Summary
Vi viser den grundlæggende teknik til molekylær konstruere og udvikle syntetiske Adeno-associerede virus (AAV) genterapivektorer via DNA familie blanding. Desuden leverer vi generelle retningslinjer og repræsentative eksempler på udvælgelse og analyse af individuelle kimære capsider med forbedrede egenskaber på målceller i kultur eller i mus.
Abstract
Adeno-associerede virale (AAV) vektorer repræsenterer nogle af de mest potente og lovende køretøjer til terapeutisk human genoverførsel grund af en unik kombination af fordelagtige egenskaber 1. Disse omfatter apathogenicity de underliggende vildtype vira og de avancerede metoder til fremstilling af høj-titer, høj renhed og klinisk kvalitet rekombinante vektorer 2. En yderligere særlig fordel ved den AAV-systemet i forhold til andre vira er tilgængeligheden af et væld af naturligt forekommende serotyper, som afviger i væsentlige egenskaber endnu kan alle let konstrueres som vektorer under anvendelse af en almindelig protokol 1,2. Desuden har en række grupper, herunder vores egen nylig udtænkt strategier til at bruge disse naturlige virus som skabeloner til oprettelse af syntetiske vektorer, som enten kombinerer aktiver af flere input serotyper, eller der forbedrer egenskaberne ved et enkelt isolat. De respektive teknologier til at opnå disse mål are enten DNA familien blander 3, dvs fragmentering af forskellige AAV capsid gener efterfulgt af deres re-samling er baseret på partielle homologieme (typisk> 80% for de fleste AAV-serotyper), eller peptid display 4,5, dvs indsættelse af normalt syv aminosyrer i en eksponeret sløjfe af det virale capsid, hvor peptidet ideelt medierer re-målretning til en ønsket celletype. For at opnå maksimal succes, er begge metoder anvendes på en high-throughput fashion, hvor protokollerne er op-skaleret til at give biblioteker på omkring en million forskellige capsid varianter. Hver klon derpå omfatter en unik kombination af talrige parentale virus (DNA shuffling metode) eller indeholder en karakteristisk peptid i den samme virale rygraden (peptid display fremgangsmåde). Den efterfølgende sidste trin er iterativ udvælgelse af et sådant bibliotek på målceller for at berige for de enkelte capsider, der opfylder de fleste eller ideelt alle krav udvælgelsesprocessen. Sidstnævnte fortrinsvis kamines positivt tryk, såsom vækst på en bestemt celletype af interesse, med negativ selektion for eksempel fjernelse af alle capsider reagerer med anti-AAV-antistoffer. Denne kombination øger chancerne for, at syntetiske capsiderne overlevende valget matcher behovene i given applikation på en måde, der sandsynligvis ikke ville have fundet i noget naturligt forekommende AAV isolere. Her fokuserer vi på DNA-familien blander metode som teoretisk og eksperimentelt mere udfordrende af de to teknologier. Vi beskriver og demonstrere alle væsentlige skridt til generering og udvælgelse af blandet AAV biblioteker (fig. 1), og derefter drøfte de faldgruber og kritiske aspekter af protokollerne, at man skal være opmærksom på for at lykkes med molekylær AAV evolution.
Protocol
1. Fremstilling af plasmid sæt koder AAV-capsid Genes
- For at lette rutinemæssig fremstilling af tilstrækkelige mængder af de forskellige AAV capsid (cap) gener til efterfølgende DNA-shuffling, oprindeligt subklone disse gener i en fælles plasmidskelettet. Det er vigtigt at inkludere identiske flankerende sekvenser på> 20 nukleotider til senere anvendelse som primer bindingssteder for nested PCR og til kloning (fig. 2).
- Under anvendelse af passende primere (se tabel for eksempelvise primere til AAV5), PCR amplifikation ønskede cap-generne fra almindeligt tilgængelige AAV plasmider, der typisk indeholder AAV2 rep genet ved siden af hætten gen. Fordi PCR-produktet vil blive anvendt til standard kloning, ~ 1 ug oprenset produkt allerede er tilstrækkelig, og enhver konventionel PCR-protokol kan derfor anvendes.
- Fordøje det oprensede PCR-produkt (f.eks brug agarosegeloprensning eller en standard PCR Purification Kit) ogModtageren plasmid med restriktionsenzymer, hvis genkendelsessites er til stede i de anvendte primere til hætten amplifikation (1,1) såvel som i recipienten plasmidet. I vores laboratorium, bruger vi Pac I og ASC-stederne (fig. 2), som er fraværende i de fleste AAV'er.
