Summary
אנחנו מדגימים את הטכניקה הבסיסית מולקולרי מהנדס ולהתפתח סינתטיים Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) טיפול וקטורים גנים באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כלליות ודוגמאות נציג לבחירת וניתוח של capsids chimeric בודדים בעלי תכונות משופרות על תאים היעד בתרבות או בעכברים.
Abstract
Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) וקטורים מהווים חלק מכלי הרכב החזקים ביותר ומבטיח להעברת טיפולית הגן האנושי עקב שילוב ייחודי של תכונות מועילות 1. אלה כוללים את apathogenicity של וירוסים wildtype הבסיס לבין מתודולוגיות מתקדמות ביותר לייצור גבוהה titer טוהר גבוהה, וקליניים כיתה וקטורים רקומביננטי 2. יתרון נוסף של מערכת מסוימת AAV על וירוסים אחרים הוא הזמינות של עושר טבעי של קפסיד, השונים בנכסים חיוניים עדיין יכולים להיות מהונדסים בקלות באמצעות וקטורים 1,2 פרוטוקול נפוץ. יתר על כן, מספר קבוצות, כולל שלנו פיתחו לאחרונה אסטרטגיות להשתמש באותם וירוסים טבעי כתבניות ליצירת וקטורים סינתטיים אשר גם לשלב את הנכסים של קפסיד קלט מרובים, או אשר משפרים את המאפיינים של אחת לבודד. הטכנולוגיות המתאימות כדי להשיג מטרות אלה arה-DNA או המשפחה דשדוש 3, כלומר פיצול של גנים שונים AAV קפסיד ואחריו הרכבה מחדש שלהם מבוסס על homologies חלקי (בדרך כלל> 80% עבור רוב קפסיד AAV), או להציג פפטיד 4,5, כלומר הכנסה של 7 חומצות אמינו בדרך כלל לתוך לולאה חשוף של capsid ויראלי שבו פפטיד אידיאלי מתווכת מחדש מיקוד לסוג התא הרצוי. להצלחה מקסימלית, שתי השיטות מיושמות באופן תפוקה גבוהה לפיה הפרוטוקולים הם עד בקנה מידה להניב ספריות של כ 1,000,000 קפסיד גרסאות שונות. שיבוט כל כך מורכב משילוב ייחודי של וירוסים הורים רבים (גישת ה-DNA של גרירת רגליים) או מכילה פפטיד ייחודי בתוך עמוד השדרה ויראלי זהה (גישת התצוגה פפטיד). השלב האחרון לאחר מכן הוא איטרטיבי מבחר של הספרייה כזה על תאים היעד על מנת להעשיר את capsids בודדים הממלאים את רוב או את כל הדרישות אידיאלי של תהליך הבחירה. זו האחרונה רצוי לסרקאינס לחץ חיובי, כגון גידול לסוג תא מסוים של עניין, עם סלקציה שלילית, לשם מניעת מופע של כל capsids מגיבים עם נוגדנים נגד AAV. שילוב זה מגדיל הסיכוי capsids סינתטיים ששרדו את הבחירה להתאים את הצרכים של היישום ניתן באופן סביר להניח שלא נמצאו כל AAV טבעי לבודד. כאן, אנו מתמקדים בשיטת ה-DNA המשפחה דשדוש כמו תיאורטית ו ניסיוני יותר מאתגר של שתי הטכנולוגיות. אנו מתארים ולהפגין בכל האמצעים החיוניים לייצור ובחירת גררה את רגליה ספריות AAV (איור 1), ולאחר מכן לדון את החסרונות ואת ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקולים, כי אחד צריך להיות מודע כדי להצליח עם האבולוציה AAV מולקולרית.
Protocol
1. הכנת סטים פלסמיד קידוד AAV גנים capsid
- כדי להקל על שגרת ההכנה של כמות מספקת של שונות AAV קפסיד (CAP) הגנים של ה-DNA לאחר גרירת רגליים, בתחילה subclone הגנים האלה לתוך עמוד השדרה פלסמיד משותף. חשוב לכלול רצפים זהים משני צדי של> 20 נוקלאוטידים לשימוש מאוחר יותר כאתרי פריימר מחייב עבור PCR מקונן ועל שיבוט (איור 2).
- באמצעות פריימרים מתאימים (ראו טבלה עבור primers למופת עבור AAV5), PCR להגביר גנים כובע הרצוי מתוך זמינים בדרך כלל פלסמידים AAV כי בדרך כלל מכילים את הגן AAV2 נציג ליד הגן שווי של בחירה. כי מוצר ה-PCR ישמש שיבוט רגיל, ~ 1 מיקרוגרם של מטוהרים המוצר כבר מספיק, וכל פרוטוקול ה-PCR קונבנציונאלי ולכן יכול לשמש.
