire populaties. Een ander protocol is gebruikt om primaire microglia isoleren verschillende organismen bij langdurige (16 uur) schudden terwijl in cultuur 9-11. Na schudden, wordt de media supernatant gecentrifugeerd om microglia te isoleren. Deze langere twee-staps isolatie methode kan ook verstoren microgliale functie en activering. We voornamelijk gebruik maken van de volgende microglia isolatie-protocol in ons laboratorium voor een aantal redenen: (1) primaire microglia te simuleren in vivo biologie meer trouw dan vereeuwigd knaagdieren microglia cellijnen, (2) Nominale mechanische verstoring zo min mogelijk cellulaire disfunctie of activatie en (3) een voldoende opbrengst kan worden verkregen zonder passage van de gemengde gliale celculturen.
Het is belangrijk op te merken dat dit protocol hersenweefsel maakt gebruik van de neonatale rat pups te isoleren microglia en dat het gebruik van oudere ratten te isoleren microglia kan aanzienlijk het rendement, activering status, en functionele eigenschappen van geïsoleerde microglia beïnvloeden. Er is bewijs dat ouder is verbonden met microglia disfunctie, verhoogde neuroinflammatie en neurodegeneratieve aandoeningen, hebben tot nu eerdere studies gebruikt ex vivo volwassen microglia beter inzicht in de rol van microglia in neurodegeneratieve ziekten is waar veroudering belangrijke parameter. Echter, ex vivo microglia niet in cultuur gehouden worden voor langere tijd. Hierdoor wordt in dit protocol wordt de levensduur van primaire microglia in cultuur moet worden opgemerkt dat de microglia d gedragenifferently van volwassen microglia en in vitro studies dient zorgvuldig te worden overwogen wanneer vertaald naar een in vivo setting.
Protocol
1. Dissectie van neonatale rat hersenweefsel
- Chill Leibovitz L-15 geconditioneerde media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% pen / strep) tot 4 ° C. Warm kweekmedia (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine) tot 37 ° C. Bereid 4 60x15 mm petrischaaltjes met 4-5 ml van de geconditioneerde L-15 media op ijs. Steriliseer alle chirurgische instrumenten met 100% ethanol.
- Spoel de P2 neonatale rap pups met 70% ethanol. (Neonatale jonge ratten tussen de P1-P5 kan gebruikt worden in dit protocol.)
- Snel onthoofden een rat pup met steriele scherpe schaar en onmiddellijk vallen de kop in 70% ethanol. Herhaal dit voor een totaal van 5 jonge ratten vervolgens over kop in de zoutoplossing.
- Verwijder de hele hersenen van de hoofden en plaats in een petrischaal met 4 - 5 ml L-15 oplossing (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) op ijs.
- Herhaal de procedures 1,2 tot 1,4 voor de overige pups in het nest.
- Verwijder de hersenvliezen van de hersenen en overdragen van de desIRED hersenweefsel (dat wil zeggen, cortex, cerebellum, hele hersenen, enz.) in een nieuwe petrischaal met 4-5 ml L-15 oplossing (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) op ijs.
2. Voorbereiding van de Gemengde glia cel Bevolking
- Zonder schadelijke hersenweefsel met een schaar of een mes, over te dragen het weefsel met een 10 ml pipet op een steriele 50 ml conische buis.
- Centrifugeer conische bij 2.500 RCF gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Zuig bovenstaande vloeistof. Voeg 4-5 ml vers L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Pipetteer weefsel op en neer 10 keer met een steriele pipet van 10 ml.
- Plaats een cel zeef (100 um poriën) op een verse 50 ml conische buis. Pipetteer weefsel en neer eenmaal met een steriele 5 ml pipet en met de pipet vlak in de cel zeef, afgezien van het materiaal door de cel zeef in de conische buis.
- Spoel de cel zeef met 4-5 ml vers L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Centrifugeer conische met gespannen cellen 2500 RCF gedurende 5 min bij 4 ° C.