2. DNase-baserede cap-genet Fragmentation
- PCR-amplifikation cap gener af valg fra de plasmider, der genereres i trin 1,1-1,3. En reaktion som beskrevet nedenfor vil give ~ 3 ug af PCR-produkt. Afhængigt af antallet af cap-generne, der skal medtages i biblioteket, for denne tilstrækkelig op til seks blanderummene reaktioner.
- For PCR, der er nedsat en 50 gl reaktionsblanding indeholdende 200 ng cap plasmid, hver primer på 2 pM slutkoncentration, 10 pi 5x Hifi buffer og 1 gl Hifi-polymerase. Begynde med 5 minutter ved 95 ° C og derefter køre 40 cykler af 15 sek 94 ° C, 30 sek 57 ° C og 3 min 68 ° C, efterfulgt af en afsluttende 10 minutter trin ved72 ° C. Rens PCR-produkterne via gel eller kit og derefter oprette en kontrolleret DNase digest til at skabe cap genfragmenter til genmontering i kimærer.
- Derfor, lige blande de forskellige cap PCR-produkter til et samlet beløb på 4 ug i 54 gl H 2 O. Tilsættes 6 pi DNase reaktionsbuffer og 0,5 pi DNase I til reaktionsblandingen omhyggeligt svirp tre gange, spin kortvarigt og straks sat på en 25 ° C varmeblok. Inkuber mellem 1 og 2 minutter (oprette flere parallelle reaktioner og afslutte dem i intervaller af 15 sekunder), og derefter stoppe reaktionen ved tilsætning af 6 gl 25 mM EDTA og ved kortvarigt hvirvelbehandling og inkubation 10 minutter ved 75 ° C.
- Oprense cap fragmenterne på en standard 1% agarosegel. Ideelt bør et udstrygningspræparat være mellem 100 og 500 basepar. Siden DNase I er en meget potent enzym, korrekt håndtering og timing er afgørende på dette trin, og flere variationer i inkubationstid i trin 2,3 kan være behov for optimale resÜLTS (fig. 3). Oprense eluerede DNA under anvendelse af en standard kit og bestemme dets koncentration.
3. DNA Family shuffling
- Første saml hætten fragmenterne i fuld-længde sekvenser via en PCR, i hvilken de selv-prime baseret på partielle homologier. Derfor er oprettet en 50 gl reaktion med 500 ng oprensede fragmenter (trin 2,4), 10 gl 10x Phusion buffer, 1 gl 10 mM dNTP'er, 1,5 gl DMSO og 0,5 gl Phusion II polymerase. Inkuber 30 sekunder ved 98 ° C og derefter køre 40 cykler af 10 sek 98 ° C, 30 sek 42 ° C og 45 sek 72 ° C, efterfulgt af en afsluttende 10 minutter ved 72 ° C.
- I en efterfølgende anden PCR, amplificere gensamlet cap-generne til efterfølgende kloning under anvendelse af primere, som binder til de konserverede flankerende sekvenser (fig. 2). Derfor etablere en 50 ul reaktionsblanding indeholdende 2 pi af den første PCR (trin 3.1), hver primer ved en slutkoncentration på 2 pM, 0,5 ul MgCl2,10 pi 5 x HiFi-puffer og 1 ul Hifi polymerase. Vi anbefaler at køre 16-24 PCR'erne at sikre tilstrækkeligt høje udbytter for efterfølgende kloning. Samle PCR'er og oprense fuld længde hætte bånd (gel eller kit).
- Fordøje det oprensede hætten genpulje med Pac I og Asc I for kloning i en replikations-kompetent AAV plasmid, der bærer AAV ITR'er (inverterede terminale gentagelser; replikation og pakning signaler) samt AAV2 rep-genet. Sidstnævnte bør følges op af de samme steder for at imødekomme hætten genpulje "i ramme" (se fig. 2 for detaljer). At opnå fuldstændig fordøjelse af PCR-produktet, inkuberes natten over med overskydende enzym.
- Ligere cap-fragmenter og det passende skæres AAV ITR / rep rygsøjlen ved et 3:1 molforhold. Foretag en 40 ul totalvolumen mastermiksens (tilstrækkeligt til 20 transformationer) med en endelig DNA-koncentration på 50 ng / ul og inkuber natten over ved 16 ° C.
- Omdanne ligeringsreaktion ved blanding (på is) 2 pi med 30 ul elektro-kompetente E. coli (vokset fra kommercielle celler og gjort kompetent hjælp af en standard-protokol). Tilsættes til præ-afkølede elektroporation kuvetter (1 mm mellemrum) på is. Elektroporere på 1,8 kV, 200 Ω og 25 uF. Tidskonstanten bør være tæt på 5 ms. Straks tilsættes 1 ml forvarmet SOC medium og overføres til en 250 ml kolbe. 20 sådanne elektroporeringer vil give et bibliotek med en mangfoldighed af ca 1x10 6 forskellige kloner.
