Summary
We tonen de basistechniek om moleculair ingenieur en synthetische adeno-geassocieerde virale (AAV) gentherapievectoren evolueren via DNA-familie shuffelen. Bovendien geven we algemene richtlijnen en representatieve voorbeelden voor de selectie en analyse van individuele chimere capsiden met verbeterde eigenschappen op doel cellen in cultuur of in muizen.
Abstract
Adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren zijn enkele van de meest krachtige en veelbelovende voertuigen voor therapeutische menselijke gen-overdracht als gevolg van een unieke combinatie van gunstige eigenschappen: 1. Deze omvatten de apathogenicity van de onderliggende wild-type virussen en de zeer geavanceerde methoden voor de productie van high-titer, hoge zuiverheid en klinisch-grade recombinante vectoren 2. Een ander bijzonder voordeel van de AAV-systeem ten opzichte van andere virussen is de beschikbaarheid van een schat van natuurlijk voorkomende serotypen die verschillen in essentiële eigenschappen nog kunnen allemaal gemakkelijk worden gemanipuleerd als vectoren met behulp van een gemeenschappelijk protocol 1,2. Bovendien hebben een aantal groepen met inbegrip van onze eigen onlangs bedacht strategieën om deze natuurlijke virussen gebruiken als sjablonen voor het maken van synthetische vectoren die ofwel een combinatie van de activa van multiple input serotypen, of die verbetering van de eigenschappen van een enkele isoleren. De respectieve technologieën om deze doelen te bereiken are ofwel DNA-familie schudden 3, dat wil zeggen de versnippering van de verschillende AAV capside genen gevolgd door hun re-assemblage gebaseerd op gedeeltelijke homologieën (meestal> 80% voor de meeste AAV serotypes), of peptide-display 4,5, dat wil zeggen het inbrengen van meestal zeven aminozuren in een blootgestelde lus van het virale capside waarbij het peptide voorkeur medieert opnieuw richten een gewenste celtype. Voor een maximaal resultaat zijn beide methoden toegepast in een hoge-doorvoer wijze waarbij de protocollen opgeschaald bibliotheken van ongeveer een miljoen verschillende capside varianten opleveren. Elke kloon wordt dan uit een unieke combinatie van vele virussen ouderlijke (DNA-shuffelen benadering) of bevat een karakteristieke peptide in dezelfde virale ruggengraat (peptide elkaar benadering). De daaropvolgende laatste stap is iteratief selectie van een dergelijke bibliotheek op doelcellen om te verrijken voor individuele capsiden vervullen van de meeste of idealiter aan alle eisen van het selectieproces. De laatste bij voorkeur kamines overdruk, zoals groei op een bepaald celtype van belang met negatieve selectie bijvoorbeeld verwijdering van alle capsiden reageren met anti-AAV antilichamen. Deze combinatie verhoogt de kans dat de synthetische capsiden het overleven van de selectie van de behoeften van de specifieke toepassing op een manier die waarschijnlijk niet zou zijn in een van nature voorkomende AAV isoleren evenaren. Hier richten we ons op de DNA-familie shuffelwerkwijze als het theoretisch en experimenteel grotere uitdaging van de twee technologieën. We beschrijven en demonstreren van alle essentiële stappen voor het genereren en selectie van geschud AAV bibliotheken (afb. 1), en dan bespreken de valkuilen en kritische aspecten van de protocollen die men moet zich bewust zijn van om te slagen met moleculaire AAV evolutie.
Protocol
1. Voorbereiding van de Plasmide Sets Codering AAV capside Genen
- Om routine bereiding van voldoende hoeveelheden van de verschillende AAV capside (cap) genen voor latere DNA-shuffelen vergemakkelijken eerste subkloon deze genen in een gemeenschappelijke plasmideskelet. Het is belangrijk om dezelfde flankerende sequenties van> 20 nucleotiden omvatten later gebruik als primer bindingsplaatsen voor geneste PCR en klonen (Fig. 2).
- Met behulp van geschikte primers (zie tabel voor de voorbeeldige primers voor AAV5), PCR versterken gewenste cap genen van algemeen beschikbare AAV plasmiden die bevatten doorgaans de AAV2 rep gen naast de dop gen van keuze. Omdat de PCR-product wordt in een standaard klonen ~ 1 ug gezuiverd produkt al voldoende, en elke gebruikelijke PCR-protocol kan daarom worden gebruikt.
- Verteren van het gezuiverde PCR-product (bijvoorbeeld het gebruik agarosegel zuivering of een standaard PCR zuivering kit) enontvanger plasmide met restrictie-enzymen die herkenningsplaatsen zijn aanwezig in de primers voor cap amplificatie (1,1) en in de ontvanger plasmide. In ons laboratorium we Pac I en Ascl sites (Fig. 2) als deze afwezig zijn in de meeste AAVs.
