Summary
मस्तिष्क के सेलुलर विविधता है से प्राथमिक microglia अलग दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति में उनकी भूमिका की जांच करने के लिए आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल एक यांत्रिक अलगाव और मिश्रित सेल संस्कृति तकनीक है कि उच्च उपज और उच्च शुद्धता प्रदान करता है, व्यवहार्य के लिए प्राथमिक microglial कोशिकाओं का वर्णन
Protocol
1. नवजात चूहा मस्तिष्क के ऊतकों के विच्छेदन
- सर्द है लेबोविट्ज़ के एल -15 वातानुकूलित मीडिया (Leibowitz एल -15 + 0.1% BSA + 1% पेन / Strep) से 4 डिग्री सेल्सियस गर्म संस्कृति मीडिया (DMEM + 10% FBS + 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) 37 डिग्री सेल्सियस बर्फ पर वातानुकूलित एल -15 मीडिया के 4-5 मिलीग्राम के साथ 4 60x15 मिमी पेट्री डिश तैयार करते हैं. 100% इथेनॉल के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों जीवाणुरहित.
- 70% इथेनॉल के साथ p2 के नवजात रैप पिल्ले कुल्ला. (नवजात चूहे P1-P5 के बीच आयु वर्ग के पिल्ले इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है.)
- जल्दी से एक बाँझ तेज कैंची के साथ पिल्ला चूहे सिर काटना और सिर 70% इथेनॉल में तुरंत छोड़. 5 चूहा पिल्ले की कुल के लिए दोहराएँ तो नमकीन घोल में सिर हस्तांतरण.
- बर्फ पर 5 मिलीलीटर समाधान एल -15 (एल -15 Leibowitz + 0.1% BSA 1% + / पेन Strep) - सिर और एक पेट्री डिश में जगह के साथ 4 पूरे दिमाग से निकालें.
- कूड़े में शेष पिल्ले के लिए 1.4 1,2 प्रक्रियाओं को दोहराएँ.
- मस्तिष्क से तानिका निकालें और हस्तांतरण डेसएल 15 के समाधान के 4-5 मिलीग्राम के साथ एक नई पेट्री डिश में iRed मस्तिष्क के ऊतकों (यानी, प्रांतस्था, सेरिबैलम, पूरे दिमाग, आदि) (एल -15 Leibowitz + 0.1% BSA + 1% पेन / Strep) बर्फ पर.
2. मिश्रित Glial सेल जनसंख्या की तैयारी
- कैंची या एक ब्लेड के साथ हानिकारक मस्तिष्क के ऊतकों के बिना, एक बाँझ 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के लिए एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ ऊतक हस्तांतरण.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 आरसीएफ पर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र
- सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन). ताजा एल -15 मीडिया के 4-5 मिलीलीटर जोड़ें (Leibowitz एल -15 + 0.1% BSA + 1% पेन / Strep).
- विंदुक ऊपर ऊतक और एक बाँझ 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ नीचे 10 बार.
- एक ताजा 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब पर एक सेल छलनी प्लेस (100 माइक्रोन है pores). विंदुक ऊपर ऊतक और एक बाँझ 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ और सेल छलनी फ्लश विंदुक के साथ एक बार नीचे, शंक्वाकार ट्यूब में सेल झरनी के माध्यम से सामग्री बांटना.
- ताजा एल -15 मीडिया के 4-5 मिलीग्राम (सेल झरनी के साथ कुल्ला एल 15 + 0.1% बी एस LeibowitzA + 1% पेन / Strep).
- २,५०० आरसीएफ में तनावपूर्ण कोशिकाओं के साथ शंक्वाकार 4 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
3. और मिश्रित Glial सेल संस्कृति की चढ़ाना रखरखाव
- के लिए प्रत्येक चूहा पिल्ला मस्तिष्क संसाधित, संस्कृति मीडिया के 12 मिलीलीटर जोड़कर 1 बाँझ फ्लास्क-75 टी के लिए तैयार (DMEM + 10% FBS + 1 पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन%) प्रत्येक फ्लास्क में.
- महाप्राण (व्यंजन) pelleted कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला और सेल गोली संस्कृति मीडिया के 5-6 मिलीग्राम जोड़ने. विंदुक ऊपर और नीचे एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ 10 बार.
- प्रत्येक फ्लास्क टी 75 के लिए सेल निलंबन के एक बराबर मात्रा स्थानांतरण.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 सप्ताह के कुल के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में बोतल सेते हैं.
- बोतल पहले 5 दिनों के लिए incubated रहे जाना चाहिए, और पांचवें दिन पर, प्रत्येक फ्लास्क में ताजा मीडिया के 12 मिलीग्राम के साथ संस्कृति मीडिया और जगह इनक्यूबेटर में लौटने. तो, हर 3 दिन, संगम को प्राप्त करने के लिए ताजा मीडिया के 12 मिलीग्राम के साथ प्रत्येक फ्लास्क में वातानुकूलित मीडिया की जगह. यह करने के लिए किया जाना चाहिएपूर्वोत्तर बहुत ध्यान से बोतल जहां कक्षों देते तल को छू के बिना.