- Tilsættes en mængde forvarmet SOC medium til de samlede transformationer og rystes ved 37 ° C og 180 rpm i 1 time. Derefter hente det totale volumen til 800 ml med LB-medium plus ampicillin (slutkoncentration på 50 ug / ml) og inkuberes i yderligere 16 timer under de samme betingelser. Oprense biblioteket plasmid-DNA ved hjælp af f.eks. en Qiagen Mega prep kit.
Valgfri ved trin 3,6: For at beregne den nøjagtige biblioteket mangfoldighed, plade en aliquot af 800 ml opløsning (før 16 h inkubation) på LB-ampicillin-plader (f.eks 10 ul af en 10 cm plade) og tælle kolonier næste dag. Også, at validere høje blanderummene effektivitet, sekvens fx 24 kloner og tilpasse dem til de forældre cap generne (se også fig. 8). Endelig, for at bekræfte bibliotek vitalitet og høj funktionel diversitet, underklon tilfældigt udvalgt cap gener i en AAV hjælper plasmid og bruge dem til at producere og analysere rekombinante vektorer i lille skala (fig. 4-5) (se også trin 5,4 nedenfor).
4. Produktion af virale bibliotek
- Seed 10 15 cm 2 retter HEK293T celler (4.5x10 6 celler / skål) og 48 timer senere transfektion med 220 mikrogram AAV biblioteket og 220 pg adenoviral plasmid (kræves for AAV formering). Derfor opvarme PEI (polyethylenimin) og 300 mM NaCI ved 37 ° C. Derefter blandes 7,9 ml NaCI og DNA, og tilsæt H2O til et samlet volumig på 15,8 ml. I et separat rør, blandes 3,52 ml PEI, 7,9 ml NaCI og 4,38 ml H2O (alle mængder i ti transfektioner). Kombiner de blandinger (vortex) og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur, før fordeling af opløsningen jævnt over skålene (3 ml per skål).
- Efter 48 h, skrabe cellerne i mediet, og rotere dem ned ved 1200 rpm i 15 min. Resuspenderes cellebundfaldet i 6 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,5, 50 mM NaHCO3) og underkastet 5 fryse-tø-cykler (-80 / 37 ° C). Inkuberes med 50 U benzonase per ml i 1 time ved 37 ° C, før spinding ned cellerester ved 3750 rpm i 20 min.
- Forbered 15%, 25% og 40% fortyndinger (med 2,5 gl / ml phenolred) fra en 60% iodixanol (OptiPrep i PBS-MK) stamopløsning i PBS-MK (1x PBS, 1 mM MgCl2, 2,5 mM KCI).
- Etablere en gradient for AAV oprensning ved hjælp af en Pasteur-pipette for at tilføje 5 ml virussuspension til en Beckman Quick Seal-centrifugeglas (14x89 mm) efterfulgt af 1,5 ml EACh på 15%, 25% og 40% iodixanol opløsning. Låget af gradienten med lysisbuffer.
- Ultracentrifuge ved 50.000 K i 2 timer ved 4 ° C i en Beckman Ti70.1 rotor. Derefter rengøres ydersiden af røret med 70% ethanol, stikke en nål ind i toppen af røret til ventilation og trække 1,2 ml af 40% iodixanol fraktion ved hjælp af en kanyle. Vær omhyggelig med at undgå at trække på 25%, fraktionen, da det indeholder tomme AAV-capsider.
5. Screening og udvælgelse
- På dette tidspunkt, kan man enten iterativt amplificere hele biblioteket i dyrkede celler eller dyr, indtil kimære capsider udviser ønskede egenskaber har vist sig (fig. 6-11).
- At vælge i dyrkede celler, co-inficere forskellige portioner af biblioteket (f.eks, 1, 10 og 100 pi) og adenovirus-5 til at understøtte AAV vækst. Afprøvning af flere varianter af biblioteket og adenoviral hjælper er vigtigt, da bibliotek infektivitet i en given celletype, kan ikke forudsiges. Høsteceller efter ~ 3 dage, ekstrahere amplificeres AAV via frysning-optøning, inaktivere Adenovirus i 30 minutter ved 56 ° C og re-inficere nye celler. Gentages op til 5 gange, indtil forskellige capsider bliver beriget (validere ved sekventering).