- לעכל את ה-PCR מטוהרים המוצר (למשל, השתמש agarose טיהור ג'ל או ערכת טיהור תקן ה-PCR) והנמען פלסמיד עם אנזימי הגבלה אשר אתרי הכרה נמצאים על פריימרים המשמשים הגברה שוק (1.1), כמו גם למקבל פלסמיד. במעבדה שלנו, אנו משתמשים פאק אני עולה אתרים I (איור 2) כאשר הם נעדרים ברוב AAVs.
2. DNase מבוסס ין שווי פיצול
- PCR להגביר גנים כובע של בחירה מתוך פלסמידים שנוצרו בשלבים 1.1-1.3. תגובה אחת כמתואר להלן תניב ~ 3 מיקרוגרם של מוצר ה-PCR. תלוי במספר גנים כובע להיכלל בספרייה, זה מספיק עד שש תגובות דשדוש.
- עבור ה-PCR, להגדיר תגובה 50 μl המכיל 200 ng שווי פלסמיד, כל צבע יסוד בריכוז 2 מיקרומטר האחרון, חיץ 10 μl 5x HiFi ו 1 μl פולימראז HiFi. התחל עם 5 דק 'ב 95 ° C ולאחר מכן להפעיל 40 מחזורים של 15 שניות 94 ° C, 30 sec 57 ° C ו 3 דקות 68 ° C, ואחריו שלב 10 הגמר דקות ב72 ° C. לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ג'ל או ערכת ואז להגדיר מבוקר DNase תקציר ליצור גנים כובע שברי עבור הרכבה מחדש לתוך מפלצות.
- לכן, באותה מידה לערבב את המוצרים השונים כובע ה-PCR לסכום כולל של 4 מיקרוגרם של 54 μl H 2 O. הוסף μl 6 חיץ DNase התגובה ו -0.5 DNase μl אני לתגובה, בזהירות קפיצי שלוש פעמים, ספין בקצרה ולשים מיד על בלוק 25 ° C חימום. דגירה בין 1 ל 2 דק '(להגדיר תגובות מקבילים מרובים ולסיים אותם בהפרשים של 15 שניות), ואז לעצור את התגובה על ידי הוספת 6 μl 25 מ"מ ו EDTA על ידי לחיצה קצרה vortexing דוגרים ו 10 דק' ב 75 ° C.
- לטהר את שברי התקרה של ג'ל רגיל agarose 1%. באופן אידיאלי, למרוח צריך להיות גלוי בין 100 ל 500 זוגות בסיסים. מאז אני DNase הוא אנזים חזק מאוד, הטיפול הנכון בעיתוי קריטי בשלב זה, וריאציות רבות בזמן הדגירה בשלב 2.3 יש צורך בהזמנה עבור מיל אופטימלייםאולטס (איור 3). לטהר את ה-DNA eluted באמצעות ערכת רגיל לקבוע את ריכוזו.
3. ה-DNA משפחה גרירת רגליים
- ראשית, להרכיב מחדש את שברי כובע אל באורך מלא רצפים באמצעות PCR שבה עצמית הממשלה על בסיס homologies חלקי. לכן, הקים תגובה 50 μl עם 500 שברי מטוהרים נג (שלב 2.4), 10 Phusion μl בופר 10x, 1 μl 10 dNTPs מ"מ, 1.5 DMSO ו μl 0.5 μl פולימראז II Phusion. דגירה 30 שניות על 98 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפעיל 40 מחזורים של 10 שניות 98 ° C, 30 sec 42 ° C עד 45 ° C 72 שניות, ואחריו שלב 10 הגמר דקות ב 72 ° C.
- ב-PCR 2 שהתפתח, להגביר מחדש שנאספו גנים כובע על שיבוט לאחר מכן, באמצעות primers אשר נקלטות על ידי רצפי משני צדי המשתמרים (איור 2). לכן, הקים תגובה 50 μl המכיל 2 μl של ה-PCR הראשון (שלב 3.1), כל צבע יסוד בריכוז הסופי של 2 מיקרומטר, 0.5 μl MgCl2,10 μl חיץ 5x HiFi ו 1 μl פולימראז HiFi. אנו ממליצים לרוץ 16-24 PCRs כדי להבטיח תשואות גבוהות מספיק עבור שיבוט שלאחר מכן. בריכת PCRs ולטהר את הלהקה באורך מלא שוק (ג'ל או הערכה).