3. Plating en onderhoud van de Gemengde glia cel culturen
- Voor elke rat brain pup verwerkt bereiden 1 steriele T-75 kolf door 12 ml kweekmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine) in elke kolf.
- Zuig het supernatans van de gepelleteerde cellen en voeg 5-6 ml van de cultuur media om de cel pellet. Pipetteer en neer 10 keer met 10 ml pipet.
- Breng een gelijk volume celsuspensie elk T-75 fles.
- Incubeer flessen in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C in totaal 1-3 weken.
- Kolven moet eerst gedurende 5 dagen en op de vijfde dag het kweekmedium vervangen in elke kolf met 12 ml vers medium en teruggaan naar de incubator. Vervolgens elke 3 dagen vervangen geconditioneerde media in elke kolf met 12 ml vers medium tot confluentie bereiken. Dit moet te doenne zorgvuldig zonder contact met de bodem van de flessen waarin de cellen hechten.
4. Isolatie en beplating van primaire Microglia
- Na het gemengde gliale culturen zijn volledig confluent, verwijder flessen uit de incubator en bedek fles caps met parafilm om de gasuitwisseling te voorkomen met omgevingslucht.
- Schudkolven 100 rps (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Verzamelen media uit flessen met een 10 ml pipet zonder dat de astrocyten laag op het oppervlak kolf. Plaats de media in 50 ml conische buizen. Voeg verse media om de kolven en terug te keren kolven op de incubator.
- Centrifugeer conisch bij 2500 RCF gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Zuig supernatant van alle conisch. Celpellets zijn hoge zuiverheid microglia cellen. Hersuspenderen pellets in 1 ml microglia plating media (DMEM + 10% FES + 1% penicilline / streptomycine).
- Tel de celdichtheid in de geresuspendeerde media meteen hemocytometer.
- Voeg een zodanige hoeveelheid van microglia plating media om een 2 x 10e5 cellen per ml dichtheid te bereiken. Plaat geschikt voor experimentele analyse.
- Laat microglia een nacht aan te sluiten.
5. Representatieve resultaten
Het protocol hierboven beschreven resulteert in een hoge zuiverheid primaire microglia culturen. Zoals bepaald door immunohistochemie voor een macrofaag / microglia cel-specifieke marker (Iba1), vergulde microglia culturen zijn> 90% zuiver (figuur 2). Daarnaast kleuring voor astrocyten, oligodendrocyten en neuron-specifieke markers demonstreert minimale vervuiling (figuur 2). Na de oprichting van gemengde gliale celculturen, kan microglia worden geïsoleerd door schudden tot 4 opeenvolgende keer. De eerste microglia isolatie levert ongeveer 2,2 x 106 cellen / ml of circa 9 miljoen cellen per 10 kolven en de verwachte opbrengst afneemt met de opeenvolgende shake. Microglia geïsoleerd met behulp van deze methode zijn met succes gebruikt om de fagocytose vermogen, functie zoals stikstofoxide productie, en neuronale toxiciteit (figuur 3) 13-14 onderzoeken.
Figuur 1. Overzicht van het protocol voor het bereiden van gemengde gliale celculturen en isolatie van primaire microglia.
Figuur 2. Isolatie van hoge zuiverheid microglia, zoals bevestigd door immunohistochemische analyse met behulp van microglia (IBA-1, rood), astrocyten (GFAP, groen), neuron (Neun, rood) en oligodendrocyt (CC1, rood) specifieke markers. Kleuring voor DNA van cellen in kweek met DAPI (blauw) wordt ook getoond.