- Til selektion i dyr, der inficeres med biblioteket og ekstraher det ønskede væv eller celletype efter ~ 1 uge. Ikke co-inficeres med adenovirus, da dette vil forårsage uheldig toksicitet i dyr. Redde viralt DNA via PCR under anvendelse af de samme primere som før (fig. 2), re-klone hætten pool fremstille en frisk bibliotek og gentag indtil distinkte capsider bliver beriget (validere ved sekventering).
- De nøjagtige betingelser (volumen titer, rute) til udvælgelse in vivo vil afhænge af målvævet af interesse. For leveren, mus typisk inficeret med 1x10 11 til 1x10 12 virale partikler i et totalvolumen på 200 pi PBS via halevenen injektion (IV). Den begrænsende faktor er sædvanligvis den virale titer af original præparat, idet injektion af 1x10 12 AAV i 200 pi kræver en titer på mindst 5x10 12 / ml, som ikke alle labs kan rutinemæssigt opnås. Derfor, mens en maksimal titer er gavnligt for den første infektion (fordi biblioteket endnu ikke er blevet beriget for effektive capsider i et givent væv og kan således have en forholdsvis lav samlet infektivitet), vil vi anbefale at bruge mindst 1x10 11 partikler pr mus for leveren selektion.
- Hvis flere mus er tilgængelige, er det meget nyttigt at injicere forskellige partikelantal beslægtet med selektion i dyrkede celler, og at anvende flere mus per gruppe (og derefter slår de opsamlede leverne i hver gruppe) for at minimere variabilitet og øge succes rater, f.eks tre mus ved 1x10 11 og 3 mus ved 1x10 12 partikler.
- Da AAV er en ikke-patogen og replikation-inkompetente (uden hjælpervirus) virus, der ikke er nogen bivirkninger for at kigge efter i mangel af Adenovirus.
- For euthanization blev dyrene bedøvet under anvendelse af en isofluran fordamper og derefter aflivet via cervikal dislokation.
- De væv (lever i dette tilfælde) blev høstet efter dyrene blev bekræftet aflivet. I almindelighed er der ikke behov også andre væv til at perfundere dyrene eller til at høste AAV-inficerede organer før døden, idet AAV-DNA er stabilt og let kan reddes fra frosne celler / væv.
- At studere enkelt capsider (fra biblioteket (trin 3.6) eller efter selektion (trin 5,2-5,3)), frembringe AAV vektorer, der koder et reportergen (f.eks GFP 6) ved at følge trinene 4,1-4,5. Derfor klone hætten genet af interesse ind i en standard AAV-hjælperplasmidet 2. I trin 4.1,-tredobbelt transfektion af cellerne med 14,7 ug af hver af AAV vektor (der koder for reporter), AAV hjælper-og adenoviralt hjælper. Inficere dyrkede celler eller dyr med det rensede virus på forskellige beløb og beslutsomhedne transduktion effektivitet fx via FACS eller mikroskopi.
6. Repræsentative resultater
Anvendelse af protokollen beskrevet her resulterer typisk i virale biblioteker med en mangfoldighed af ca 1x10 6 unikke capsider, som derefter kan screenes for enkeltpartikler viser de fleste eller alle de ønskede egenskaber på en given cellelinie eller i dyr. I det følgende vil vi give repræsentative eksempler på resultaterne fra en sådan in vitro eller in vivo screeninger.
Forud for dette, men vi finder det vigtigt igen at påpege nytten af at analysere de enkelte kloner fra det oprindelige plasmid bibliotek for deres funktionalitet og mangfoldighed (valgfrit ved trin 3,6). Dette skyldes, at de to sidstnævnte parametre er yderste kritiske forudsætninger for succes for udvælgelse af den faktiske virale bibliotek, som er lavet af plasmidet biblioteket. Derfor kan man tilfældigt vælge enkelt blandescap-generne og anvender dem til at producere rekombinante AAV-vektorer (rå ekstrakter eller oprensede partikler, afhængigt af den ønskede grad af nøjagtighed), der udtrykker en let påviselig og målelig reportergen. En typisk assay til at sammenligne de forskellige capsid varianter derefter fluorescensmikroskopi, som vist i det repræsentative eksempel i fig. 4.
En alternativ fremgangsmåde er FACS-baseret måling af fluorescerende reporter-genekspression, som holder de ekstra fordele, at den også giver mulighed for bestemmelse af genekspression per celle, plus at det virker for suspensionsceller. Fig. 5 viser et typisk resultat af sådan en FACS-analyse af rå AAV vektor lysater på forskellige celletyper.
Idet den ovenfor beskrevne udvælgelse af individuelle cap-kimærer er tilfældig og begrænset, er det naturligvis ikke anvendelig som en egentlig fremgangsmåde til berigelse af ønskede kandidater. Stedet udvælgelse af VIRAL-bibliotek i målceller eller væv i dyr, er mere passende. Da betingelser og parametre vil variere med hver ansøgning, vil vi kun fremhæve nogle få repræsentative retningslinjer og resultater.
