Summary
בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial העיקריות
Protocol
1. דיסקציה של רקמת מוח החולדה ילודים
- L-15 צ'יל של ליבוביץ בתקשורת ממוזגים (ליבוביץ L-15 + 0.1% BSA + פן 1% / דלקת) עד 4 ° C. התקשורת והתרבות חמים (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) ל 37 ° C. הכן 4 60x15 מ"מ צלחות פטרי עם 4-5 מ"ל של L-15 מדיה מותנה קרח. לעקר את כל כלי ניתוח עם אתנול 100%.
- יש לשטוף את הגורים-P2 ראפ היילודים עם אתנול 70%. (גורי עכברים היילודים בגילאי P1-P5 ניתן להשתמש בפרוטוקול זה.)
- עד מהרה לערוף עכברוש גור במספריים חדים סטריליים ושחרר את הראש מיד אתנול 70%. חזור עבור סכום כולל של 5 גורי עכברים מכן להעביר ראשי לתוך תמיסת מלח.
- הסר את המוח כולו מראשי ומניחים לתוך צלחת פטרי עם 4 - 5 מ"ל L-15 פתרונות (ליבוביץ' L-15 + 0.1% + 1% BSA פן / דלקת) על קרח.
- חזור על נהלים 1.2 - 1.4 עבור הגורים הנותרים המלטה.
- להסיר את קרומי המוח מהמוח ולהעביר desרקמת המוח ired (כלומר, קליפה, המוח הקטן, המוח כולו, וכו ') לתוך צלחת פטרי חדשה עם 4-5 מ"ל של תמיסת L-15 (ליבוביץ L-15 + 0.1% BSA + פן 1% / דלקת) על קרח.
2. הכנת אוכלוסייה מעורבת תא גלייה
- ללא פגיעה ברקמת המוח עם מספריים או סכין, להעביר את הרקמה עם פיפטה 10 מ"ל ל 50 מ"ל צינור סטרילי חרוטית.
- סרכזת חרוט על RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C.
- Aspirate supernatant. הוסף 4-5 מ"ל של L-15 מדיה טריים (ליבוביץ L-15 + 0.1% + 1% BSA פן / דלקת).
- רקמת פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה סטרילית 10 מ"ל.
- מניחים מסננת תא (100 הנקבוביות מיקרומטר) על צינור טרי 50 מ"ל חרוטית. רקמת פיפטה מעלה ומטה פעם אחת עם 5 מ"ל פיפטה סטרילית ועם פיפטה סומק כדי מסננת את התא, לוותר על החומר דרך מסננת לתוך התא צינור חרוטי.
- שוטפים את המסננת תא עם 4-5 מ"ל של L-15 מדיה טריים (ליבוביץ L-15 + BS 0.1%עט + 1% / דלקת).
- סרכזת חרוטי עם תאים מתוחים על RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C.
3. ציפוי ותחזוקה של מעורבות בתרביות תאים גליה
- לכל אחד במוח החולדה גור מעובד להכין 1 T-75 סטריליים קנקן ידי הוספת 12 מ"ל של תרבות המדיה (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) לתוך בקבוק אחד.
- Aspirate supernatant מתאי pelleted ולהוסיף 5-6 מ"ל של מדיה ותרבות כדי גלולה התא. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל.
- העברת נפח שווה של ההשעיה התא בקבוק T-75 כל אחד.
- דגירה צלוחיות של CO 2 באינקובטור 5% ב 37 ° C עבור סכום כולל של 1-3 שבועות.
- צלוחיות יש מודגרות 1 למשך 5 ימים, ביום החמישי, להחליף את התקשורת והתרבות בבקבוק כל אחד עם 12 מ"ל של התקשורת טריים ולחזור חממה. לאחר מכן, כל 3 ימים, להחליף את התקשורת מיזוג של כל אחד עם בקבוק 12 מ"ל של התקשורת טריים להשיג המפגש. זה חייב לעשותנה בזהירות בלי לגעת התחתונה של צלוחיות שבו התאים לצרף.