4. अलगाव और प्राथमिक microglia चढ़ाना
- मिश्रित glial संस्कृतियों के बाद पूरी तरह से मिला हुआ है, मशीन से बोतल को हटाने और parafilm साथ कुप्पी टोपियां के पर्यावरणीय हवा के साथ गैस विनिमय रोकने के कवर.
- 100 RPS (लैब कम्पेनियन एसआई-600, Jeio टेक) में बोतल 37 में 1 घंटे के लिए हिला डिग्री सेल्सियस
- एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ सभी बोतल से फ्लास्क सतह पर astrocyte परत में बाधा पहुँचा के बिना मीडिया लीजिए. 50 मिलीलीटर चोटीदार नलियों में मीडिया रखें. इनक्यूबेटर में बोतल और वापसी बोतल ताजा मीडिया जोड़ें.
- चोटीदार ट्यूबों २,५०० आरसीएफ का 4 पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- सभी चोटीदार ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन). सेल छर्रों उच्च शुद्धता microglia कोशिकाओं रहे हैं. Microglia चढ़ाना मीडिया (DMEM + 10% + FES 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) के 1 मिलीग्राम में resuspend छर्रों.
- Resuspended का उपयोग करते हुए मीडिया में सेल घनत्व गिनतीएक hemocytometer.
- मिलीलीटर घनत्व प्रति एक 2 x 10e5 कोशिकाओं को प्राप्त करने के microglia चढ़ाना मीडिया का एक उचित मात्रा में जोड़ें. प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त के रूप में प्लेट.
- Microglia रातोंरात संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
प्रोटोकॉल उच्च शुद्धता प्राथमिक microglia संस्कृतियों में परिणामों के ऊपर वर्णित है. के रूप में एक सेल है बृहतभक्षककोशिका / microglia विशिष्ट मार्कर (Iba1) के लिए immunohistochemistry द्वारा निर्धारित चढ़ाया microglia संस्कृतियों> 90% शुद्ध (चित्रा 2). इसके अतिरिक्त, अस्थिकणिका oligodendrocyte, और न्यूरॉन सेल विशिष्ट मार्करों के लिए धुंधला हो जाना कम से कम संदूषण (चित्रा 2) को दर्शाता है. मिश्रित glial सेल संस्कृतियों की स्थापना के बाद, microglia 4 लगातार बार झटकों से अलग किया जा सकता है. प्रारंभिक microglia अलगाव लगभग 2.2 x 106 कोशिकाओं / एमएल या लगभग 9 लाख 10 बोतल और उम्मीद की उपज प्रति कोशिकाओं एक के बाद एक शा के साथ कम हो जाती है उपज जाएगाके. इस विधि द्वारा अलग microglia सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है phagocytosis क्षमता, नाइट्रिक ऑक्साइड के उत्पादन के रूप में समारोह, और neuronal (चित्रा 3) विषाक्तता 13-14 की जांच की.
चित्रा 1 मिश्रित glial सेल संस्कृतियों और प्राथमिक microglia के अलगाव की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन.
चित्रा 2. उच्च शुद्धता के रूप में immunohistochemical microglia (आईबीए-1, लाल), अस्थिकणिका (GFAP, हरा), न्यूरॉन (NeuN, लाल) और oligodendrocyte का उपयोग विश्लेषण द्वारा सत्यापित microglia के अलगाव (cc1, लाल मार्कर) विशिष्ट. DAPI (नीला) द्वारा संस्कृति में कोशिकाओं के डीएनए के लिए धुंधला हो जाना भी दिखाया गया है.
चित्रा 3. Microglia विधि descri में पृथकबिस्तर सहित assays की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन सीमित करने के लिए, phagocytosis assays, समारोह assays के और न्यूरोटॉक्सिटी अध्ययन नहीं है. इन अध्ययनों में, हमने पाया है कि जब microglia (मोबाइल - एक सकारात्मक, हरा), को नियंत्रित करने के लिए उजागर (एक) या LPS (बी) इलाज मीडिया, fluorescently लेबल लाटेकस (लाल) मोती, जो मात्रा निर्धारित किया जा सकता है की उनके phagocytosis वृद्धि ( सी). इसके अलावा, LPS उपचार (1ng/ml) के microglia (डी) में नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन बढ़ा सकते हैं. अंत में, दोनों transwell डालने से अलग है या प्रत्यक्ष microglia न्यूरॉन संस्कृतियों के माध्यम से, हमने पाया है कि LPS साथ incubated microglia neuronal सेल मृत्यु को उत्पन्न के रूप में लैक्टेट (LDH) डिहाइड्रोजनेज रिहाई (ई, एफ) द्वारा मापा जा सकता है.
