Summary
Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri açıklar
Abstract
Memeli beyninde toplam hücresel nüfusunun yaklaşık% 12 için mikroglia hesabı. Nöronlar ve astrositler sinir sisteminin önemli hücre tipleri kabul edilirken, mikroglia enkaz ve patojenler için doku izlenmesi ve fagositik aktivite 1,2 ile parankiminde homeostazı koruyarak normal beyin fizyolojisi önemli bir rol oynamaktadır. Mikroglia nörodejeneratif hastalıklar, travmatik beyin hasarı ve sinir sistemi enfeksiyonu 3 de dahil olmak üzere yaralanma ve hastalık, bir dizi sırasında aktive edilir. Bu aktive edici koşullar altında, mikroglia, bunların fagositik aktiviteyi artırır morpohological ve proliferatif değişikliğe uğrar ve aktif reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin, pro-inflamatuar kemokinler ve sitokinler salgılar, genellikle bir parakrin veya otokrin döngü 4-6 aktive. Bu mikroglial yanıtları nörolojik koşullarda hastalığı patogenezine katkıda gibi, araştırma m odaklandıicroglia garantilidir.
Beynin hücresel heterojenite nedeniyle, in vivo deneyler sırasında yüksek saflıkta yeterli mikroglial örnek materyal elde etmek teknik olarak zordur. Mikroglia nöroprotektif ve nörotoksik fonksiyonları üzerine Mevcut araştırma tutarlı çalışması için yeterli verimi ile saf ve sağlıklı mikroglia üretmek için rutin bir teknik yöntem gerektirir. Biz, metin ve video, aşağı çeşitli uygulamalar için karışık glia kültürlerden saf primer mikroglia izole etmek için bir protokol mevcut. Kısaca, bu tekniğin karışık glial hücre kültürü üretmek için yenidoğan sıçanların yavrularının ayrışmış beyin dokusu kullanır. Karışık glial kültürler konfluent ulaştıktan sonra, primer mikroglia mekanik çalkalama kısa bir süre ile kültür izole edilir. Mikroglia sonra deneysel çalışma için yüksek saflıkta kaplanıyor.
Bu yöntemin prensibi ve protokol olduLiteratürde 7,8 tarif. Buna ek olarak, birincil mikrogliya izole etmek için alternatif bir yöntem de 9-12 tarif edilmektedir. Homojenize beyin doku primer mikroglia 12 verim yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile ayrılabilir. Ancak, orta boy santrifüjleme (45 dakika) ve hücre hasar ve aktivasyonu, aynı zamanda, zenginleştirilmiş mikroglia ve diğer hücre popülasyonları neden neden olabilir. Başka bir protokol kültürünün çalkalama 9-11 iken (16 saat) uzamış organizmalar çeşitli primer mikroglia izole etmek için kullanılmıştır. Çalkalandıktan sonra, süpernatan ortam mikroglia izole etmek için santrifüje tabi tutulur. Bu işlem iki aşamalı bir yöntem ayrıca izolasyonu mikrogliyal fonksiyonu ve aktivasyon karıştırmayı olabilir. Biz esas nedenlerle bir dizi için laboratuvar aşağıdaki mikroglia izolasyon protokolü kullanır: (1) primer mikroglia (2, daha sadık ölümsüzleştirdi kemirgen mikroglia hücre hatları daha vivo biyoloji simüle) Nominal mekanik bozulma potansiyeli hücresel disfonksiyon veya aktivasyon en aza indirir, ve (3) yeterli verim karışık glial hücre kültürlerinin geçiş olmadan elde edilebilir.