2. DNase-gebaseerde Cap Gene fragmentatie
- PCR versterken cap genen van keuze uit de plasmiden gegenereerd in stappen 1.1-1.3. Een reactie zoals hieronder beschreven zal opleveren ~ 3 ug PCR product. Afhankelijk van het aantal kap genen worden in de bibliotheek, die voldoende maximaal zes shuffelen reacties.
- Voor de PCR, het opzetten van een 50 ul reactie die 200 ng cap plasmide, elke primer op 2 uM eindconcentratie, 10 pl 5x Hifi buffer en 1 pi Hifi-polymerase. Begin met 5 min bij 95 ° C en voer 40 cycli van 15 sec 94 ° C, 30 seconden 57 ° C en 3 minuten 68 ° C, gevolgd door een laatste 10 minuten stapsgewijs72 ° C. Zuiver de PCR-producten via gel of kit en het opzetten van een gecontroleerde DNase digest naar Cap genfragmenten voor re-assemblage te creëren in de hersenschimmen.
- Daarom, even mengen van de verschillende dop PCR-producten op een totaal bedrag van 4 pg in 54 ul H 2 O. Voeg 6 ul DNase reactie buffer en 0,5 ul DNase I tot en met de reactie, zorgvuldig flick drie keer, kort draaien en meteen op een 25 ° C verwarmen blok. Incubeer tussen 1 en 2 min (instellen van meerdere parallelle reacties en ze in stappen van 15 sec te beëindigen), dan stop de reactie door het toevoegen van 6 ul 25 mM EDTA en door kort vortexen en incuberen 10 min bij 75 ° C.
- Zuiver de dop fragmenten op een standaard 1% agarose gel. Idealiter zou een uitstrijk zichtbaar tussen 100 en 500 basenparen. Aangezien DNase I een zeer sterke enzym juiste behandeling en timing zijn kritisch deze stap en meerdere variaties in incubatietijd in stap 2.3 nodig kunnen zijn voor een optimale resULT's (afb. 3). Zuiver het geëlueerde DNA met behulp van een standaard kit en zijn bepalend voor de concentratie.
3. DNA Family Shuffling
- In de eerste plaats weer in elkaar de dop fragmenten in full-length sequenties door middel van een PCR waarin ze zichzelf-prime gebaseerd op gedeeltelijke homologieën. Daarom is het opzetten van een 50 ul reactie met 500 ng gezuiverde fragmenten (stap 2.4), 10 pl 10x Phusion buffer, 1 pi 10 mM dNTPs, 1,5 pl DMSO en 0,5 pl Phusion II polymerase. Incubeer 30 sec bij 98 ° C en voer 40 cycli van 10 sec 98 ° C, 30 seconden 42 ° C en 45 seconden 72 ° C, gevolgd door een laatste 10 minuten bij 72 ° C.
- In een daaropvolgende tweede PCR, amplificeren het opnieuw geassembleerde cap genen voor verdere klonering met primers die binden aan de geconserveerde flankerende sequenties (Fig. 2). Daarom een 50 pi reactie met 2 pi van de eerste PCR (stap 3.1) van elke primer tot een eindconcentratie van 2 pM, 0,5 ul MgCl2,10 pl 5x Hifi buffer en 1 pi Hifi-polymerase. Wij raden lopen 16-24 PCR's voldoende hoge opbrengst voor de daaropvolgende klonen te garanderen. Pool de PCR's en zuiveren de volledige lengte cap band (gel of kit).
- Digest het gezuiverde dop genenbank met Pac I en Ascl voor het kloneren in een replicatie-competent AAV plasmide dat AAV ITR (inverted terminal repeats, replicatie en het inpakken signalen) en de AAV2 rep gen. Dit laatste moet worden gevolgd door dezelfde sites om de dop genenpool "in frame" geschikt (zie Fig. 2 voor details). Om volledige digestie van de PCR-produkten te bereiken, incubeer overnacht met een overmaat enzym.
- Ligeren de dop fragmenten en de juiste wijze knippen AAV ITR / rep ruggengraat in een molaire verhouding van 3:1. Maak een 40 pl totaal volume mastermix (voldoende voor 20 transformaties) met een DNA-concentratie van 50 ng / pl en incubeer overnacht bij 16 ° C.
- Transformatie ligatiereactie door het mengen (op ijs) 2 pi met 30 pi electro-competente E. coli (gekweekt van commerciële cellen en competent gemaakt met een standaard protocol). Toe te voegen in pre-gekoelde elektroporatie cuvetten (1 mm gap) op ijs. Electroporate 1,8 kV, 200 Ω en 25 uF. De tijdconstante moet bijna 5 ms. Onmiddellijk voeg 1 ml voorverwarmde SOC medium en overdracht aan een kolf van 250 ml. 20 van deze electroporations levert een bibliotheek met een diversiteit van ongeveer 1x10 6 verschillende klonen.