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Discussion
हालांकि इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से अनुसंधान प्रयोगों के लिए शुद्ध और स्वस्थ microglia उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है, प्रक्रिया के महत्वपूर्ण भागों के दौरान तकनीकी पहलुओं की सावधानी से विचार अलग microglia में परिवर्तनशीलता को कम कर देंगे. सबसे पहले, नवजात चूहे पिल्ले से मस्तिष्क के ऊतकों, एक समय पर फैशन में काम करने का विच्छेदन के दौरान hypoxic और इस्कीमिक ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए आवश्यक है. हालांकि, यह भी महत्वपूर्ण है के लिए पूरी तरह से विच्छेदन के दौरान मस्तिष्क से तानिका संबंधी कवर हटाने के कारण meninges की उपस्थिति महत्वपूर्ण fibroblast संस्कृति इन शर्तों के तहत उनके तेजी से प्रसार दर के कारण संदूषण के लिए योगदान देगा.
दूसरे, मिश्रित glial सेल संस्कृति की तैयारी के दौरान ऊतक सामग्री के कोमल से निपटने के भी कोशिका क्षति, मौत, या अत्यधिक microglial सक्रियण सीमा के लिए महत्वपूर्ण है. जब संस्कृति मीडिया जोड़ने, देखभाल करने के लिए astrocyte सोम नुकसान नहीं लिया जाना चाहिएolayer. इसके अतिरिक्त, जबकि microglia अलगाव के लिए बोतल मिलाते मिलाते हुए की आवृत्ति समायोजन के स्लोशिंग या मीडिया में हवा बुलबुले के गठन को रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है. इन घटनाओं तारिकाकोशिका संदूषण बढ़ाने के लिए या सेल संस्कृतियों के लिए नुकसान का कारण बन सकता है. जब प्रयोगशाला में इस तकनीक का विकास, यह कम शारीरिक शक्ति मिलाते (जैसे 100 आरपीएम) के साथ शुरू और मिलाते हुए बल और अवधि बढ़ाने अस्थिकणिका संदूषण के बिना microglia की एक वांछित उपज प्राप्त करने से पहले सेल संस्कृति और माइक्रोस्कोपी द्वारा सतह पर तैरनेवाला का पालन करना आवश्यक हो सकता है.
प्रयोगशाला में इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान एक और विचार समय मिश्रित glial सेल संस्कृतियों की अवधि निर्धारित है चढ़ाना के लिए प्राथमिक microglia अलग से पहले रखा जाना चाहिए. हालांकि शुरुआती 1-3 हफ्तों स्थापना के बाद संस्कृति से अलगाव हो सकता है अस्थिकणिका monolayer पर microglia की confluency अलग करने में हो सकता हैप्रभाव हैं अनुप्रवाह प्रयोगों में microglial जीव विज्ञान. इसके अतिरिक्त, एक ही मिश्रित glial सेल संस्कृति से बाद में isolations confluency संस्कृति के आधार पर करने की आवश्यकता के रूप में मिलाते हुए प्रक्रियाओं के बीच एक निर्दिष्ट अवधि की तुलना में हो सकता है. इसके अलावा, बाद अलगाव कम हो जाती है से उपज के बाद से, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें करने के लिए प्राथमिक microglia के सेलुलर गुण पहले से विभिन्न अंतिम अलगाव हो सकता है. इस प्रकार, प्रयोगों तकनीकी में आयोजित किया जाना चाहिए जब microglia अलग कर रहे हैं से सावधान अंकन के साथ प्रतिकृति.
अंत में, जबकि इस प्रोटोकॉल चूहा पिल्ला दिमाग, से microglia का सफल अलगाव microglial अलगाव की चर्चा भी रीढ़ की हड्डी डोरियों के रूप में चूहों और अन्य तंत्रिका ऊतक का उपयोग करते हुए हासिल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल के लिए कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन इन वैकल्पिक स्रोतों microglia के लिए आवश्यक मिश्रित संस्कृतियों के लिए प्रारंभिक चढ़ाना राशन (यानी, 2 माउस brains/T75 कुप्पी या 3-4 रीढ़ की हड्डी में सह में वृद्धि से परे हैP2 चूहा pups/T75 कुप्पी से ब्द). इसके अलावा, के रूप में की उम्मीद होगी, सेल उपज कम शुरू सामग्री के अनुसार में कमी जाता है. हालांकि, माउस मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करने से कम पैदावार प्राप्त करने के बावजूद, एक प्रमुख लाभ microglia शरीर क्रिया विज्ञान के आणविक तंत्र और ट्रांसजेनिक चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग जेट की जांच करने में सक्षम किया जा रहा है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
वर्दीधारी सेवाओं विश्वविद्यालय में अंदर का कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
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