Figuur 3. Microglia geïsoleerd in de methode described zijn in een aantal analyses, inclusief maar niet beperkt tot fagocytose assays, functie assays en neurotoxiciteit. In deze studies hebben wij gevonden dat microglia (IBA-1 positieve, groen), bij blootstelling aan controle (A) of LPS (B) behandeld media hun fagocytose van fluorescent gemerkte latex bolletjes (rood), die kan worden gekwantificeerd verhogen ( C). Verder kan LPS (1ng/ml) behandeling verhogen stikstofmonoxide microglia (D). Tot slot, via zowel transwell insert-gescheiden of direct microglia-neuron culturen, hebben we ontdekt dat microglia geïncubeerd met LPS kan neuronale celdood zoals gemeten door lactaat dehydrogenase (LDH) release (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel dit protocol wordt routinematig gebruikt om zuivere en gezonde microglia voor onderzoek experimenten te produceren, zal een zorgvuldige afweging van technische aspecten tijdens de kritieke delen van de procedure de variabiliteit te minimaliseren in de geïsoleerde microglia. In de eerste plaats tijdens de dissectie van het hersenweefsel van de neonatale rat, pups, het werken in een tijdig is nodig om hypoxische en ischemische schade aan het weefsel te minimaliseren. Het is echter ook belangrijk de meningitis bekleding volledig uit de hersenen tijdens ontleding, omdat de aanwezigheid van vliezen draagt aanzienlijk fibroblast vervuiling door de snelle proliferatiesnelheid onder deze kweekomstandigheden.
Ten tweede, voorzichtige behandeling van het weefsel materiaal tijdens de voorbereiding van de gemengde gliale celculturen is ook belangrijk te beperken cel schade, overlijden, of overmatige microgliale activatie. Bij het toevoegen van kweekmedia, moet erop worden gelet dat niet schadelijk voor de astrocyten maand.olayer. Bovendien kan schudden de kolven gedurende microglia isolatie instellen van de frequentie van schudden nodig zijn klotsen of de vorming van luchtbellen in de media te voorkomen. Deze gebeurtenissen kunnen verhogen astrocyten verontreiniging of ervoor zorgen dat cellen schade aan de culturen. Bij de ontwikkeling van deze techniek in het laboratorium, kan het nodig zijn om te beginnen met lage sterkte fysische schudden (bijv. 100 rpm) en de celkweek en supernatant van microscopie acht te stijgen schudden kracht en duur om de gewenste opbrengst microglia verkrijgen zonder astrocyten verontreiniging.
Een andere overweging bij de optimalisering van dit protocol in het laboratorium is het bepalen van de duur van de tijd gemengde gliale celculturen dient te worden gehandhaafd voor het isoleren van primaire microglia voor plating. De initiële isolatie kan ontstaan door 1 tot 3 weken na cultuur inrichting wordt de confluentie van microglia de astrocyten monolaag verschillen en kan inFluence microgliale biologie in downstream experimenten. Bovendien kan na isolatie van dezelfde gemengde gliacellijn cultuur moet worden gebaseerd op de confluentie van de cultuur in vergelijking met een bepaalde duur tussen schudden procedures. Verder, aangezien de opbrengst van daaropvolgende isolatie af is belangrijk de cellulaire eigenschappen van de primaire microglia kan verschillen van eerst de laatste isolatie. Daarom moet experimenten worden uitgevoerd in technische repliceert met een zorgvuldige notatie van wanneer microglia worden geïsoleerd.
Tot slot kan terwijl dit protocol bespreekt microgliale isolatie van rattenpup hersenen, succesvolle isolatie van microglia ook worden bereikt met behulp van muizen en andere zenuwweefsel, zoals ruggenmerg. Geen significante wijziging van het protocol noodzakelijk is voor deze alternatieve microglia bronnen, buiten het verhogen van de oorspronkelijke beplating rantsoen voor de gemengde culturen (dat wil zeggen, 2 muis brains/T75 fles of 3-4 spinale cords van P2 rat pups/T75 kolf). Bovendien, zoals verwacht, celopbrengst neiging te dalen volgens de gereduceerde uitgangsmateriaal. Echter, ondanks het verkrijgen van lagere opbrengsten van het gebruik van de muis hersenweefsel, is een groot voordeel de mogelijkheid om de moleculaire mechanismen van microglia fysiologie en reactiviteit met behulp van hersenweefsel van transgene muizen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Gefinancierd door de intramurale programma aan de geüniformeerde diensten Universiteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