Den nemmeste valg er iterativ bibliotek forstærkning på dyrkede cellelinjer og primære celler (trin 5.2). Idet AAV kræver adenovirus-infektion for dens opformering, må målcellerne være modtagelige for adenovirus. Man kan derefter vokse og inficere dem fx i 6-brønds plader, der holder tilstrækkeligt antal celler per brønd for at sikre fuld dækning af biblioteket. Et andet vigtigt opfattelse er, at balancen mellem AAV og adenovirus er vanskelig, for meget AAV vil inhibere adenovirus, mens et overskud af sidstnævnte vil dræbe celler (i modsætning til AAV forårsager Adenovirus lytiske infektioner) før AAV'er kunne replikere.
Men da bibliotek infektivitet på en bestemt celletype er ukendt, finde "god" AAV: Adenovirus-forhold påsom både kan forplante kræver parallel prøvning af forskellige kombinationer af doser af biblioteket og det adenovirale hjælpeceller (f.eks 10:01, 01:01 og 01:10). Et godt mål for potent adenovirusinfektion er forekomsten af cytopatiske virkninger tre dage efter virusinokulering, vist ved celle afrunding og frigørelse, som det ses i fig. 6. Omvendt et nyttigt udlæsning for AAV-infektion og amplifikation er påvisning af capsidproteiner ved Western blotting under anvendelse af B1 antistof, der genkender en højt konserveret AAV capsid epitop (fig. 7) 7.
En vigtig beslutning, er så som rå AAV udvinder at hente for efterfølgende re-infektion af friske celler (trin 5.2). Ideelt vil en tage dem, hvor AAV capsid båndene er mindst bemærkelsesværdige (fig. 7), fordi disse antyder en stram genotype-fænotype-binding. Sidstnævnte beskriver en situation, hvor et genom kodende for et bestemt capsid variant erfaktisk pakket i den tilsvarende capsid. At opnå og opretholde en stram genotype-fænotype-binding er nøglen til vellykket udvælgelse af individuelle virale kandidater, som det igen sikrer, at capsider med ønskede egenskaber levere beslægtede genetisk skabelonen ind i cellerne under successive infektion runder. Derfor anbefaler vi at plukke de råekstrakter med moderat kapsid udtryk for re-infektion og at bruge minimale mængder. Sammen vil disse to forholdsregler for at undgå overbelastning af de nyligt inficerede celler med forskellige capsid / genom-kombinationer, der ellers kunne forstyrrer den genotype-fænotype kobling, når re-inficerede virus begynder at kopiere og omemballering deres genomer til ikke-beslægtede capsider.
Desuden er det vigtigt at overvåge bibliotek mangfoldighed under gentagne infektioner runder af DNA-sekventering. Ideelt set vil man bemærke ændringer i sammensætningen af de individuelle kloner indikerer vellykket udvælgelse, dvs accumfolkning af distinkte serotype fragmenter og tab af andre, som eksemplificeret i fig. 8. I den perfekte tilfælde vil kun få eller endda en enkelt klon sidste ende blive detekteret som derefter kan analyseres som beskrevet ovenfor. Men hvis der ingen forskydninger observeret efter fire eller fem passager, bør man enten øge selektionspres (se diskussion), eller mener, at cellen anvendte linjen kan være uhensigtsmæssig, fordi det kan være for modtagelige for alt for mange serotyper.
For bibliotek forstærkning in vivo (trin 5,3), gælder de samme regler og betragtninger med to kritiske forskelle: For det første, man gør ikke skærmen tilfældigt udvalgte kloner i dyr på grund af de dermed forbundne omkostninger og etiske overvejelser. For det andet vil man ikke co-inficere med hjælper adenovirus som det forårsager toksiciteter eller dødsfald hos dyr, plus adenoviral tropisme ville begrænse valget til celler der er modtagelige for hjælperen virus. I stedet er AAV biblioteket infuseres i the dyr, reddet fra målcellerne / væv ved PCR (fig. 9) og derefter re-klonet og igen pakkes til en ny infektion runde. Som med valg i kulturen, er denne proces gentages, indtil de enkelte kandidater er dukket op.