- לעכל גן מטוהרים בריכה כובע עם פאק אני עולה לי על שיבוט תוך שכפול, המוסמכת AAV פלסמיד שנשא AAV ITRS (חוזר מסוף כפולות, שכפול אותות אריזה), כמו גם את הגן AAV2 נציג. זה האחרון אמור להיות מלווה אותם אתרים כדי להתאים את הגן שווי הבריכה "במסגרת" (ראה איור 2. לפרטים נוספים). כדי להשיג עיכול מלא של מוצר ה-PCR, דגירה בין לילה עם האנזים עודף.
- ולקשור את שברי כובע לחתוך כראוי AAV ITR / נציג השדרה ביחס טוחנת 03:01. לעשות 40 μl נפח mastermix הכולל (מספיק ל -20 טרנספורמציות) בריכוז ה-DNA הסופית של 50 ג ng / μl ו דגירה הלילה בגיל 16 °
- להפוך את התגובה קשירת ידי ערבוב (על קרח) 2 μl עם 30 μl אלקטרו המוסמכת א ' coli (גדלה מ תאים מסחריים ועשה המוסמכת באמצעות כל פרוטוקול סטנדרטי). הוסף לתוך מראש מקורר cuvettes electroporation (1 הפער מ"מ) על קרח. Electroporate ב 1.8 kV, 200 Ω ו - 25 μF. זמן קבוע צריך להיות קרוב ל 5 ms. מיד להוסיף 1 מ"ל מחומם מראש בינוני SOC והעברה בקבוק 250 מ"ל. 20 electroporations כאלה תניב ספרייה עם מגוון של כ 1x10 6 שיבוטים שונים.
- הוסף 1 מחומם מראש בנפח בינוני SOC על התמורות אספו וללחוץ על 37 מעלות צלזיוס, 180 סל"ד עבור 1 שעה. ואז להעלות את הנפח הכולל ל 800 מ"ל עם מדיום LB בתוספת ampicillin (הריכוז הסופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל) ו - דגירה של 16 שעות אחר באותם תנאים. לטהר את ספריית ה-DNA פלסמיד באמצעות למשל. מגה Qiagen ערכת הכנה.
חובה על כל צעד 3.6: כדי לחשב את המגוון הספרייה מדויק, צלחת aliquOT הפתרון 800 מ"ל (לפני הדגירה ח 16) ב-LB ampicillin צלחות (למשל, 10 μl על הצלחת 10 ס"מ) ומושבות לספור ביום המחרת. כמו כן, כדי לאמת את יעילות דשדוש גבוהה, כגון רצף 24 שיבוטים וליישר אותם הגנים כובע ההורים (ראה גם איור. 8). לבסוף, כדי לאשר את החיוניות ספריית והגיוון תפקודית גבוהה, subclone אקראי הרים גנים לתוך כובע עוזר AAV פלסמיד ולהשתמש בהם כדי לייצר ולנתח וקטורים רקומביננטי בקנה מידה קטן (איורים 4-5) (ראה גם לשלב 5.4 להלן).
4. הפקה של ספריית ויראלי
- זרע 10 15 ס"מ 2 מנות של תאים HEK293T (4.5x10 6 תאים / צלחת) ו 48 שעות מאוחר יותר עם transfect 220 מיקרוגרם AAV ספריה ו 220 מיקרוגרם פלסמיד adenoviral (נדרש AAV התפשטות). לכן, מראש חם PEI (polyethylenimine) ו - 300 mM NaCl ב 37 ° C. לאחר מכן מערבבים 7.9 מ"ל NaCl ו-DNA, ולהוסיף H 2 O ל volu הכולללי 15.8 מ"ל. בצינור נפרד, לערבב 3.52 מ"ל PEI, 7.9 מ"ל NaCl ו 4.38 מ"ל H 2 O (כל הכרכים של עשר transfections). לשלב את תערובות (מערבולת) ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, לפני הפצת הפתרון באופן שווה על פני כלים (3 מ"ל לכל מנה).
- לאחר 48 שעות, לגרד את התאים לתוך המדיום ומסובב אותם ב 1200 סל"ד במשך 15 דקות. Resuspend תא גלולה במאגר 6 מ"ל תמוגה (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 50 מ"מ NaHCO 3) ובכפוף 5 בהקפאה ההפשרה מחזורים -80/37 (° C). דגירה עם 50 U benzonase לכל מ"ל של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס, לפני שצנח פסולת התא בסל"ד 3750 עבור 20 דקות.
- הכן 15%, 25% ו -40% (עם דילולים μl 2.5 / מ"ל phenolred) iodixanol מ 60% (OptiPrep ב-PBS ח"כ) מניות של PBS, ח"כ (1x PBS, 1 mM MgCl 2, 2.5 מ"מ KCl).
- הגדרת שיפוע לטיהור AAV באמצעות פיפטה פסטר להוסיף 5 מ"ל וירוס ההשעיה לתוך צינור Beckman מהיר חותם צנטריפוגות (14x89 מ"מ), ואחריו 1.5 מ"ל EACח של 15%, 25% והפתרון iodixanol 40%. למעלה את שיפוע עם חיץ תמוגה.
