Summary
Isolere primære microglia fra mobilnettet heterogenitet av hjernen er viktig å undersøke deres rolle i både fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokollen beskriver en mekanisk isolering og blandet cellekultur teknikk som gir høy avkastning og høy renhet, levedyktige primære microglial celler for
Abstract
Microglia utgjør ca 12% av den totale mobilnettet befolkningen i hjernen hos pattedyr. Mens nevroner og astrocytes anses de viktigste celletypene i nervesystemet, microglia spille en betydelig rolle i normal hjerne fysiologi ved å overvåke vev for rusk og patogener og opprettholde homeostase i parenchyma via phagocytic aktivitet 1,2. Microglia aktiveres under en rekke skader og sykdom forhold, herunder nevrodegenerativ sykdom, traumatisk hjerneskade, og nervesystemet infeksjon tre. Under disse aktiverende forholdene, microglia øke phagocytic aktivitet, gjennomgår morpohological og proliferativ forandring, og aktivt skiller reaktive oksygen og nitrogen arter, pro-inflammatoriske chemokines og cytokiner, ofte aktivere en parakrine eller autocrine sløyfe 4-6. Ettersom disse microglial svar bidra til sykdom patogenesen i nevrologiske tilstander, fokusert forskning på microglia er berettiget.
På grunn av den cellulære heterogenitet i hjernen, er det teknisk vanskelig å oppnå tilstrekkelig microglial prøvemateriale med høy renhet under in vivo eksperimenter. Aktuell forskning på de nervecellene og nevrotoksiske funksjoner microglia krever en rutine teknisk metode for å konsekvent generere ren og sunn microglia med tilstrekkelig kapasitet for studien. Vi presenterer i tekst og video, en protokoll for å isolere ren primære microglia fra blandede gliaceller kulturer for en rekke nedstrøms applikasjoner. Kort, benytter denne teknikken skilt hjernevev fra nyfødte rotteunger til å produsere blandede glial cellekulturer. Etter blandede glial kulturer nå confluency, er primære microglia mekanisk isolert fra kulturen ved en kort varighet av risting. De microglia blir deretter belagt med høy renhetsgrad for eksperimentell studie.
Prinsippet og protokoll av denne metodikken har værtbeskrevet i litteraturen 7,8. I tillegg er alternative metoder for å isolere primære microglia godt beskrevet 9-12. Homogenisert hjernevev kan separeres ved tettshetsgradient sentrifugering å gi primær microglia 12. Imidlertid er det sentrifugering av moderat lengde (45 min) og kan forårsake cellulær skade og aktivisering, samt, føre beriket microglia og andre cellulære populasjoner. En annen protokoll er blitt brukt til å isolere primær microglia i en rekke organismer ved lengre (16 t) ristet mens i kultur 9-11. Etter risting er media supernatanten sentrifugere å isolere microglia. Dette lenger to-trinns isolasjon metoden kan også måner microglial funksjon og aktivisering. Vi hovedsakelig benytte følgende microglia isolasjon protokoll i vårt laboratorium for en rekke årsaker: (1) primær microglia simulere in vivo biologi mer trofast enn udødeliggjorde gnager microglia cellelinjer, (2) Nominell mekanisk forstyrrelse reduserer potensialet cellulær dysfunksjon eller aktivering, og (3) tilstrekkelig avkastning kan oppnås uten passasje av de blandede glial cellekulturer.
Det er viktig å merke seg at denne protokollen bruker hjernevev fra nyfødte rotteunger å isolere microglia og at bruk av eldre rotter å isolere microglia kan ha betydelig innvirkning på avkastningen, aktivering status, og funksjonelle egenskaper av isolerte microglia. Det er dokumentert at aldring er koblet med microglia dysfunksjon, økt neuroinflammation og nevrodegenerative sykdommer, har så tidligere studier brukte ex vivo voksen microglia å bedre forstå den rollen microglia i nevrodegenerative sykdommer hvor aldring er viktig parameter. Imidlertid kan ex vivo microglia ikke holdes i kultur i lengre perioder av gangen. Derfor, mens denne protokollen forlenger livet til primære microglia i kultur, bør det bemerkes at microglia oppfører differently fra voksen microglia og in vitro studier bør vurderes nøye når oversatt til en in vivo setting.
Protocol
1. Disseksjon av Neonatal Rat hjernevev
- Chill Leibovitz L-15 klimaanlegg media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% penn / Strep) til 4 ° C. Varm kultur media (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin) til 37 ° C. Forbered 4 60x15 mm petriskåler med 4-5 ml av de betingede L-15 media på isen. Steriliser alle kirurgiske verktøy med 100% etanol.