- Voeg 1 volume voorverwarmde SOC medium de samengevoegde transformaties en schudden bij 37 ° C en 180 rpm gedurende 1 uur. Breng het totale volume 800 ml LB-medium met ampicilline plus (eindconcentratie van 50 ng / ml) en incubeer nog 16 h onder dezelfde omstandigheden. Zuiver de bibliotheek plasmide DNA met behulp van bvb. een Qiagen Mega prep kit.
Optioneel bij stap 3.6: Om de exacte bibliotheek diversiteit, een plaat aliqu berekenenot van de 800 ml oplossing (voorafgaand aan de 16 uur incubatie) op LB-ampicilline platen (bijvoorbeeld 10 ul op een 10 cm plaat) en tellen kolonies de volgende dag. Ook de hoge schuifelen efficiëntie, volgorde bijv. 24 klonen te valideren en af te stemmen ze naar het ouderlijk cap genen (zie ook Fig. 8). Tot slot, in de bibliotheek van vitaliteit en hoge functionele diversiteit te bevestigen, subkloon willekeurig cap genen opgepikt in een AAV helper plasmide en gebruik ze om te produceren en recombinante vectoren te analyseren in kleinschalig (afb. 4-5) (zie ook hieronder stap 5.4).
4. De productie van virale Bibliotheek
- Seed 10 15 cm 2 gerechten van HEK293T cellen (4.5x10 6 cellen / gerecht) en 48 uur later transfecteren met 220 ug AAV bibliotheek en 220 microgram adenovirale plasmide (vereist voor AAV voortplanting). Daarom voorverwarmen PEI (polyethyleenimine) en 300 mM NaCl bij 37 ° C. Meng 7,9 ml NaCl en DNA, en voeg H 2 O tot een totale volume van 15,8 ml. In een aparte buis, meng 3,52 ml PEI, 7,9 ml NaCl en 4,38 ml H 2 O (alle volumes tien transfecties). Meng de mengsels (vortex) en incubeer 10 min bij kamertemperatuur voor het verdelen van de oplossing gelijkmatig over de schotels (3 ml per schaaltje).
- Na 48 uur, afschrapen van de cellen in het medium en draaien ze naar beneden op 1200 rpm gedurende 15 minuten. Resuspendeer de celpellet in 6 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 50 mM NaHCO 3) en met 5 vries-ontdooi cycli (-80/37 ° C). Incuberen met 50 U per ml benzonase gedurende 1 uur bij 37 ° C, alvorens af te draaien bij 3750 celresten rpm gedurende 20 minuten.
- Bereid 15%, 25% en 40% verdunningen (met 2,5 ul / ml PHENOLRED) een 60% iodixanol (OptiPrep in PBS-MK) voorraad in PBS-MK (1x PBS, 1 mM MgCl2, 2,5 mM KCl).
- Stel een helling AAV zuivering met een Pasteur pipet 5 ml virussuspensie toevoegen aan een Beckman Quick-Seal centrifugebuis (14x89 mm), gevolgd door 1,5 ml each 15%, 25% en 40% iodixanol oplossing. Klap op de vuurpijl het verloop met lysis buffer.
- Ultracentrifuge bij 50.000 K gedurende 2 uur bij 4 ° C in een Beekman Ti70.1 rotor. Vervolgens de buitenzijde van de buis te reinigen met 70% ethanol, steken de naald in de top van de buis voor ventilatie en stelt 1,2 ml 40% iodixanol fractie met een naald. Let er op dat het tekenen van de 25%-fractie, want het bevat lege AAV capsiden.
5. Screening en Selectie
- Op dit punt, kan men ofwel iteratief versterken de hele bibliotheek in gekweekte cellen of bij dieren tot chimere capsiden vertonen gewenste eigenschappen naar voren zijn gekomen (afb. 6-11).
- Om te selecteren in gekweekte cellen, co-infecteren verschillende fracties van de bibliotheek (bijvoorbeeld 1, 10 en 100 ul) en Adenovirus-5 naar AAV groei te ondersteunen. Het testen van meerdere varianten van bibliotheek en adenovirale helper is van essentieel belang als bibliotheek infectiviteit in een bepaald celtype kan niet worden voorspeld. Oogst decellen na ~ 3 dagen extract geamplificeerd AAV via vriesdooien te inactiveren Adenovirus gedurende 30 minuten bij 56 ° C en opnieuw nieuwe cellen te infecteren. Herhaal dit tot 5 keer tot verschillende capsiden worden verrijkt (te valideren door sequencing).
- Voor de selectie in dieren besmetten met de bibliotheek en haal de gewenste weefsel of celtype na ~ 1 week. Geen co-infecteren met adenovirus, omdat dit nadelige toxiciteit bij de dieren veroorzaken. Rescue virale DNA via PCR met behulp van dezelfde primers als voorheen (afb. 2), de dop zwembad opnieuw te klonen, produceren een frisse bibliotheek en herhalen tot verschillende capsiden worden verrijkt (te valideren door sequencing).