- Ultracentrifuge ב K 50.000 עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור Beckman Ti70.1. לאחר מכן לנקות את החלק החיצוני של הצינור עם אתנול 70%, מקל מחט לתוך החלק העליון של צינור אוורור ולצייר 1.2 מ"ל של חלק iodixanol 40% באמצעות מחט. תשמרי על עצמך כדי לא למשוך חלק מ 25% מכיוון שהיא מכילה ריקים capsids AAV.
5. מיון בחירה
- בשלב זה, ניתן גם חוזרת להגביר את הספרייה כולה בתאים בתרבית או בבעלי חיים עד capsids chimeric המציגים תכונות הרצויות צמחו (איורים 6-11).
- כדי לבחור בתאים בתרבית, שיתוף להדביק aliquots שונים של הספרייה (למשל, 1, 10 ו - 100 μl) ו adenovirus-5 לתמוך בצמיחה AAV. בדיקת וריאציות רבות של הספרייה עוזר adenoviral חיוני כמו infectivity הספריה סוג תא נתון לא ניתן לחזות. למסוקתאים לאחר ~ 3 ימים, לחלץ AAV מוגבר באמצעות הקפאה, הפשרה, adenovirus להשבית למשך 30 דקות ב 56 תאים חדשים מעלות צלזיוס, להדביק מחדש. חזור עד 5 פעמים עד capsids ברורים להיות מועשר (לאמת על ידי רצף).
- לבחירה אצל בעלי חיים, להדביק עם הספרייה ולחלץ הרצוי רקמות או תאים מסוג אחר שבוע ~ 1. לא לשתף להדביק עם adenovirus כמו זה יגרום רעילות לרעה על בעלי החיים. להציל את ה-DNA הנגיפי באמצעות PCR בעזרת פריימרים כמו פעם (איור 2), חוזרת לשבט בריכה כובע, לייצר ספריית חוזר טרי עד capsids ברורים להיות מועשר (לאמת על ידי רצף).
- התנאים המדויקים (נפח, titer, המסלול) לבחירת in vivo יהיה תלוי רקמות המטרה של עניין. עבור כבד, עכברים נגועים בדרך כלל עם 1x10 11 עד 12 1x10 חלקיקים נגיפיים בנפח כולל של 200 PBS μl באמצעות הזרקה לווריד הזנב (IV). הגורם המגביל הוא בדרך כלל titer ויראלי של originaהכנה אני, כי הזרקת AAV 12 1x10 ב μl 200 דורש titer של מ"ל לפחות 5x10 / 12, שלא במעבדות כל יכול להשיג באופן שגרתי. לפיכך, בעוד titer היותר מועיל זיהום 1 (כי הספרייה עדיין לא מועשר עבור capsids יעיל ברקמה מסוימת וייתכן ובכך יש infectivity הכוללת נמוכה יחסית), מומלץ להשתמש לפחות 1x10 11 חלקיקים לכל העכבר לבחירה הכבד.
- אם עכברים מרובים זמינים, כדאי מאוד להכניס מספר חלקיקים שונים הדומים בהרכבם הבחירה בתאים בתרבית, ולהשתמש כמה עכברים בכל קבוצה (ואז לרכז את כבדי שנאספו בתוך כל קבוצה) על מנת לצמצם שונות ולהגביר את ההצלחה ארנונה, למשל 3 עכברים בבית 1x10 11 ו -3 עכברים ב 12 חלקיקים 1x10.
- מאז AAV הוא וירוס פתוגניים שאינם ושכפול, פסול (ללא helpervirus), אין תופעות לוואי לחפש בהעדר עדןovirus.
- עבור euthanization, בעלי חיים היו anesthesized באמצעות מכשיר האדים isoflurane ו להרדים לאחר מכן באמצעות פריקה צוואר הרחם.
- הרקמות (כבד במקרה זה) נקצרו לאחר החיות אושרו להרדים. באופן כללי, אין צורך גם ברקמות אחרות perfuse החיות או למסוק AAV-נגועים איברים לפני המוות, שכן ה-DNA AAV יציב והוא יכול בקלות להיות ניצל מתאי / רקמות קפואות.
- ללמוד capsids יחיד (מהספרייה (שלב 3.6) או לאחר הבחירה (מדרגות 5.2-5.3)), לייצר וקטורים AAV קידוד גנטי הכתב (למשל, ה-GFP 6) על ידי ביצוע צעדים 4.1-4.5. לכן, לשבט את הגן שווי של עניין תוך עוזר AAV תקן פלסמיד 2. בשלב 4.1, משולש transfect את התאים עם 14.7 מיקרוגרם כל אחת AAV וקטור (קידוד הכתב), AAV עוזר וגם עוזר adenoviral. להדביק תאים בתרבית או בעלי חיים עם הנגיף מטוהרים בסכומים שונים determiנה יעילות התמרה למשל באמצעות FACS או במיקרוסקופ.