Uanset udvælgelsesprocedure, det sidste trin er validering af de berigede capsid varianter i passende systemer. Fig. 10 og 11 viser repræsentative eksempler fra vores egne tidligere valg af AAV-kimærer, som udfører usædvanligt godt i vævskultur eller lever fra mus. Som det ses i fig. 10, en bestemt klon (AAV-DJ 3) faktisk overgår en samling af otte naturlige AAV wildtypes i en bred vifte af cellelinier. Endelig er en anden klon udvælges i dyrkede hepatomaceller linier udviser en højere tropisme for det murine leveren og dermed mindre off-målretning, hvor perifert infuseres i voksne mus end potente AAV8 kontrol vektoren testet direkte compræform (fig. 11). Bemærk, at selv være mere specifik for leveren, klon AAV-DN faktisk transducerer dette organ en smule mindre effektiv end AAV8. I denne henseende er AAV-DN en god repræsentant eksempel resultatet af AAV evolution og udvælgelse, hvor endelige kandidater udviser typisk et antal ønskede egenskaber, men er ikke nødvendigvis perfekt i alle henseender.
Figur 1 Skema. Syntetisk AAV capsid teknik via DNA familie shuffling og efterfølgende selektion i celler eller dyr. Protokollen trin er fremhævet i gråt.
Figur 2. AAV cap genet donor-og modtagerlande plasmider, der anvendes i vores laboratorium for DNA familie blander og bibliotek generation. Bemærk, at disse kun er repræsentative eksempler, og at de nøjagtige steder og sekvenserkan tilpasses. Vores grundlæggende donorplasmid er afledt fra kommercielt tilgængelige pBlueScript II KS (+)-vektoren, som vi manipuleret til at indeholde den viste primerbindingssitet samt restriktionssteder, der er afbildet ved pilene eller trekanter, hhv. Vi derefter klonet til cap-generne af AAV-serotyper 1-9 (amplificeret med primere capF / R) i dette plasmid, at blive flankeret af Pac I og ASC-restriktionssites. Primere T3 og T7 anvendes til hætten isolation i trin 2.2, mens senere amplifikation af gensamlet kimære sekvenser (trin 3.2) kan opnås ved anvendelse af enten primerpar SAF / R eller CUF / R, eller begge i en nestet PCR. Den replikationskompetent modtager plasmid bærer AAV-inverterede terminale gentagelser (ITR'er, replikation og pakning signaler), der flankerer AAV2 rep-genet under kontrol af AAV-P5-promotoren. Pac I og ASC I restriktionssites nedstrøms rep tillade "i ramme" kloning af den pulje af blandet cap gener. Denviste Lseq primerbindingssteder er nyttige til cap-genet sekventering (trin 3.6).
Figur 3. Eksempel for DNase I fordøjelsen af cap gener (AAV2, 8 og 9). Vist en agarosegel-elektroforese-analyse af produkterne fra cap-genet fordøjelser med de angivne forskellige inkubationstider (i minutter: sekunder). Bane U viser ufordøjet input hætten fragment pool som kontrol. Størrelser af DNA-markør bånd i bane M er i kilobaser. I dette eksempel, fordøjer ideel blev opnået med inkubationstider på 1:45 eller 2:00 minutter, hvilket gav den foretrukne dominerende top omkring 100 til 500 basepar (gul kasse).
Figur 4. Eksempel mikroskopi-baseret analyse af tre humane cellelinier inficeret med fem forskellige rekombinant YFP-udtrykker AAV vectors (navne på top) fremstillet med blandes cap-generne tilfældigt udvalgt fra et oprindelige bibliotek baseret på AAV2, 8 og 9.
Figur 5. Eksempel på FACS-baseret analyse af fire celler inficeret typer (ved serielle ti-fold fortyndinger) med 18 forskellige rekombinante YFP-udtrykker AAV-vektorer (navne på toppen, herunder fra figur 4) gjort med blandet cap gener tilfældigt udvalgte fra en oprindelige bibliotek (AAV2, 8 og 9). YFP udtryk blev mærket med farvekoder nemmere visualisering. Afbildede er procentdele af transducerede celler, hvorved sort altid angiver 0% og hvide det højeste antal målt i hver celletype. Klon B2 (rød) eksemplificerer en klon med dårlig samlede effekt, som kan forventes fra uselekterede capsider. Bemærk, at FACS-analyse er mere følsom og kan også anvendes til suspendering celler (såsom SupT1), der er mindre modtagelige for mikroskopi. hu, Human, my, murint.
Figur 6. Typiske udseende af cytopatiske virkninger i celler (HeLa i dette tilfælde) efter produktiv infektion med AAV og adenovirus. Cellerne blev enten efterladt uinficeret (øverst til venstre panel) eller inficeret med de angivne mængder (partikler per celle) af adenovirus.