- De exacte omstandigheden (volume, titer route) voor selectie in vivo afhankelijk van het doel weefsel van belang. Voor lever, worden muizen gewoonlijk geïnfecteerd met 1x10 tot 1x10 11 12 virale deeltjes in een totaal volume van 200 ul PBS via staartader injectie (IV). De beperkende factor is meestal de virale titer van original, omdat bijvoorbeeld injectie van 1x10 12 AAV in 200 pi vereist een titer van ten minste 5x10 12 / ml, die niet alle labs kan routinematig bereikt. Daarom terwijl een maximum titer is gunstig voor de eerste infectie (omdat de bibliotheek nog niet is verrijkt efficiënte capsiden in een bepaald weefsel en aldus een betrekkelijk lage totale infectiviteit) het aan te raden tenminste 1x10 11 deeltjes per gebruiken muis lever selectie.
- Als er meerdere muizen beschikbaar zijn, is het zeer nuttig om verschillende deeltjes nummers verwant aan de selectie in gekweekte cellen te injecteren, en een aantal muizen per groep (en dan bundelen de verzamelde levers binnen elke groep) om te gebruiken om de variabiliteit te beperken en om succes te vergroten tarieven, bv 3 muizen op 1x10 11 en 3 muizen op 1x10 12 deeltjes.
- Aangezien AAV is een niet-pathogene en replicatie-incompetent (zonder helpervirus) virus er geen bijwerkingen te zoeken in de afwezigheid van Adenovirus.
- Voor euthanization, werden de dieren anesthesized met behulp van een isofluraan verdamper en vervolgens euthanized via cervicale dislocatie.
- De weefsels (lever in dit geval) werden geoogst na de dieren werden bevestigd euthanized. In het algemeen bestaat er geen behoefte ook andere weefsels van de dieren doorstroomd of AAV-geïnfecteerde organen oogsten vóór de dood, aangezien de AAV DNA stabiel en kan gemakkelijk worden gered bevroren cellen / weefsels.
- Om een capsiden (uit de bibliotheek (stap 3.6) of na selectie (stap 5.2 tot 5.3)) studeren, AAV vectoren die coderen voor een reporter-gen (bijvoorbeeld GFP 6) door de stappen 4.1-4.5. Daarom klonen de dop gen van belang in een standaard AAV helper plasmide 2. Bij stap 4.1, triple-transfecteren van de cellen met 14,7 ug elk van AAV-vector (die coderen voor de verslaggever), AAV helper en adenovirale helper. Infect gekweekte cellen of dieren met gezuiverde virus op verschillende hoeveelheden en determinantenne transductie efficiëntie bijvoorbeeld via FACS of microscopie.
6. Representatieve resultaten
Het gebruik van het protocol hier geschetste meestal resulteert in virale bibliotheken met een diversiteit van ongeveer 1x10 6 unieke capsiden die vervolgens kunnen worden gescreend op enkele deeltjes het weergeven van de meeste of alle gewenste eigenschappen op een bepaalde cellijn of bij dieren. In het volgende zullen wij representatieve voorbeelden resultaten van deze in vitro of in vivo screening.
Voorafgaand aan dat, echter, vinden wij het belangrijk om weer wijzen op het nut van het analyseren van individuele klonen van de oorspronkelijke plasmide bibliotheek voor hun functionaliteit en diversiteit (optioneel bij stap 3.6). Dit komt omdat de laatste twee parameters grootste kritische voorwaarde voor het succes van selectie van de werkelijke virale bibliotheek gemaakt van het plasmide bibliotheek. Daarom kan een willekeurig kiezen enkele geschudcap genen en gebruiken om recombinante AAV vectoren (ruwe extracten of gezuiverde deeltjes, afhankelijk van de gewenste nauwkeurigheid) die een gemakkelijk te detecteren en meetbare reportergen produceren. Een typische analyse van de verschillende varianten capside vergelijken is dan fluorescentiemicroscopie, zoals in een representatief voorbeeld van Fig. 4.
Een alternatieve methode is gebaseerd FACS meting van fluorescerende reportergen expressie die de extra voordelen ook mogelijk voor de bepaling van genexpressie per cel bevat, plus dat werkt suspensiecellen. Fig. 5 toont een typisch gevolg van een dergelijke FACS gebaseerde analyse van ruwe lysaten AAV vector in verschillende celtypen.
Omdat de hierboven beschreven selectie van individuele cap chimeren is willekeurig en beperkt is uiteraard niet bruikbaar als een effectief benadering voor verrijking van gewenste kandidaten. In plaats daarvan selectie van de viral bibliotheek in target cellen of weefsels bij dieren is meer geschikt. Aangezien de voorwaarden en parameters hangt af van elke toepassing, zullen we alleen maar wijzen op een paar representatieve richtlijnen en resultaten.