6. נציג תוצאות
השימוש בפרוטוקול שמתואר כאן בדרך כלל התוצאות ספריות ויראלי עם מגוון של כ 1x10 6 capsids ייחודיים אז מה שיכול להיות מוקרן עבור חלקיקים בודדים המציגים את רוב או את כל התכונות הרצויות על קו נתון נייד או בבעלי חיים. בחלק הבא, נספק דוגמאות מייצגות עבור תוצאות כאלה במבחנה או הקרנות vivo.
לפני כן, עם זאת, אנחנו רואים את זה חשוב שוב להדגיש את התועלת של ניתוח שיבוטים בודדים מספריית הפלסמיד המקורי הפונקציונליות שלהם והמגוון (לא חובה על כל צעד 3.6). הסיבה לכך היא כי שני האחרונים הם פרמטרים קריטיים תנאים מוקדמים עליונה להצלחת הבחירה של הספרייה ויראלי בפועל כי הוא עשוי ספריית פלסמיד. לכן, ניתן באופן אקראי לקחת אחת גררכובע הגנים ולהשתמש בהם כדי לייצר וקטורים AAV רקומביננטי (תמציות גסים או חלקיקים מטוהרים, תלוי במידה הרצויה של דיוק) המבטאים גן הכתב לזיהוי בקלות לכימות. Assay טיפוסי להשוות בין גרסאות שונות קפסיד אז הוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כפי שמוצג בדוגמה נציג איור. 4.
שיטה חלופית היא FACS מבוסס מדידה של ביטוי גנים ניאון כתב המחזיקה את היתרונות הנוספים הוא גם מאפשר להגדרה של ביטוי גנים לכל תא, בתוספת שזה עובד עבור תאים ההשעיה. איור. 5 מראה תוצאה אופיינית מניתוח כזה FACS מבוסס על הנפט הגולמי lysates AAV וקטור בסוגי תאים שונים.
כי את הבחירה המתואר לעיל של מפלצות כובע בודדים היא אקראית מוגבל, זה כמובן לא שימושי כגישה בפועל להעשרת המועמדים הרצויים. במקום זאת, הבחירה של viהספרייה RAL בתאים או ברקמות היעד בבעלי חיים מתאים יותר. כפי התנאים והפרמטרים ישתנו עם כל יישום, אנו רק להדגיש הנחיות נציג כמה ותוצאות.
הבחירה הקלה ביותר היא איטרטיבי הגברה הספרייה על שורות תאים בתרבית או תאים ראשוניים (שלב 5.2). מאז AAV דורש adenovirus שיתוף זיהום להפצת שלו, התאים היעד חייב להיות רגישים עבור adenovirus. אפשר לאחר מכן לגדול להדביק אותם למשל צלחות 6-המחזיקים גם מספרים סלולריים מספיקות לכל גם כדי להבטיח כיסוי מלא של הספרייה. המושג החשוב השני הוא כי מאזן AAV ו adenovirus הוא עדין, AAV יותר מדי ימנע adenovirus, בעוד העולה על זו האחרונה תהיה להרוג את התאים (בניגוד AAV, adenovirus גורמת לזיהומים ממס) לפני AAVs יוכלו לשכפל.
עם זאת, מאז infectivity ספריה לסוג תא מסוים אינו ידוע, למצוא AAV "טוב": יחס adenovirus באשר גם יכול להפיץ במקביל דורש בדיקה של שילובים שונים של מנות של הספרייה עוזר adenoviral (למשל 10:01, 01:01 ו - 01:10). ליתר ביטחון לזיהום adenovirus חזק הוא המופע של תופעות cytopathic שלושה ימים לאחר חיסון לנגיף, שמעידים עיגול התא ניתוק כפי שניתן לראות בתרשים. 6. ולהיפך, שימושיות לקריאה מתוך לזיהום AAV וגם הגברה הוא זיהוי של חלבונים על ידי קפסיד המערבי סופג, באמצעות נוגדנים B1 המכירה שמור ביותר AAV capsid epitope (איור 7) 7.