Bu protokol mikroglia yalıtmak için yenidoğan sıçanların yavrularının beyin dokusu kullanır ve mikroglia önemli ölçüde izole mikroglia verimi, aktivasyon durumu ve fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir izole etmek için büyük sıçan kullanarak bu dikkat etmek önemlidir. Yaşlanma mikroglia disfonksiyon, artmış nöro-inflamasyonu ve nörodejeneratif patolojileri ile bağlantılı olduğuna dair kanıtlar vardır, bu nedenle önceki çalışmalarda yaşlanmanın önemli bir parametre olduğu daha iyi nörodejeneratif hastalıklarda mikroglia rolünü anlamak için ex vivo yetişkin mikroglia kullandık. Bununla birlikte, ex vivo mikrogliya uzun süreler için kültür tutulması mümkün değildir. Bu protokolün bir kültürü primer mikroglianın ömrünü uzatır iken, bu nedenle, bu mikrogliya d davranırlar not edilmelidirin vivo ortamda bir tercüme ettiğimizde ifferently yetişkin mikroglia gelen ve in vitro çalışmalar dikkatle düşünülmelidir.
Protocol
1. Yenidoğan Rat Beyin Dokusu diseksiyonu
- Chill Leibovitz L-15 şartlandırılmış ortam (Leibowitz L-15 +% 0.1 BSA, 1 +% Pen / Strep) ile 4 ° C. Sıcak kültür ortamına (DMEM% 10 FBS + +% 1 penisilin / streptomisin) 37 ° C'ye kadar Buz üzerinde klimalı L-15 medya 4-5 ml 4 60x15 mm Petri kapları hazırlayın. % 100 etanol ile tüm cerrahi aletleri sterilize edin.
- % 70 etanol ile P2 yenidoğan rap yavrular durulayın. (P1-P5 arası Yenidoğan sıçan yavrularının bu protokolü kullanılabilir.)
- Hızla steril keskin bir makas ile yavru sıçan başını kesmek ve% 70 etanol içine hemen kafasını bırakın. 5 sıçan yavrularının toplam tekrarlayın sonra tuzlu su çözeltisi içine başlarını aktarmak.
- Buz üzerinde 5 ml L-15 solüsyonu (Leibowitz L-15 +% 0,1 BSA +% 1 Kalem / Strep) - 4 Petri içine başkanları ve yerden tüm beyinleri çıkarın.
- 1.4 çöp kalan yavrular için - prosedürleri 1.2 tekrarlayın.
- Beyin meninks çıkarın ve des aktarmakL-15 solüsyon 4-5 ml ile yeni bir petri içine ired beyin dokusu (yani, korteks, serebellum, tüm beyin, vb) (Leibowitz L-15 +% 0,1 BSA +% 1 Kalem / Strep) buz üzerinde.
2. Karışık Glial Hücre Nüfus hazırlanması
- Makas veya bıçakla zarar veren beyin dokusu olmaksızın, steril bir 50 ml konik tüp için 10 ml pipet ile doku aktarımı.
- 4 ° C sıcaklıkta 5 dk için 2500 RCF azından konik santrifüje
- Süpernatant aspire. Taze L-15 medya 4-5 ml ekle (Leibowitz L-15 +% 0,1 BSA +% 1 Kalem / Strep).
- Steril bir 10 ml pipetle Pipet doku yukarı ve aşağı 10 kez.
- Taze bir 50 ml konik boru üzerine bir hücre süzgecinden (100 mikron gözenek) yerleştirin. 5 ml steril bir pipetle ve hücre süzgecinden boşaltım pipet ile bir kez pipetle doku yukarı ve aşağı doğru, konik tüpe hücre süzgecinden malzemenin dağıtım.
- Taze L-15 ortam 4-5 ml (sahip bir hücre süzgecinden durulama Leibowitz L-15 +% 0.1 BSA +% 1 Pen / Strep).
- 4, 5 dakika boyunca 2500 RCF azından süzme hücreleri ile konik santrifüje ° C.
3. Karışık Glial Hücre Kültürleri Kaplama ve Bakım
- Her sıçan beyni yavru işleme için, kültür ortamı, 12 ml ilave edilerek 1 steril bir T-75 şişeye hazırlanması (DMEM% 10 FBS + +% 1 penisilin / streptomisin) her bir balona.
- Pelet hücrelerden süpernatan aspire ve hücre pelletini kültür medya 5-6 ml ekleyin. 10 ml lik bir pipet yardımıyla 10 kez aşağı yukarı Pipeti ve.
- Her bir T-75 balona hücre süspansiyonu eşit hacimde aktarın.