De gemakkelijkste keuze is iteratief bibliotheek versterking op gekweekte cellijnen of primaire cellen (stap 5.2). Sinds AAV vereist Adenovirus co-infectie voor de verspreiding ervan, moet de doelcellen gevoelig zijn voor Adenovirus. Men kan dan groeien en infecteren ze bijvoorbeeld in 6-well platen die voldoende aantal cellen per putje om een volledige dekking van de bibliotheek zorgen voor te houden. Een tweede belangrijk begrip dat het saldo van AAV en Adenovirus delicate is, te veel AAV de Adenovirus remmen, terwijl een overmaat van deze cellen zal doden (in tegenstelling AAV, Adenovirus veroorzaakt lytische infectie) vóór AAVs kunnen repliceren.
Aangezien bibliotheek besmettelijkheid op een bepaald celtype is niet bekend, het vinden van "goede" AAV: Adenovirus ratio's opdie zowel kunnen uitdragen moet parallel testen van verschillende combinaties van doses van de bibliotheek en de adenovirale helper (bv. 10:1, 1:1 en 1:10). Een goede maat voor krachtige Adenovirus infectie is het ontstaan van cytopathische effecten drie dagen na inoculatie virus, zoals blijkt uit cellen afrondingen en losgemaakt zoals in Fig. 6. Omgekeerd nuttig uitlezing voor AAV infectie amplificatie detectie van capside eiwitten door Western blotting met de B1 antilichaam dat een sterk geconserveerd AAV capside epitoop (Fig. 7) 7 herkent.
Een belangrijke beslissing is dan die van ruwe AAV onttrekt op te halen voor de volgende re-infectie van verse cellen (stap 5.2). Idealiter een nemen die waarbij de AAV capside banden minste opmerkelijke (Fig. 7), omdat deze wijzen strak genotype-fenotype koppeling. Deze laatste wordt de situatie waarin een genoom codeert voor een bepaald variant capsidedaadwerkelijk verpakt in de overeenkomstige capside. Om dit te bereiken en handhaven van een strakke genotype-fenotype koppeling is de sleutel tot een succesvolle selectie van individuele virale kandidaten als het op zijn beurt zorgt ervoor dat capsiden met de gewenste eigenschappen van het verwante genetische template te leveren in de cellen tijdens de opeenvolgende infectie rondes. Daarom raden wij u aan de ruwe extracten met een matige capside uitdrukking voor re-infectie te kiezen en minimale hoeveelheden te gebruiken. Samen zullen deze twee maatregelen ter voorkoming van overbelasting van de nieuw geïnfecteerde cellen met verschillende capside / genoom combinaties die anders zouden kunnen verstoren de genotype-fenotype koppeling zodra de re-geïnfecteerde virussen gaan repliceren en opnieuw verpakken van hun genoom in niet-verwante capsiden.
Daarnaast is het essentieel om bibliotheek diversiteit te controleren bij herhaalde infecties rondes door DNA-sequencing. In het ideale geval zal een sprake van verschuivingen in de samenstelling van de individuele klonen wijzen op een succesvolle selectie, dat wil zeggen, metersulatie van verschillende serotype fragmenten en verliezen van anderen, zoals geïllustreerd in Fig. 8. In het ideale geval slechts enkele of een kloon uiteindelijk gevonden dat kan worden geanalyseerd zoals hierboven beschreven. Indien echter geen verschuivingen worden waargenomen na vier of vijf passages, moet men een verhoging van de selectiedruk (zie bespreking) of kan de gebruikte cellijn kan geschikt zijn omdat het mogelijk te gevoelig te veel serotypen.
Voor de bibliotheek versterking in vivo (stap 5.3), dezelfde regels en overwegingen van toepassing zijn, met twee belangrijke verschillen: Ten eerste, men niet het scherm willekeurig geselecteerde klonen bij dieren als gevolg van de daaraan verbonden kosten en ethische overwegingen. Ten tweede zal men niet mee besmetten met helper adenovirus als het veroorzaakt toxiciteiten of dodelijke slachtoffers bij dieren, plus de adenovirale tropisme zouden selectie te beperken tot cellen die gevoelig zijn voor de helper virus. In plaats daarvan wordt de AAV bibliotheek toegediend in ee dieren gered van de doelcellen / weefsel PCR (Fig. 9) en opnieuw gekloneerd en opnieuw verpakt voor een nieuwe infectie rond. Net als bij selectie in cultuur, wordt dit proces herhaald tot individuele kandidaten naar voren zijn gekomen.