Figur 7. Påvisning af AAV capsid protein ekspression ved Western blotting som et mål for bibliotek infektion og amplifikation. Den venstre blot viser celler co-inficeret med forskellige mængder (i gl) af en AAV bibliotek og hjælper Adenovirus. De første to baner er gode eksempler på samarbejdenditions opnåelse knapt påviselig AAV proteinekspression, hvilket indikerer en tilstrækkelig, men ikke overdreven AAV-infektion og-amplifikation og dermed den ønskede tætte genotype-fænotype-binding. Således blev 0,1, 1 eller 10 pi af disse supernatanter, der anvendes til reinfektion af friske celler (højre blot). Celler i bane C blev inficeret med AAV alene som en negativ kontrol (ingen påviselig ekspression på grund af fraværet af hjælpervirus).
Figur 8. Sammenligninger af proteinsekvenser (tallene er aminosyrer) af AAV-kloner fra et bibliotek baseret på AAV2, 8 og 9 før og efter selektion. Sekvenser over den røde linje viser forældrenes AAV'er. Violette pile angiver homologe rekombinationsbegivenheder. Den røde pil markerer en cross-over mellem AAV2 og AAV9 noteret på alle de udvalgte kloner.
Figur 9. </ Strong> Redning af succes smittet AAV kloner fra mus væv via PCR. I dette eksempel, var AAV-cap-generne PCR-amplificeret fra muselevere ekstraheret én uge efter perifer bibliotek infusion under anvendelse af primerpar SAF / R (fig. 2). Bane 1 viser det forventede 2,2 kilobase bånd, mens bane 2 er en ikke-template-kontrol. Efter Pac I og Asc I restriktionssite, blev de amplificerede fragmenter igen klonet ind i den oprindelige modtager plasmid (fig. 2) til efterfølgende fremstilling og reinfusion af et sekundært bibliotek. Størrelser af DNA-markør bånd i bane M er angivet i kilobaser.
Figur 10. Eksempel overlegen ydelse af en beriget AAV kimæren i dyrkede celler. Klon AAV-DJ er blevet rapporteret af os, før 3, det meste repræsenterer en hybrid mellem AAV-serotyper 2, 8 og 9, og er udvalgt fra en librar y indeholder disse tre og fem yderligere serotyper i humane leverceller i nærvær af puljet human antisera. At sammenligne effektiviteten til otte naturlige AAV-serotyper (angivet med 1-6, 8 og 9 på toppen), blev alle cap-gener anvendes til at fremstille oprenset selv-komplementære GFP-udtrykkende vektorer 8,19. Disse blev normaliseret til at indeholde 2x10 ni vektorgenomer per ml og derefter anvendt til at transducere de viste cellelinier til ti-folds serielle fortyndinger. Tre dage senere blev GFP-udtrykkende celler tælles og infektiøse titere blev bestemt ved at tage hensyn til fortyndingsfaktoren. I modsætning til koden i fig. 5, mørkere farver her angiver højere infectivities pr partikelantal. Som det fremgår, den valgte AAV-DJ kimære overgår alle naturlige AAV wildtypes, eksemplificerer succes anvendt valg ordningen. fibr, fibroblaster, ha, hamster, hu, humane, my, murine, si, simian.
Figur 11. Eksempel for analyse af en udvalgt AAV kimæren i muselever. Klon AAV-DN blev valgt på murine hepatomceller og derefter anvendt til fremstilling af luciferase-ekspression af rekombinante vektorer 8. Vist er repræsentative mus (tre pr gruppe) en uge efter perifer infusion af lige store doser af denne vektor eller en kontrol baseret på vildtype AAV8, en af de mest potente kendte naturlige isolater i muselever 9. Bemærk at medens AAV-DN klon giver lidt mindre samlet ekspression i leveren (panel (I)), er det mere specifik for dette organ, idet det udviser væsentligt mindre off-målretning i ikke-hepatiske væv, når leveren ekspressionsniveauerne er justeres via imaging software (panel (II)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi skitseret væsentlige eksperimentelle trin og retningslinjer for AAV kapsid engineering via DNA-familien blander og for evolution i celler eller dyr. I det væsentlige er disse protokoller standardiserede versioner af de procedurer, vi først rapporteret i AAV feltet i 2008 3. Mens en byge af opfølgende undersøgelser af andre har rapporteret talrige ændringer fx 10-13, vores nuværende versioner repræsenterer grundlæggende strategier der giver reproducerbare resultater og samtidig være egnet til opskalering og tilpasning til ethvert behov.