החלטה חשובה היא אז מה AAV גולמי תמציות לבחור לזיהום מחדש לאחר מכן של תאים חדשים (שלב 5.2). באופן אידיאלי, אחד ייקח את אלה שבהם קפסיד להקות AAV בולטים לפחות (איור 7), כי אלה מצביעים על זיקה הדוקה גנוטיפ, פנוטיפ. האחרון מתאר מצב שבו הגנום קידוד גרסה capsid שבטוחארוז ממש לתוך capsid המקביל. כדי להשיג ולשמור על זיקה הדוקה גנוטיפ, פנוטיפ היא המפתח לבחירה מוצלחת של מועמדים נגיפיים בודדים כפי שהוא בתורו מבטיח capsids בעלי תכונות הרצויות לספק את התבנית הגנטית מאותו מקור לתוך התאים במהלך סיבובים רצופים זיהום. לכן, מומלץ לבחור את תמציות גסים עם הביטוי capsid מתונה של זיהום מחדש ולהשתמש בכמויות מצומצמות. יחד, שתי צעדים כדי למנוע עומס יתר של תאים נדבקים עם קפסיד / הגנום שילובים שונים שעלולות להפריע הצמדה גנוטיפ, פנוטיפ פעם מחדש נגועים וירוסים להתחיל לשחזר מחדש את אריזת הגנום שלהם לתוך שאינם מאותו מקור capsids.
בנוסף, חשוב לעקוב אחר מגוון הספרייה במהלך סבבי דלקות חוזרות ונשנות של רצפי DNA. באופן אידיאלי, אחד ישים לב שינויים בהרכב שיבוטים בודדים המעידים על הבחירה המוצלחת, כלומר accumulation של שברי סרוטיפ והפסדים שונים של אחרים, כפי שהודגם בתרשים. 8. במקרה מושלם, רק מעטים או אפילו שיבוט אחד בסופו של דבר להתגלות אשר לאחר מכן ניתן לנתח כפי שתואר לעיל. אם, לעומת זאת, אין משמרות הם נצפו לאחר ארבעה או חמישה קטעים, צריך גם להגביר את הלחץ הבחירה (ראו דיון), או סבור כי הקו הסלולרי משמש אולי כי זה בלתי הולם עלולים לסבול מדי מהזנים אליהם יותר מדי.
עבור הגברה ספריית in vivo (שלב 5.3), אותם כללים חלים ושיקולים, עם שני הבדלים קריטיים: ראשית, לא שיבוטים מסך שנבחרו באופן אקראי בבעלי חיים, בשל העלויות הכרוכות ושיקולים אתיים. שנית, אף אחד לא ישתפו להדביק עם adenovirus עוזר כפי שהוא גורם רעילות או הרוגים בבעלי חיים, וכן זיקה adenoviral היה להגביל את הבחירה תאים רגישים לנגיף עוזר. במקום זאת, ספריה AAV הוא החדיר לתוך הדואר בעלי חיים, שניצלו מתאי היעד / רקמה על ידי ה-PCR (איור 9) ולאחר מכן מחדש משובט מחדש ארוז לסיבוב זיהום חדש. כמו בכל בחירה בתרבות, תהליך זה חוזר על עצמו עד מועמדים בודדים צמחו.
ללא קשר הליך הבחירה, השלב האחרון הוא אימות של גרסאות קפסיד המועשר מערכות מתאימות. תאנים. 10 ו -11 מייצגים להראות דוגמאות הבחירה הקודמת שלנו של מפלצות AAV המבצעות באופן יוצא מן הכלל בתרבות רקמה או הכבדים של העכברים. כפי שניתן לראות באיור. 10, 1 שיבוט בפרט (AAV-DJ 3) אכן בביצועיו אוסף של שמונה wildtypes AAV טבעי במגוון רחב של שורות תאים. לבסוף, עוד שיבוט שנבחר קווי hepatoma בתרבית מפגין זיקה גבוהה יותר כבד Murine ובהתאם פחות מחוץ המיקוד כאשר חדורים שולי מ וקטור AAV8 עוצמה שליטה נבדק com ישירה לעכברים בוגריםparison (איור 11). שים לב, אם כי להיות יותר ספציפי לכבד, שיבוט AAV-DN למעשה transduces את האיבר קצת פחות יעיל מאשר AAV8. מבחינה זו, AAV-DN היא דוגמה מייצגת טובה לתוצאה של האבולוציה AAV ובחירת המועמדים הסופיים שבהם בדרך כלל להציג מספר תכונות רצויות, אך אינם מושלמים בהכרח בכל ההיבטים.
איור 1 תוכנית:. הנדסה סינתטי AAV capsid באמצעות DNA המשפחה דשדוש ובחירת הבאים בתאים או בבעלי חיים. צעדים פרוטוקול מודגשים באפור.
