Summary
Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per microgliali
Abstract
Conto Microglia per circa il 12% della popolazione cellulare totale nel cervello dei mammiferi. Mentre i neuroni e astrociti sono considerati i principali tipi di cellule del sistema nervoso, microglia svolgere un ruolo importante nella fisiologia normale del cervello attraverso il monitoraggio del tessuto per detriti e agenti patogeni e di mantenere l'omeostasi nel parenchima via 1,2 attività fagocitaria. Microglia vengono attivati nel corso di una serie di condizioni di pregiudizio e malattia, tra cui le malattie neurodegenerative, lesioni cerebrali traumatiche, e l'infezione del sistema nervoso 3. In queste condizioni attivanti, microglia aumentare la loro attività fagocitaria, subire una modifica morpohological e proliferativi, e attivamente secernono le specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto, pro-infiammatorie chemochine e citochine, spesso l'attivazione di un loop paracrino o autocrino 4-6. Come queste risposte microgliali contribuire alla patogenesi della malattia in condizioni neurologiche, ricerca incentrata sulla microglia è garantito.
A causa della eterogeneità cellulare del cervello, è tecnicamente difficile ottenere sufficiente materiale microglia campione con elevata purezza Durante gli esperimenti in vivo. La ricerca attuale sulle funzioni neuroprotettive e neurotossici di microglia richiedono un metodo di routine tecnica per generare costantemente microglia puro e sano con rendimento sufficiente per lo studio. Presentiamo, nel testo e video, un protocollo per isolare puro microglia primaria da colture miste glia per una varietà di applicazioni a valle. In breve, questa tecnica utilizza il tessuto cerebrale dissociata da ratti neonati per la produzione di colture miste di cellule gliali. Dopo le colture miste gliali raggiungano la confluenza, microglia primari sono meccanicamente isolato dalla coltura mediante una durata breve agitazione. Le microglia vengono quindi piastrate ad elevata purezza per studio sperimentale.
Il principio e il protocollo di questa metodologia sono statidescritto in letteratura 7,8. Inoltre, le metodologie alternative per isolare microglia primaria sono ben descritte 9-12. Tessuto cerebrale omogeneizzati possono essere separate mediante centrifugazione in gradiente di densità a cedere primaria microglia 12. Tuttavia, la centrifugazione è di lunghezza moderata (45 min) e può causare danni cellulari e attivazione, così come, causano arricchito microglia e altre popolazioni cellulari. Un altro protocollo è stato utilizzato per isolare microglia primaria in una varietà di organismi da prolungato (16 ore) agitando mentre nella cultura 9-11. Dopo aver agitato, il surnatante dei media viene centrifugato per isolare microglia. Questo metodo di isolamento più due fasi possono anche turbare la funzione e l'attivazione della microglia. Si utilizzano principalmente il seguente protocollo di isolamento microglia nel nostro laboratorio per una serie di ragioni: (1) primaria microglia simulare in biologia vivo più fedelmente rispetto alle linee di cellule microglia immortalati roditori, (2) Rottura nominale meccanica minimizza potenziale disfunzione cellulare o l'attivazione, e (3) resa sufficiente può essere ottenuta senza passaggio delle colture miste di cellule gliali.
È importante notare che questo protocollo utilizza tessuto cerebrale da ratti neonati per isolare microglia e che utilizzando ratti anziani isolare microglia possono influenzare notevolmente la resa, stato di attivazione, e le proprietà funzionali della microglia isolato. Ci sono prove che l'invecchiamento è collegato con disfunzione microglia, neuroinfiammazione aumentata e patologie neurodegenerative, studi precedenti hanno quindi utilizzati ex vivo adulti microglia per comprendere meglio il ruolo della microglia nelle malattie neurodegenerative in cui l'invecchiamento è importante parametro. Tuttavia, ex vivo microglia non possono essere mantenute in coltura per periodi di tempo prolungati. Pertanto, mentre questo protocollo prolunga la vita della microglia in coltura primaria, va osservato che la microglia comportarsi differently da adulto microglia e studi in vitro deve essere attentamente considerato quando tradotto in un ambiente vivo.
Protocol
1. La dissezione del tessuto neonatale cervello di ratto
- Freddo Leibovitz L-15 mezzi condizionati (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) a 4 ° C. Terreni di coltura caldi (DMEM + 10% FBS + 1% di penicillina / streptomicina) a 37 ° C. Preparare 4 60x15 mm piastre Petri con 4-5 ml del condizionato L-15 supporti su ghiaccio. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con il 100% di etanolo.
- Sciacquare i cuccioli P2 rap neonatali con il 70% di etanolo. (Cuccioli di ratto neonato di età compresa tra P1-P5 può essere utilizzato in questo protocollo.)