Ongeacht de selectieprocedure, de laatste stap is validatie van de verrijkte capside varianten in de juiste systemen. Fig. 10 en 11 representatieve voorbeelden van onze eerdere selectie van AAV chimeren die uitzonderlijk goed presteren in weefselkweek of levers van muizen. Zoals in Fig. 10 een bepaalde kloon (AAV-DJ 3) overtreft inderdaad uit acht natuurlijke AAV wildtype in een groot aantal cellijnen. Tenslotte een kloon geselecteerd in gekweekte hepatoma lijnen vertoont een hogere tropisme voor de muizen lever en overeenkomstig minder buiten gerichte als zijdelings ingeblazen volwassen muizen dan controle vector krachtige AAV8 getest rechtstreeks comvergelijking (fig. 11). Merk op dat zij die meer specifiek voor de lever, eigenlijk kloon AAV-DN dit orgel een beetje minder efficiënt dan AAV8 transduceert. In dit opzicht AAV-DN een goed representatief voorbeeld van de uitkomst van AAV evolutie en selectie met eindkandidaten vertonen typisch een aantal gewenste eigenschappen, maar niet noodzakelijk perfect in alle aspecten.
Figuur 1 Schema. Synthetische AAV capside techniek via DNA-shuffelen familie en daaropvolgende selectie in cellen of dier. Protocol stappen zijn grijs gemarkeerd.
Figuur 2. AAV cap gen donor en ontvanger plasmiden die in ons laboratorium voor DNA-familie schudden en bibliotheek generatie. Merk op dat dit slechts representatieve voorbeelden, en de sites en sequentieskan worden aangepast. De basis donor plasmide uit de handel verkrijgbare pBluescript II KS (+) vector die we ontworpen de getoonde primerbindende en restrictieplaatsen, weergegeven door pijlen of driehoeken respectievelijk bevatten. Vervolgens gekloneerd de kap genen AAV serotypes 1-9 (geamplificeerd met primers capF / R) in dit plasmide, te worden geflankeerd door Pac I en Ascl-restrictieplaatsen. Primers T3 en T7 worden gebruikt voor de dop isolatie in stap 2,2, later amplificatie van opnieuw geassembleerde chimère sequenties (stap 3.2) kan worden uitgevoerd met behulp van primerparen SAF / R of CUF / R, of beide in een geneste PCR. De replicatie-competent ontvanger plasmide draagt AAV inverted terminal repeats (ITRs, replicatie en het inpakken signalen) aan weerszijden van de AAV2 rep gen onder de controle van de AAV p5 promoter. Pac I en Ascl-restrictieplaatsen voorbij rep zorgen voor "in frame" klonen van de pool van geschud cap genen. Degetoond Lseq primer bindingsplaatsen zijn nuttig voor het cap gen sequencing (stap 3.6).
Figuur 3. Voorbeeld DNase I digest van cap genen (AAV2, 8 en 9). Getoond is een agarose gel elektroforese analyse van het gen van de kap verteert met de aangegeven verschillende incubatietijden (in minuten: seconden). Lane U toont de onverteerde ingang dop fragment zwembad als controle. Afmetingen van DNA merker banden in lanen M in kilobasen. In dit voorbeeld ideale verteert verkregen met incubatietijden van 01:45 of 02:00 min, waarbij de voorkeur overwegend piek ca. 100 tot 500 baseparen (geel box) opleverde.
Figuur 4. Voorbeeld voor microscopie-gebaseerde analyse van drie menselijke cellijnen die besmet zijn met vijf verschillende recombinante YFP-expressie AAV vectors (namen geplaatst) gemaakt geschud kap genen willekeurig gekozen uit een origineel bibliotheek op AAV2, 8 en 9.
Figuur 5. Voorbeeld voor FACS-gebaseerde analyse van vier geïnfecteerde cel types (op seriële tienvoudige verdunningen) met 18 verschillende recombinante YFP-expressie AAV vectoren (namen op de top, waaronder die van Fig. 4) gemaakt met geschud cap genen willekeurig gekozen van een origineel bibliotheek (AAV2, 8 en 9). YFP expressie werd voorzien van een kleurcodering voor eenvoudige visualisatie. Afgebeeld zijn percentages van getransduceerde cellen, waarbij zwart altijd wijst op 0% en wit het hoogste aantal gemeten in elke cel type. Clone B2 (rood) is een voorbeeld van een kloon met een slechte algemene werkzaamheid, zoals kan worden verwacht van niet-geselecteerde capsiden. Merk op dat FACS analyse gevoeliger en kan ook worden gebruikt voor gesuspendeerde cellen (zoals SupT1) die minder geschikt microscopie. HU, Menselijke, mu, muizen.
Figuur 6. Typisch uiterlijk van cytopathische effecten in cellen (HeLa in dit geval) na productie co-infectie met AAV en Adenovirus. Cellen werden ofwel nog niet-geïnfecteerde (linksboven paneel) of geïnfecteerd met de aangegeven bedragen (deeltjes per cel) van adenovirus.