4. בידוד ציפוי של microglia ראשי
- לאחר תרבויות גליה מעורבים הם confluent לחלוטין, הסר צלוחיות של חממה ולכסות כמוסות קנקן עם parafilm למנוע חילוף הגזים עם האוויר הסביבתי.
- ללחוץ את צלוחיות ב 100 RPS (מסייע מעבדה SI-600, Jeio טק) עבור שעות 1 ב 37 ° C.
- לאסוף מדיה מכל צלוחיות עם פיפטה 10 מ"ל מבלי לשבש את שכבת astrocyte על פני הבקבוק. מניחים את צינורות התקשורת ב -50 מ"ל בצורת חרוט. הוסף מדיה טריים על צלוחיות וצפחות וחזרה חממה.
- סרכזת צינורות חרוטי ב RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C.
- Aspirate supernatant מכל צינורות דמויי קונוס. כדורי סלולריים הם גבוהים מיקרוגליה תאים טוהר. כדורי Resuspend ב 1 מ"ל של microglia ציפוי התקשורת (DMEM FES + 10% + 1% פניצילין / סטרפטומיצין).
- ספור את צפיפות התאים בתקשורת resuspended באמצעותhemocytometer.
- להוסיף נפח מתאים של התקשורת מיקרוגליה ציפוי להשגת 2 x 10e5 תאים לכל צפיפות מ"ל. צלחת בהתאם לניתוח ניסיוני.
- אפשר microglia לצרף לילה.
5. נציג תוצאות
הפרוטוקול שתואר לעיל התוצאות גבוהות תרבויות טוהר העיקריים מיקרוגליה. כפי שנקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה לסמן מקרופאג / microglia תאים ספציפיים (Iba1), מצופה תרבויות מיקרוגליה הם> טהור 90% (איור 2). בנוסף, מכתים עבור סמנים סלולריים astrocyte, oligodendrocyte ו נוירונים ספציפיים מדגים זיהום מינימלי (איור 2). לאחר הקמת מעורבות בתרביות תאים גליה, microglia יכול להיות מבודד על ידי ניעור עד 4 פעמים רצופות. הבידוד הראשונית microglia תניב כ -2.2 x 106 תאים למ"ל או כ -9 מיליון תאים לכל 10 צלוחיות והתשואה הצפויה יורדת עם כל שא ברציפותקה. Microglia מבודדים בשיטה זו נעשה שימוש בהצלחה לחקור היכולת phagocytosis, פונקציה כגון ייצור תחמוצת החנקן, רעילות עצבית (איור 3) 13-14.
באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול להכנת תערובת בתרביות תאים גליה ובידוד של microglia העיקרי.
איור 2. בידוד של microglia טוהר גבוהה אומת על ידי ניתוח immunohistochemical באמצעות microglia (איבא-1, אדום), astrocyte (GFAP, ירוק), תא עצב (NeuN, אדום) oligodendrocyte (CC1, אדום) סמנים ספציפיים. מכתים את ה-DNA של תאים בתרבית על ידי DAPI (כחול) מוצג גם.
איור 3. מבודד microglia ב שיטת descriבמיטה נעשה שימוש במספר מבחני, כולל אך לא רק, מבחני פאגוציטוזיס, מבחני תפקוד לימודי neurotoxicity. במחקרים אלה, מצאנו כי microglia (איבא-1 חיובי, ירוק), כאשר הם נחשפים לשליטה (א) או LPS (ב ') התקשורת שטופלו, להגדיל phagocytosis שלהם שכותרתו fluorescently חרוזים לטקס (אדום), אשר ניתן לכמת ( ג). יתר על כן, LPS (1ng/ml) הטיפול יכול להגביר את ייצור תחמוצת החנקן microglia (ד '). לבסוף, הן באמצעות הוספת transwell מופרד או ישירות microglia-נוירונים תרבויות, מצאנו כי microglia מודגרות עם LPS יכולות לגרום מוות של תאים עצביים, כפי שהיא נמדדת על ידי לקטט דהידרוגנז LDH () שחרור (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אמנם זה פרוטוקול מנוצל באופן שגרתי כדי לייצר microglia טהור ובריא ניסויים מחקריים, שיקול דעת מעמיק של ההיבטים הטכניים במהלך חלקים קריטיים של תהליך יהיה למזער משונות microglia מבודד. ראשית, במהלך דיסקציה של רקמת המוח מן הגורים חולדה היילודים, עבודה במועד הדרוש כדי למזער את הנזק ואת חוסר חמצן לרקמות איסכמי. עם זאת, חשוב גם להסיר לחלוטין את כיסוי meningeal מהמוח במהלך לנתיחה, כי נוכחות של קרומי המוח יתרום זיהום פיברובלסטים משמעותית בשל קצב התפשטות המהירה בתנאים תרבות.