- Rapidamente decapitare un topo cucciolo con sterili forbici affilate e rilasciare la testa immediatamente in etanolo al 70%. Ripetere l'operazione per un totale di 5 cuccioli di ratto poi trasferire teste in soluzione salina.
- Rimuovere i cervelli interi dalle teste e posto in una capsula di Petri con 4 - 5 ml di soluzione L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) su ghiaccio.
- Ripetere le procedure di 1,2 - 1,4 per le restanti cuccioli nella cucciolata.
- Rimuovere le meningi dal cervello e trasferire il destessuto cerebrale IRED (cioè, corteccia, cervelletto, cervello intero, ecc) in una capsula Petri nuovo con 4-5 ml di soluzione di L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA 1% + Pen / Strep) su ghiaccio.
2. Preparazione mista popolazione di cellule gliali
- Senza danneggiare il tessuto cerebrale con le forbici o una lama, trasferire il tessuto con una pipetta 10 ml ad una sterile tubo da 50 ml.
- Centrifugare conico a 2.500 RCF per 5 min a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante. Aggiungere 4-5 ml di fresche L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Pipettare il tessuto su e giù per 10 volte con una pipetta sterile 10 ml.
- Mettere un filtro cella (100 pori micron) su un nuovo tubo da 50 ml. Pipettare tessuto su e giù una volta con un ml pipetta sterile 5 e con la pipetta a filo del filtro cella, erogare il materiale attraverso il filtro cella nel tubo conico.
- Sciacquare il filtro cella con 4-5 ml di fresche L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA Pen + 1% / Strep).
- Centrifuga conica con cellule tese a 2.500 RCF per 5 min a 4 ° C.
3. Placcatura e manutenzione di culture miste cellule gliali
- Per ciascun cervello di ratto cucciolo trasformati, preparare 1 T-75 sterili pallone aggiungendo 12 ml di coltura supporti (DMEM + 10% FBS + 1% di penicillina / streptomicina) in ciascuna beuta.
- Aspirare il supernatante dalle cellule pellettate e aggiungere 5-6 ml di terreni di coltura per il pellet cellulare. Pipettare su e giù per 10 volte con una pipetta 10 ml.
- Trasferire un ugual volume di sospensione cellulare per ogni T-75 pallone.
- Incubare matracci in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per un totale di 1-3 settimane.
- Cilindri devono essere prima incubate per 5 giorni, e il quinto giorno, sostituire i terreni di coltura in ciascun pallone con 12 ml di mezzo fresco e tornare alla incubatrice. Poi, ogni 3 giorni, sostituire i mezzi condizionati in ogni pallone con 12 ml di mezzi freschi per ottenere confluenza. Questo deve essere farene molto attentamente senza toccare il fondo dei cilindri in cui le cellule si attaccano.
4. Isolamento e placcatura di primaria Microglia
- Dopo misti culture gliali sono completamente confluenti, rimuovere fiaschi dall'incubatore e coprire i tappi pallone con parafilm per evitare lo scambio di gas con l'aria dell'ambiente.
- Agitare palloni a 100 rps (Companion Lab SI-600, Jeio Tech) per 1 ora a 37 ° C.
- Raccogliere i media da tutti i palloni con una pipetta 10 ml senza interrompere lo strato di astrociti sulla superficie pallone. Posizionare il supporto in provette da 50 ml. Aggiungi mezzi freschi ai fiaschi e fiaschi di ritorno alla incubatrice.
- Centrifugare tubi conici a 2.500 RCF per 5 minuti a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante da tutte le provette coniche. Pellets cellulari sono alte cellule microglia purezza. Pellet risospendere in 1 ml di placcatura mezzi microglia (FES DMEM + 10% + 1% di penicillina / streptomicina).
- Conta la densità delle cellule nei media risospeso utilizzandoun emocitometro.
- Aggiungere un volume appropriato di terreni in piastra microglia per ottenere un 2 x 10E5 cellule per densità di ml. Piastra come appropriato per l'analisi sperimentale.
- Lasciare microglia di allegare tutta la notte.
5. Risultati rappresentativi
Il protocollo descritto sopra i risultati in alte culture microglia purezza primarie. Come stabilito dal immunoistochimica per un macrofago / microglia marcatore della cella specifico (Iba1), placcati culture microglia sono> 90% (Figura 2). Inoltre, per la colorazione marcatori cellulari astrociti, oligodendrociti e neuroni specifici dimostra la contaminazione minima (Figura 2). Dopo aver stabilito miste colture di cellule gliali, microglia può essere isolato agitando fino a 4 volte successive. L'isolamento iniziale microglia produrrà circa 2,2 x 106 cellule / ml o circa 9 milioni di cellule per 10 palloni e il rendimento atteso diminuisce con ogni sha successiveke. Microglia isolato da questo metodo sono stati utilizzati con successo per indagare la capacità fagocitosi, funzione come la produzione di ossido nitrico, e la tossicità neuronale (Figura 3) 13-14.