Figuur 7. Detectie van AAV capside-eiwit expressie door Western blotting als maat voor bibliotheek infectie en amplificatie. De linker blot toont cellen co-infectie met verschillende volumes (in pl) van een AAV bibliotheek en helper Adenovirus. De eerste twee rijstroken zijn goede voorbeelden voor samenwerkingnditions waardoor nauwelijks detecteerbaar AAV-eiwit expressie,, voldoende maar niet overdreven AAV infectie en versterking en daarmee de gewenste strakke genotype-fenotype koppeling. Zo werden 0,1, 1 of 10 pi van deze supernatanten gebruikt voor een nieuwe infectie van verse cellen (rechts blot). Cellen in laan C werden geïnfecteerd met AAV alleen een negatieve controle (geen detecteerbare expressie door de afwezigheid van de helpervirus).
Figuur 8. Vergelijking van eiwitsequenties (nummers zijn aminozuren) van AAV klonen van een bibliotheek op AAV2, 8 en 9 voor en na selectie. Sequenties boven de rode lijn geven de ouders AAVs. Paars pijlen geven homologe recombinatie gebeurtenissen. De rode pijl markeert een cross-over tussen AAV2 en AAV9 genoteerd in alle geselecteerde klonen.
Figuur 9. </ Strong> Redding van succes besmet AAV klonen van muis weefsels via PCR. In dit voorbeeld AAV cap genen PCR-geamplificeerd muis levers geëxtraheerd een week na perifere bibliotheek infusie met primerpaar SAF / R (Fig. 2). Laan 1 toont de verwachte 2,2 kilobase band, terwijl laan 2 is een niet-template controle. Na Pac I en Ascl beperking werden de geamplificeerde fragmenten opnieuw gekloneerd in de oorspronkelijke geadresseerde plasmide (Fig. 2) voor daaropvolgende productie en opnieuw infusie van een secundaire bibliotheek. Maten van de DNA-merker bands in rijstroken M worden aangegeven in kilobasen.
Figuur 10. Voorbeeld voor superieure prestaties van een verrijkte AAV hersenschim in gekweekte cellen. Kloon AAV-DJ gerapporteerd door ons vóór 3, maar meestal is een hybride tussen AAV serotypes 2, 8 en 9, en is geselecteerd uit een librar y met deze drie en vijf extra serotypen in humane lever cellen in de aanwezigheid van gemengd menselijk antisera. Om de efficiëntie te vergelijken acht natuurlijke AAV serotypes (aangegeven met 1-6, 8 en 9 geplaatst) werden alle cap genen voor het produceren van gezuiverde zelf-complementair GFP tot expressie vectoren 8,19. Deze werden genormaliseerd tot 2x10 9 vector genoom per ml bevat en vervolgens het getoonde cellijnen tien-voudige seriële verdunningen transduceren. Drie dagen later werden GFP-expresserende cellen geteld en infectieuze titers werden bepaald door rekening houdend met de verdunningsfactor. In tegenstelling tot de code in Fig. 5, donkere kleuren hier aangeven hogere infectivities per deeltje nummer. Zoals duidelijk is, de gekozen AAV-DJ chimera presteert beter dan alle natuurlijke AAV wildtype, exemplarisch voor het succes van de toegepaste selectie regeling. glasvezelnet, fibroblasten, ha, hamster, HU, menselijke, mu, muizen, si, aap.
Figuur 11. Voorbeeld analyse van geselecteerde AAV chimeer in muizenlever. Kloon AAV-DN werd geselecteerd op muizen hepatoma cellen en voor het produceren van luciferase-expressie recombinante vectoren 8. Getoond zijn representatief muizen (drie per groep) een week na infusie perifere gelijke doseringen van deze vector of een controle op wildtype AAV8 een van de meest krachtige bekende natuurlijke isolaten muizenlever 9. Merk op dat tijdens de AAV-DN kloon geeft iets minder algemene uitdrukking in de lever (paneel (I)), is het specifiek voor dit orgaan omdat vertoont aanzienlijk minder buiten gericht in niet-gestoorde weefsels als de lever expressie zijn ingesteld met de beeldvormende software (paneel (II)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we geschetst van essentieel belang experimentele stappen en richtlijnen voor de AAV capside techniek via DNA-shuffelen en familie voor de evolutie in cellen of bij dieren. In essentie zijn deze protocollen zijn gestandaardiseerd versies van de procedures die we voor het eerst binnen de AAV gebied gemeld in 2008 3. Terwijl een vlaag van follow-up studies van anderen hebben gemeld talrijke wijzigingen bv, 10-13, onze huidige versies zijn basisstrategieën opleveren reproduceerbare resultaten terwijl ze vatbaar is voor opschaling en de aanpassing aan alle behoeften.
Ondanks onze inspanningen om de gehele procedure te standaardiseren, een aantal stappen moeten nog trial-and-error-gebaseerde benaderingen. Dit geldt vooral voor de dop gen fragmentatie door het feit dat DNase I is zeer gevoelig voor de reactieomstandigheden, zoals incubatietijd (zie de voorbeelden in fig. 3.). We krijgen de beste resultaten met het starten van fragmenten in een reeks van100 tot 500 baseparen en dus raden naar verschillende DNase omstandigheden (bijvoorbeeld hoeveelheden enzym en incubatietijd) proberen totdat de gel beeld lijkt op de doos rijstroken in Fig. 3.