Trods vores bestræbelser på at standardisere hele proceduren, stadig nogle trin kræver trial-and-error-baserede løsninger. Dette gælder især for cap-genet fragmentering skyldes det faktum, at DNase I er yderst følsom over for reaktionsbetingelserne, såsom inkubationstiden (se eksemplerne i figur 3). Vi opnår de bedste resultater med udgangsmaterialer fragmenter i en række100 til 500 basepar og dermed anbefale at prøve forskellige DNase betingelser (fx mængder af enzym og inkubation gange), indtil gelen billedet ligner de pakkede baner i fig. 3.
Det er ligeledes umuligt fuldstændigt at standardisere de individuelle trin i biblioteket selektion i cellekultur. Som nævnt er et kritisk aspekt er usikkerheden om smitsomheden af et nyt bibliotek eller adenovirus i en given celletype, som kræver indirekte målinger såsom beskrevet Western blotting. Heldigvis, baseret på vores erfaring, at finde "gode" AAV / Adenovirus vaccinationskort mængder normalt kun tager få parallel indsats.
Lignende overvejelser gælder for AAV bibliotek valg i dyr, som også ideelt indebærer samtidig test af flere parametre (f.eks doser af den virale biblioteket, tidspunkt for høst efter podning, injektionsmåde) på grund af manglende eksperimentelle muligheder for direkte forudsit bibliotek infektivitet in vivo. Generelt er det vigtigt at bemærke, at in vivo selektion er sædvanligvis langt mere fysiologisk relevant, af flere grunde, herunder velkendte uoverensstemmelsen mellem AAV infectivities in vitro og in vivo 3. Endvidere in vivo evolution gør det muligt at tilføre biblioteket på samme måde som i sidste ende vil blive anvendt i et klinisk miljø. Dette giver mulighed for at ikke blot berige for capsider, der potent inficerer en ønsket celletype, men vigtigere gøre det fra en acceptabel indgivelsesvej.
Uanset valg af system, vi generelt anser det for hensigtsmæssigt at kombinere positive og negative tryk, da det vil øge chancerne for at berige de enkelte kandidater. En årsag til den sidstnævnte er sandsynligheden for, at capsider alene udvalgt under positivt tryk (f.eks vækst på en bestemt celletype) kan også stadig potent inficere andre celler deling (a) cellulær receptor (er). En anden årsag er, at målcellen type, der allerede kan være modtagelige for flere input vira fra biblioteket, hvilket reducerer risikoen for at berige endnu mere effektive capsider i fravær af yderligere negativt tryk.
Ét eksempel på sidstnævnte at vi med succes brugt før er bibliotek amplifikation i nærvær af puljet human antisera indeholdende antistoffer mod AAV-serotyper, som er fremherskende i den humane population. I modsætning til mindre strenge udvælgelsesprocedurer, der anvendes parallelt, er kun tilladt denne kombination af positive og negative tryk os til at udtrække en enkelt klon (AAV-DJ, fig. 10) ud af et bibliotek på ca 7x10 5 varianter 3.
Under alle omstændigheder ønsker vi at gentage vigtigheden af at teste flere bly capsiderne nye fra et udvalg ordning, og ikke kun spidskandidat. Faktisk er det også muligt, at den anden eller tredje mest dominerende kloner er lige eller mmalm nyttigt end bly kandidat, og / eller kan udvise yderligere ønskelige fænotyper for den givne anvendelse. Vi derfor anbefales altid at vælge mindst to capsiderne fra den endelige liste over kandidater efter afslutningen af et udvalg protokol og til at studere dem som beskrevet i trin 5,4.
Sidst men ikke mindst, vi ønsker at gentage, at DNA-familien blander er ikke den eneste AAV engineering-metoden. Alternative fremgangsmåder indbefatter indførelse af tilfældige punktmutationer i en bestemt AAV-cap-gen via fejl-tilbøjelig PCR 14,15 samt visning af peptidbiblioteker på udsatte områder af en specifik AAV capsid 4,5. Mens en omfattende diskussion eller sammenligning af disse metoder kan findes andre steder 16-18, kan vi let konkludere, at i lyset af dette væld af muligheder, fremtiden for området AAV teknik og udvikling er helt sikkert meget lyse og har formentlig kun lige begyndt .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de har noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker for fremragende støtte for deres laboratorium, teammedlemmer og arbejde med Cluster of Excellence CellNetworks på Heidelberg Universitet, samt ved Chica og Heinz Schaller (CHS) fundament. Vi sætter pris på, at molekylær AAV evolution via DNA-familien blander er blevet et meget aktivt område siden vores første udgivelse for tre år siden, og derfor undskylder over for alle forfattere af relevante publikationer, hvis arbejde kan ikke blive citeret her på grund af pladsmangel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S (part of kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| Ampicilin sodium salt | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Heating block | BIOER | MB-102 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS analyser | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | Custom primer | |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