Figura 1. Panoramica del protocollo per la preparazione di colture miste di cellule gliali e l'isolamento della microglia primaria.
Figura 2. Isolamento della microglia elevata purezza, come accertato mediante analisi immunoistochimica utilizzando microglia (Iba-1, rosso), astrociti (GFAP, verde), neurone (NeuN, rosso) e degli oligodendrociti (CC1, rosso) specifici marcatori. Colorazione per il DNA delle cellule in coltura di DAPI (blu) viene anche mostrato.
Figura 3. Microglia isolato nel metodo descriletto sono stati utilizzati in un certo numero di saggi, inclusi, ma non limitati a, saggi fagocitosi, saggi funzionali e studi di neurotossicità. In questi studi, abbiamo trovato che la microglia (Iba-1 positivo, verde), quando esposto a controllare (A) o LPS (B) supporti trattati, aumentare la fagocitosi di fluorescente perle di lattice (rosso), che possono essere quantificati ( C). Inoltre, LPS (1ng/ml) trattamento può aumentare la produzione di ossido nitrico in microglia (D). Infine, via sia Transwell insert-separati o diretti microglia-neuroni culture, abbiamo trovato che la microglia incubate con LPS possono indurre la morte delle cellule neuronali come misurato dalla lattato deidrogenasi (LDH) release (E, F).
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Discussion
Mentre questo protocollo viene normalmente utilizzato per produrre microglia puro e sano per esperimenti di ricerca, un attento esame degli aspetti tecnici durante parti critiche della procedura minimizzare la variabilità nel microglia isolato. In primo luogo, durante la dissezione di tessuto cerebrale di ratti neonati, lavorando in modo tempestivo è necessario minimizzare il danno ipossico ischemico e al tessuto. Tuttavia, è anche importante per rimuovere completamente il rivestimento meningeo dal cervello durante la dissezione, perché la presenza di meningi contribuirà alla contaminazione fibroblasti significativa a causa della loro velocità di proliferazione rapida in queste condizioni di coltura.
In secondo luogo, gentile manipolazione del materiale tessuto durante la preparazione della coltura mista cellule gliali è anche importante per limitare i danni delle cellule, la morte, o eccessiva attivazione della microglia. Quando si aggiungono terreni di coltura, si deve prestare attenzione a non danneggiare il mon astrocitiolayer. Inoltre, agitando i flaconi per l'isolamento microglia, regolando la frequenza di agitazione può essere necessario impedire sbattimento o la formazione di bolle d'aria nei media. Questi eventi possono aumentare la contaminazione astrociti o causare danni alle cellule alle culture. Nello sviluppo di questa tecnica in laboratorio, potrebbe essere necessario avviare con agitazione a bassa resistenza fisica (ad esempio 100 rpm) e osservare la coltura cellulare e surnatante mediante microscopia prima di aumentare la forza e la durata agitazione per ottenere una resa desiderata senza contaminazione di microglia astrociti.
Un'altra considerazione durante l'ottimizzazione di questo protocollo in laboratorio è la determinazione della durata del tempo di colture miste di cellule gliali deve essere sostenuto dinanzi isolamento microglia primaria per la placcatura. Mentre isolamento iniziale può verificarsi da 1 a 3 settimane post-coltura stabilimento, la confluenza della microglia sul monostrato astrociti differiscono e può influenza biologia microgliali in esperimenti a valle. Inoltre, isolamenti successivi della stessa coltura mista cellule gliali può essere necessario in base alla confluenza della cultura rispetto ad una durata specificata tra procedure agitazione. Inoltre, poiché il rendimento diminuisce successivo isolamento, è importante notare le proprietà cellulari della microglia primario può essere diverso dal primo all'ultimo isolamento. Così, gli esperimenti devono essere condotti in replica con la notazione tecnica accurata di quando microglia sono isolati.
Infine, mentre il protocollo descritto isolamento microglia da cervello di ratto pup, isolamento successo della microglia può anche essere ottenuta utilizzando topi e altri tessuti nervosi, come midollo spinale. Nessun cambiamento significativo per il protocollo è necessario per queste fonti alternative microglia, oltre ad incrementare la razione iniziale di placcatura per le colture miste (cioè, 2 mouse brains/T75 pallone o 3-4 co spinalerds di ratto P2 pups/T75 pallone). Inoltre, come prevedibile, resa cella tende a diminuire in conformità con il materiale di partenza ridotta. Tuttavia, nonostante ottenere rese più basse di utilizzare tessuto cerebrale mouse, uno dei principali vantaggi è la possibilità di studiare i meccanismi molecolari della microglia fisiologia e reattività utilizzando tessuto cerebrale di topi transgenici.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Finanziato dal programma intramurale presso l'Università Uniformed Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
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