הטיפול השני, עדין של החומר רקמות במהלך הכנת תרבית תאים מעורבת גליה כן, חשוב להגביל את הנזק התא, מוות, או הפעלת microglial מוגזמת. בעת הוספת התקשורת והתרבות, יש להיזהר לא לפגוע יום שני astrocyteolayer. בנוסף, וניערה את צלוחיות לבידוד microglia, התאמת תדירות רועד עשוי להיות נחוץ כדי למנוע משכשכים או היווצרות בועות אוויר בכלי התקשורת. אירועים אלה עשויות להגביר את זיהום astrocyte או לגרום נזק לתא התרבויות. בעת פיתוח הטכניקה הזו במעבדה, ייתכן שיהיה צורך להתחיל עם הרעידות כוח פיזי נמוך (למשל, 100 סל"ד) ולבחון את התרבות התאים על ידי מיקרוסקופ supernatant לפני הגדלת כוח רועד משך להשיג תשואה הרצויה של microglia ללא זיהום astrocyte.
שיקול נוסף במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה במעבדה הוא הקובע את משך זמן תרבויות מעורבות גליה סלולריים יש לשמור על בידוד לפני microglia העיקרי ציפוי. למרות הבידוד הראשונית יכולה להתרחש מ -1 עד 3 שבועות לאחר הקמת תרבות, confluency של microglia על monolayer astrocyte יהיה שונה, וייתכן כי בfluence ביולוגיה microglial בניסויים במורד הזרם. בנוסף, isolations הבאים מן התרבות תאים משולבים גם גליה אולי צריך להיות מבוסס על confluency של התרבות לעומת משך הזמן המצוין בין הליכי רועדות. יתר על כן, מאז תשואה של ירידות בידוד לאחר מכן, חשוב לציין את המאפיינים הסלולר של microglia העיקרי עשוי להיות שונה מן הראשון בבידוד האחרון. לכן, ניסויים צריך להתנהל טכנית משכפל עם סימון קפדני של microglia כאשר מבודדים.
לבסוף, בעוד פרוטוקול זה דן בידוד microglial מן המוח גור חולדה, בידוד מוצלח של microglia יכול גם להיות מושגת באמצעות עכברים העצבים ורקמות אחרות, כמו מיתרי השדרה. אין שינוי משמעותי בפרוטוקול הכרחי אלה מקורות חלופיים מיקרוגליה, מעבר להגדלת הקצבה ציפוי ראשוני תרבויות מעורבות (כלומר, 2 brains/T75 העכבר בקבוק או שיתוף השדרה 3-4RDS מהבקבוק עכברוש P2 pups/T75). בנוסף, כפי שניתן היה לצפות, תשואה התא נוטה להקטין בהתאם החל החומר מופחת. עם זאת, למרות התשואות הנמוכות קבלת משימוש רקמת המוח העכבר, יתרונו הוא היכולת לחקור את המנגנונים המולקולריים של microglia פיזיולוגיה תגובתיות באמצעות רקמת המוח של העכברים הטרנסגניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
ממומן על ידי תוכנית עירונית באוניברסיטת שירותי במדים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