- Skyll P2 neonatale rap unger med 70% etanol. (Neonatal rotteunger alderen P1-P5 kan brukes i denne protokollen.)
- Raskt halshugge en rotte valp med sterile skarp saks og slipp hodet umiddelbart inn 70% etanol. Gjenta for totalt 5 rotteunger deretter overføre hoder inn i saltvannsoppløsning.
- Fjerne hele hjernen fra hodene og fyll i en petriskål med 4 - 5 ml L-15 løsning (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% penn / Strep) på is.
- Gjenta prosedyrer 1.2 - 1.4 for de gjenværende valpene i kullet.
- Fjern hjernehinnene fra hjernen og overføre desired hjernevev (dvs. cortex, cerebellum, hele hjernen, etc.) i en ny petriskål med 4-5 ml av L-15 løsning (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% penn / Strep) på is.
2. Utarbeidelse av Mikset glial cellepopulasjon
- Uten å skade hjernevevet med saks eller en kniv, overføre vev med en 10 ml pipette til en steril 50 ml konisk rør.
- Sentrifuger konisk på 2500 RCF i 5 min ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten. Legg 4-5 ml av friske L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% penn / Strep).
- Pipette vev opp og ned 10 ganger med en steril 10 ml pipette.
- Plasser en celle sil (100 mikrometer porer) på en frisk 50 ml konisk rør. Pipette vev opp og ned en gang med en steril 5 ml pipette og med pipetten flush til cellen sil, dispensere materialet gjennom cellen silen i den koniske røret.
- Skyll cellen sil med 4-5 ml av frisk L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% penn / Strep).
- Sentrifuger konisk med anstrengt celler på 2500 RCF i 5 min ved 4 ° C.
3. Plating og vedlikehold av blandede glial Cellekulturer
- For hver rotte valp hjernen behandlet, forberede 1 sterile T-75 termos ved å legge 12 ml kultur media (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin) inn i hver kolbe.
- Aspirer supernatanten fra pelleterte cellene og tilsett 5-6 ml av dyrkningsmedier til cellen pellet. Pipettering opp og ned 10 ganger med en 10 ml pipette.
- Overfør et tilsvarende volum cellesuspensjon til hver T-75 kolbe.
- Inkuber kolber i en 5% CO 2 inkubator ved 37 ° C for en total av 1-3 uker.
- Kolber bør først inkubert i 5 dager, og på den femte dagen, erstatte dyrkingsmedier i hver flaske med 12 ml av ferske media og gå tilbake til inkubatoren. Deretter hver 3. dag, erstatter de betingede media i hver flaske med 12 ml fersk media for å oppnå samløpet. Dette må gjørene svært forsiktig uten å berøre bunnen av flaskene der cellene fester.
4. Isolering og plating av Primary microglia
- Etter blandede glial kulturer er helt konfluent, fjerne flaskene fra inkubatoren og dekker flasken caps med Parafilm å hindre gassutveksling med miljøvennlighet.
- Rist flaskene på 100 RPS (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) for en time ved 37 ° C.
- Samle media fra alle flasker med en 10 ml pipette uten å forstyrre astrocyte lag på kolben overflaten. Plasser media i 50 ml koniske rør. Legg friske media til kolber og retur flakonger til inkubatoren.
- Sentrifuger koniske rør på 2500 RCF i 5 min ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten fra alle koniske rør. Cell pellets er høy renhetsgrad microglia celler. Resuspender pellets i 1 ml av microglia plating media (DMEM + 10% FES + 1% Penicillin / Streptomycin).
- Tell celletetthet i resuspendert medier meden hemocytometer.
- Legg en passende mengde microglia plating media for å oppnå en 2 x 10e5 celler per ml tetthet. Plate som passer for eksperimentell analyse.
- Tillat microglia å feste natten.
5. Representative Resultater
Protokollen beskrevet ovenfor resulterer i høy renhetsgrad primære microglia kulturer. Som bestemmes ved immunhistokjemi for en makrofag / microglia celle spesifikk markør (Iba1), gullbelagte microglia kulturer er> 90% ren (figur 2). I tillegg farging for astrocyte, oligodendrocyte og neuron celle spesifikke markører viser minimal forurensning (Figur 2). Etter etablering blandede glial cellekulturer, kan microglia isoleres ved å riste opp til 4 påfølgende ganger. Den innledende microglia isolert sett vil gi ca 2,2 x 106 celler / ml eller ca 9 millioner celler per 10 kolber og forventet avkastning reduseres med hver påfølgende shake. Microglia isolert av denne metoden har blitt brukt med hell for å undersøke fagocytose evne, funksjon, for eksempel nitrogenoksid produksjon, og neuronal toksisitet (figur 3) 13-14.