- 1-3 hafta olmak üzere toplam 37 ° C'de% 5 CO 2 inkübatörde matara inkübe edin.
- Flasks ilk 5 gün süre ile inkübe, ve beşinci gününde, taze ortam 12 ml ile, her şişe içinde kültür ortamı değiştirmek ve inkübatöre geri edilmelidir. Daha sonra, her 3 gün, birleştiği elde etmek için taze ortam 12 ml ile, her şişe içinde şartlandırılmış ortam yerini alır. Bu yapmanız gerekmektedirne çok dikkatli hücrelerinin tutunup matara alt dokunmadan.
4. İlköğretim mikroglia İzolasyon ve Kaplama
- Mikst glial kültürler tamamen konfluent olduktan sonra, inkübatör gelen şişeler kaldırmak ve çevresel hava ile gaz değişimi önlemek için parafilm ile şişesi kapakları kapsamaktadır.
- 37 1 saat için 100 rps (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) de matara çalkalayın ° C
- Şişeye yüzeyinde astrosit tabakası bozmadan 10 ml pipetle her şişe ortam Collect. 50 ml konik tüpler ortam yerleştirin. Inkübatöre matara ve dönüş matara taze Medya ekle.
- 4, 5 dakika boyunca 2500 RCF azından konik tüpler santrifüje ° C.
- Tüm konik tüpler süpernatanıyla aspire. Hücre peletler, yüksek saflıkta mikroglia hücrelerdir. Mikroglia kaplama ortam (DMEM +% 10 FES +% 1 penisilin / streptomisin) 1 ml Pastör pipetiyle peletleri.
- Kullanılarak tekrar süspanse edilir ortam içinde hücre yoğunluğu saymaBir hemositometre.
- Ml yoğunluğa başına 2 x 10e5 hücreler elde etmek için mikroglia kaplama ortam uygun bir hacmi ekleyin. Deneysel analiz için uygun Plate.
- Mikroglia gecede eklemek için izin ver.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Protokolü yüksek saflıkta ilköğretim mikroglia kültürlerde sonuçları yukarıda anlatılan. Gibi bir makrofaj / mikroglia hücre spesifik bir işaretleyici (Iba1) immünohistokimyasal olarak belirlenen, kaplama mikroglia kültürleri>% 90 saf (Şekil 2). Ayrıca, astrosit, oligodendrosit ve nöron hücresi spesifik marker için boyama minimal kontaminasyon (Şekil 2) göstermektedir. Karışık glial hücre kültürleri kurduktan sonra, arka arkaya mikrogliya 4 kat kadar çalkalama ile izole edilebilir. İlk mikroglia izolasyonu yaklaşık 2.2 x 106 hücre / ml veya 10 matara ve beklenen verimi yaklaşık 9 milyon hücre birbirini izleyen sha azalır verecektirke. Bu yöntem ile izole mikroglia fagositoz yeteneği, nitrik oksit üretimi gibi işleyen ve nöronal toksisite (Şekil 3) 13-14 araştırmak için başarıyla kullanılmaktadır.
Şekil 1. Karışık glial hücre kültürleri ve primer mikroglianın izolasyonu hazırlanması için protokol bakış.
Şekil 2. Olarak astrosit mikroglia (Iba-1, kırmızı), (GFAP, yeşil), nöron (Neun, kırmızı) ve oligodendrosit kullanılarak immünohistokimyasal analizi ile doğrulanmış yüksek saflıkta mikroglia İzolasyon (CC1, kırmızı) özgül belirteçler. DAPI (mavi) tarafından kültürdeki hücre DNA lekelenmesi de gösterilir.