2. איור AAV גן שווי התורם פלסמידים הנמענים להשתמש במעבדה שלנו על ה-DNA המשפחה גרירת רגליים ודור הספרייה. לציין כי אלה דוגמאות מייצגות בלבד, וכי האתרים המדויקים רצפיםיכול להיות מותאם אישית. התורם הבסיסי שלנו פלסמיד נגזר זמינים מסחרית pBlueScript II KS (+) וקטור שאנו מהונדסים להכיל מחייב פריימר הראו כמו גם אתרי הגבלה, מתואר על ידי חצים או משולשים, בהתאמה. אנחנו משובטים אז הגנים כובע של AAV קפסיד 1-9 (מוגבר עם primers capF / R) לתוך פלסמיד זה, להיות מוקף פאק אני עולה אתרים שאני הגבלה. Primers T3 ו - T7 משמשים בידוד שווי בשלב 2.2, תוך הגברה מאוחר יותר מחדש התאספו רצפים chimeric (שלב 3.2) ניתן להשיג באמצעות משני זוגות פריימר SAF / R או CUF / R, או הן PCR מקוננת. הנמען שכפול-המוסמכת הפלסמיד נושא חוזר AAV מסוף הפוכים (ITRS, שכפול אותות האריזה) משני צדי הגן AAV2 נציג בשליטת היזם AAV P5. פאק אני עולה אתרים שאני הגבלת במורד הזרם של נציג לאפשר "במסגרת" שיבוט הבריכה של דשדש גנים כובע.המוצגים פריימר Lseq אתרי הקישור שימושיים שווי רצף הגן (שלב 3.6).
איור 3. דוגמא DNase אני תקציר של גנים שווי שוק (AAV2, 8 ו - 9). המוצג הוא ג'ל אלקטרופורזה agarose ניתוח של תוצרי גנים שווי מעכל באמצעות פעמים הצביע דגירה שונים (דקות: שניות). ליין U מראה שווי מעוכלים קלט שבר בריכת כמו שליטה. גודל של סמן להקות ה-DNA של נתיבי M נמצאים kilobases. בדוגמה זו, אידיאלי מעכל התקבלו עם זמני הדגירה של 1:45 או 2:00 דק ', אשר הניב את שיא העיקרי המועדף סביב 100 עד 500 זוגות בסיסים (תיבת צהוב).
איור 4. דוגמה לניתוח מיקרוסקופיה מבוססת על שלוש שורות תאים אנושיים נגועים 5 שונה יש רקומביננטי AAV Yfp-להביעctors (שמות על גבי) עשה עם גנים כובע גררה את רגליה נבחר באקראי מתוך הספרייה המקורי מבוסס על AAV2, 8 ו -9.
איור 5. דוגמה לניתוח FACS מבוסס על ארבעה סוגי תאים נגועים (על פי עשרה דילולים סדרתיים) עם 18 שונים Yfp-לבטא וקטורים רקומביננטי AAV (שמות על גבי, כולל אלה של איור 4.) עשה עם גרר גנים כובע שנבחרו באופן אקראי מהספרייה המקורית (AAV2, 8 ו - 9). הביטוי Yfp היה בצבעים להדמיה יותר קל. אחוזי המתוארים הם של transduced תאים, לפיה שחור תמיד מצביע על 0% לבן המספר הגבוה ביותר נמדד כל סוג תא. B2 Clone (אדום) מדגים שיבוט עם היעילות הכוללת העניים, כפי שניתן לצפות מן capsids נבחרו. שים לב, ניתוח FACS רגיש יותר והוא יכול לשמש גם עבור תאים ההשעיה (כגון SupT1) כי הם נוחים פחות במיקרוסקופ. הו, אנושי, MU, murine.
איור 6. מראה אופייני של תופעות cytopathic בתאים (הלה במקרה זה) אחרי פרודוקטיבי שיתוף זיהום AAV ו adenovirus. תאים נותרו גם נגוע (פאנל שמאל למעלה) או נגוע הסכומים המצוין (חלקיקים לכל תא) של adenovirus.
איור 7. גילוי של ביטוי החלבון capsid AAV ידי המערבי סופג כמדד לזיהום ספריה הגברה. כתם שמאל מראה תאים נגועים שיתוף עם אמצעי אחסון שונים (ב μl) של הספרייה AAV ו adenovirus עוזר. הראשונים שני נתיבים הם דוגמאות טובות לדוnditions מניב להבחין בקושי ביטוי AAV חלבון, המציין מספקת אך לא מופרזת זיהום AAV וגם הגברה ולכן הצמדה הרצוי חזק גנוטיפ, פנוטיפ. לכן, 0.1, 1 או 10 μl של supernatants אלה שימשו זיהום מחדש של תאים חדשים (כתם מימין). התאים לנתיב C נדבקו AAV לבד כביקורת שלילית (אין ביטוי לזיהוי בשל העדר helpervirus).