Het is ook niet volledig te standaardiseren de stappen tijdens bibliotheek selectie in celcultuur. Zoals gezegd, een kritische aspect is de onzekerheid over de besmettelijkheid van een nieuwe bibliotheek of van adenovirus in een bepaalde cel type, waarbij indirecte metingen, zoals de beschreven Western blotting. Toevallig, gebaseerd op onze ervaring, het vinden van "goede" AAV / Adenovirus inoculatie volumes meestal duurt slechts een paar parallelle inspanningen.
Soortgelijke overwegingen gelden voor AAV bibliotheek selectie bij dieren die idealiter ook betrekking heeft op gelijktijdig testen van verschillende parameters (bijvoorbeeld doses van het virale bibliotheek, tijdstip van de oogst na inoculatie, injectie route) te wijten aan een gebrek aan experimentele mogelijkheden om direct voorspellingent bibliotheek infectiviteit in vivo. In het algemeen is belangrijk op te merken dat in vivo selectie meestal veel fysiologisch relevant om diverse redenen zoals het bekende verschil tussen AAV infectivities in vitro en in vivo 3. Bovendien vivo evolutie toelaat de bibliotheek trekken dezelfde wijze dat uiteindelijk wordt gebruikt in een klinische setting. Dit biedt de kans om niet alleen te verrijken voor capsiden dat krachtig infecteren van een gewenste celtype, maar belangrijker is dat doen op een aanvaardbaar levering route.
Ongeacht selectiesysteem, wij over het algemeen er de voorkeur aan positieve en negatieve druk te combineren omdat het verhogen kans op het verrijken van de individuele kandidaten. Een reden voor de laatste is de kans dat capsiden uitsluitend geselecteerd onder positieve druk (bv. groei op een bepaald celtype) kan ook nog steeds krachtig andere cellen infecteren het delen van (a) cellulaire receptor (en). Een tweede reden is dat de doelcel soort waarschijnlijk ook gevoelig verschillende ingang virussen uit de bibliotheek, waardoor de kans nog efficiëntere capsiden verrijken geen extra onderdruk.
Een voorbeeld voor de laatste dat we met succes gebruikt voor amplificatie is bibliotheek in aanwezigheid van gemengd menselijk antisera die antilichamen tegen AAV serotypes die heersen bij de mens. In tegenstelling tot de minder strenge selectie procedures die worden toegepast in parallel, alleen deze combinatie van positieve en negatieve druk liet ons toe om een kloon (AAV-DJ, Fig. 10) halen uit een bibliotheek van ongeveer 7x10 5 varianten 3.
In ieder geval willen we het belang van het testen van meerdere lood capsiden die uit een selectie regeling, en niet alleen de topkandidaat herformuleren. Sterker nog, het is goed mogelijk dat de tweede of derde meest dominante klonen zijn even of zelfs merts nuttig is dan de leiding kandidaat en / of vertonen verder wenselijk fenotypen de bepaalde toepassing. Wij dus raden aan altijd ten minste twee meer capsiden kiezen uit de definitieve lijst van kandidaten na afloop van een selectie protocol en om ze, zoals beschreven in stap 5.4 te bestuderen.
Last but not least, willen wij er nogmaals op wijzen dat DNA familie schudden is niet de enige AAV engineering methode. Alternatieve benaderingen omvatten de invoering van puntmutaties willekeurig in een bepaalde AAV cap gen via fouten gevoelige PCR 14,15 en de weergave van peptidenbibliotheken in belichte gebieden van een specifieke AAV capside 4,5. Terwijl een uitgebreide discussie of vergelijking van deze aanpak is elders 16-18 worden gevonden, kunnen we gemakkelijk concluderen dat in het licht van deze overvloed aan opties, de toekomst voor het gebied van AAV engineering en evolutie is zeker zeer helder en heeft waarschijnlijk nog maar net begonnen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren dat ze niets bekend te maken te hebben.
Acknowledgments
De auteurs zeer erkentelijk voor uitstekende ondersteuning van hun lab, teamleden en werk van de Cluster of Excellence CellNetworks aan de Universiteit van Heidelberg en door de Chica en Heinz Schaller (CHS) stichting. We waarderen het dat de moleculaire AAV evolutie via DNA-familie shuffling is uitgegroeid tot een zeer actieve gebied sinds onze eerste publicatie drie jaar geleden en daarom excuses aan alle auteurs van relevante publicaties van wie het werk kon hier niet geciteerd worden als gevolg van ruimtegebrek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S (part of kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| Ampicilin sodium salt | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Heating block | BIOER | MB-102 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS analyser | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | Custom primer | |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