Şekil 3. Mikroglia yöntemi tarif izoleyatağı da dahil olmak üzere bir dizi deneyler, in kullanılabilir, fakat deneyler fagositozunu, fonksiyon deneyleri ve nörotoksik çalışmaları, bunlarla sınırlı olmamak edilmiştir. Bu çalışmalarda, biz (A) veya LPS (B) tedavi medya, ölçülebilir floresan ile işaretlenmiş lateks boncuk (kırmızı), (onların fagositoz artırmak mikroglia (Iba-1 pozitif, yeşil), kontrol maruz kaldığında bulduk C). Bundan başka, LPS (1ng/ml) tedavisi mikroglia (D), nitrik oksit üretimi arttırır. Son olarak, transwell insert ayrılmış veya doğrudan mikroglia-nöron iki kültür yoluyla, biz laktat dehidrogenaz (LDH) sürümü (E, F) ile ölçülen LPS ile inkübe mikroglia nöronal hücre ölümüne sebep bulduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol rutin araştırma deneyleri için saf ve sağlıklı mikroglia üretmek için kullanılır iken, prosedürün kritik parçalar sırasında teknik yönlerini dikkatle düşünülmesi izole mikroglia değişkenliği en aza indirecektir. İlk olarak, zamanında çalışan yenidoğan sıçanların yavrularının beyin dokusu, diseksiyon sırasında doku hipoksik ve iskemik hasarı en aza indirmek için gereklidir. Ancak, meninksler varlığı bu kültür şartlarında hızlı çoğalma hızı nedeniyle önemli fibroblast kontaminasyon katkıda çünkü tamamen diseksiyonu sırasında beyinden meninksinden kaldırmak için de önemlidir.
Mikst glial hücre kültürü hazırlanması sırasında doku malzeme İkincisi, hassas taşıma hücre hasarı, ölüm veya aşırı mikroglial aktivasyon sınırlamak için de önemlidir. Kültür ortamı eklerken, bakım astrosit mon zarar için alınması gerekenolayer. Buna ek olarak, mikrogliya izolasyon için şişeler çalkalama çalkalama ile frekans ayarlarken sloshing ya da ortam içinde hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için gerekli olabilir. Bu olaylar astrosit kirlenme artırmak veya kültürlere hücre hasarına neden olabilir. Laboratuarda Bu tekniğin geliştirilmesi zaman, astrosit kirlenme olmadan mikroglianın istenen bir verim elde edilir çalkalama kuvveti ve süresi artan önce düşük mukavemetli fiziksel çalkalayarak (100 rpm örn.) ile başlar ve mikroskop ile hücre kültürü ve süpernatan gözlemlemek gerekli olabilir.
Laboratuvarda bu protokol optimizasyon sırasında başka bir dikkate zaman karışık glial hücre kültürlerinin süresini belirleyen kaplama için birincil mikroglia tecrit önce sağlanmalıdır. İlk izolasyon 1 ila 3 hafta sonrası kültür kuruluşundan oluşabilir iken, astrosit monolayer üzerine mikroglia konfluense farklı olabilir ve olacaktıraşağı deneylerde fluens mikroglial biyoloji. Çalkalama işlemler arasında, belirli bir süre ile karşılaştırıldığında Buna ek olarak, aynı karışık glial hücre kültürü gelen daha sonraki izolasyon kültür konfluent dayalı gerekebilir. Dahası, daha sonra izole azalmalar ile verim, çünkü bu primer mikroglianın hücresel özellikleri son izolasyonu için ilk farklı olabilir dikkat etmek önemlidir. Böylece, deneyler mikroglia izole zaman dikkatli gösterimi ile çoğaltır teknik yapılmalıdır.
Bu protokol yavru sıçan beyinlerinde, mikroglia başarılı izolasyondan mikroglial izolasyonu tartışır Son olarak, ayrıca omurilik gibi, fare ve diğer sinir doku kullanılarak elde edilebilir. Protokolüne anlamlı bir değişiklik karışık kültürler için ilk kaplama oranı (yani, 2 fare brains/T75 şişesi veya 3-4 spinal eş artan ötesinde, bu alternatif mikroglia kaynakları için gerekli olanP2 sıçan pups/T75 şişesi rds). Beklendiği gibi ek olarak, hücre verim azaltılmış başlangıç malzemesinin uygun olarak azaltma eğilimdedir. Ancak, fare beyin dokusu kullanılarak daha düşük verim elde rağmen, bir büyük avantajı moleküler mikroglia fizyoloji mekanizmaları ve transgenik farelerin beyin dokusu kullanarak reaktivite araştırmak mümkün ediliyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Üniformalı Hizmetleri Üniversitesi intramural programı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