Figur 1. Oversikt over protokollen for å forberede blandede glial cellekulturer og isolering av primære microglia.
Figur 2. Isolering av høy renhet microglia som verifiseres ved immunhistokjemisk analyse med microglia (IBA-1, rød), astrocyte (GFAP, grønn), nevron (Neun, rød) og oligodendrocyte (CC1, rød) spesifikke markører. Farging for DNA av celler i kultur ved DAPI (blå) er også vist.
Figur 3. Microglia isolert i metoden beskrevetseng har blitt brukt i en rekke analyser, herunder, men ikke begrenset til, fagocytose analyser, funksjon analyser og nevrotoksisitet studier. I disse studiene, har vi funnet at microglia (IBA-1 positive, grønne), når de utsettes for kontroll (A) eller LPS (B) behandlet media, øke fagocytose av fluorescensmerkede latex perler (rød), som kan kvantifiseres ( C). Videre kan LPS (1ng/ml) behandling øke nitrogenoksid produksjonen i microglia (D). Til slutt, via både transwell insert-separert eller direkte microglia-Nevron kulturer, har vi funnet at microglia inkubert med LPS kan indusere neuronal celledød målt ved laktat dehydrogenase (LDH) release (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens denne protokollen er rutinemessig utnyttes til å produsere ren og sunn microglia for forskning eksperimenter, vil en nøye vurdering av tekniske forhold i løpet av kritiske deler av prosedyren minimere variasjonen i den isolerte microglia. Først under disseksjon av hjernevev fra nyfødte rotteunger, arbeider i tide er nødvendig for å minske hypoksisk og iskemisk skade på vev. Men det er også viktig å fullstendig fjerne meningeal dekker fra hjernen under disseksjon, fordi tilstedeværelsen av hjernehinnene vil bidra til betydelig fibroblast forurensning som skyldes deres raske spredning sats under disse kultur forholdene.
Second, skånsom håndtering av vev materialet under forberedelsen av blandede glial cellekultur er også viktig å begrense celleskader, død, eller overdreven microglial aktivering. Når du legger kultur media, bør man sørge for å ikke skade astrocyte manolayer. I tillegg kan samtidig rister flaskene for microglia isolasjon, justere frekvensen av risting være nødvendig for å hindre sloshing eller dannelse av luftbobler i media. Disse hendelsene kan øke astrocyte forurensning eller forårsake celle skade på kulturer. Ved utvikling av denne teknikken i laboratoriet, kan det være nødvendig å starte med lav styrke fysisk risting (f.eks 100 rpm) og observere cellekultur og supernatanten ved mikroskopi før øke risting kraft og varighet for å oppnå en ønsket avkastning på microglia uten astrocyte forurensning.
En annen betraktning under optimalisering av denne protokollen i laboratoriet er å avgjøre hvor lenge blandede glial cellekulturer bør opprettholdes før isolere primære microglia for platekledning. Mens første isolasjon kan oppstå fra 1 til 3 uker etter kultur etablering, vil confluency av microglia på astrocyte monolayer forskjellig og kan iinnflytelse microglial biologi i nedstrøms eksperimenter. I tillegg kan de påfølgende isoleringer fra samme blandede glial cellekultur trenger å være basert på confluency av kulturen i forhold til en angitt varighet mellom rister prosedyrer. Videre, ettersom avkastningen fra påfølgende isolering reduseres, er det viktig å merke seg de cellulære egenskaper primære microglia kan være forskjellig fra første til siste isolasjon. Derfor bør eksperimenter utføres i teknisk replikerer med nøyaktige beregninger av når microglia er isolert.
Endelig kan mens denne protokollen drøfter microglial isolert fra rotter pup hjernen, vellykket isolering av microglia også oppnås ved hjelp av mus og andre nervevev, som for eksempel ryggmargen. Ingen signifikant endring i protokollen er nødvendig for disse alternative microglia kildene, utover å øke den innledende platekledning rasjon for de blandede kulturer (dvs. to mus brains/T75 kolbe eller 3-4 spinal coRDS fra P2 rotte pups/T75 kolbe). I tillegg, som ville bli forventet, har en tendens celle avkastning å minske i samsvar med redusert utgangsmaterialet. Men til tross for få lavere avkastning fra å bruke mus hjernevev, er en stor fordel å kunne undersøke de molekylære mekanismene bak microglia fysiologi og reaktivitet hjelp hjernevev fra transgene mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Finansiert av egenutført programmet ved Uniformert Services University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