איור 8. השוואת רצפי חלבונים (במדבר הם חומצות אמינו) של AAV שיבוטים מהספריה מבוססת על AAV2, 8 ו 9 לפני ואחרי הבחירה. רצפים מעל הקו האדום להראות את AAVs ההורים. החצים הסגולים מציינים הומולוגיים אירועים רקומבינציה. החץ האדום מסמן צולבות על בין AAV2 ו AAV9 ציין את כל שיבוטים שנבחרו.
איור 9. </ Rescue> חזקה של נגוע בהצלחה שיבוטים AAV מרקמות העכבר באמצעות PCR. בדוגמה זו, AAV גנים כובע היו PCR-הגברה של כבדי עכבר חילוץ שבוע לאחר עירוי ספריית היקפי, באמצעות זוג פריימר SAF / R (איור 2). ליין 1 מציג את הלהקה הצפוי 2.2 kilobase, ואילו במסלול 2 היא השליטה הלא התבנית. בעקבות פאק אני והגבלת עולה לי, השברים היו מוגבר מחדש משובטים אל הנמען המקורי פלסמיד (איור 2) לייצור לאחר מכן מחדש עירוי של ספריה משנית. גודל של סמן ה-DNA של להקות M נתיבים מסומנים ב kilobases.
איור 10. דוגמה עבור ביצועים מעולים של AAV מועשר הכימרה בתאים בתרבית. Clone AAV-DJ דווחה על ידינו לפני 3, אלא בעיקר מהווה הכלאה בין קפסיד AAV 2, 8 ו -9, ו נבחר מתוך librar Y המכיל את שלושת בתוספת 5 קפסיד נוספים בתאי כבד אנושיים בנוכחות נסיובי אדם אספו. כדי להשוות את היעילות שלה לשמונה קפסיד טבעיים AAV (מסומנת 1-6, 8 ו -9 על גבי), גנים כל כובע נעשה שימוש כדי לייצר מטוהרים עצמית משלימים Gfp-לבטא וקטורים 8,19. אלה היו מנורמל להכיל 2x10 9 הגנום וקטור לכל מ"ל ולאחר מכן השתמשו כדי transduce את שורות תאים מופיע בצד של פי עשרה דילולים סדרתיים. שלושה ימים לאחר מכן, GFP-לבטא תאים נספרו ו titers זיהומיות נקבעו על ידי לקיחה בחשבון את גורם לדילול. בניגוד לקוד באיור. 5, בצבעים כהים כאן עולה infectivities גבוהים יותר לכל מספר החלקיקים. כפי שניתן לראות, שנבחר AAV-DJ כימרה בביצועיו את כל wildtypes AAV הטבע, הממחיש את ההצלחה של תוכנית הבחירה מיושם. fibr, fibroblasts, חה, אוגר, הו, אדם, MU, Murine, סי, סימיאן.
איור 11. דוגמה לניתוח של AAV נבחרת כימרה בכבד העכבר. Clone AAV-DN נבחרה על תאים hepatoma Murine ולאחר מכן להשתמש כדי לייצר וקטורים בלוציפראז-להביע רקומביננטי 8. המוצגים הם עכברים נציג (3 לכל קבוצה) שבוע לאחר עירוי היקפי של מנות שוות של וקטור זה או שליטה על AAV8 wildtype, אחד החזקים ביותר מבודד טבעיים הידועים בכבד העכבר 9. שים לב כי בזמן שיבוט AAV-DN נותן ביטוי מעט הכוללת פחות בכבד (פאנל (אני)), היא ספציפית יותר על האיבר הזה שכן הוא מציג באופן משמעותי פחות מחוץ למיקוד של הכבד ללא רקמות פעם אחת את הביטוי רמות כבד היה התאמה באמצעות תוכנת הדמיה (פאנל (II)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה, יש לנו התווה צעדים ניסיוניים חיוניים והנחיות AAV capsid הנדסת באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים ועל האבולוציה בתאים או בבעלי חיים. בעיקרו של דבר, פרוטוקולים אלה הן גרסאות סטנדרטיות של הנהלים שאנחנו דיווח לראשונה בתחום AAV בשנת 2008 3. בעוד גל של מחקרי מעקב על ידי אחרים דיווחו למשל שינויים רבים, 10-13, הגרסאות הנוכחיות שלנו מייצגים אסטרטגיות בסיסיות מניב תוצאות לשחזור בעת היותו מקובל דרוג-up והתאמה לכל הצרכים.
למרות מאמצינו לתקנן את ההליך כולו, צעדים מסוימים עדיין דורשים גישות ניסוי וטעייה מבוסס. זה חל במיוחד על פיצול שווי הגן בשל העובדה כי DNase אני רגיש מאוד לתנאי התגובה, כגון זמן הדגירה (ראה דוגמאות באיור. 3). נקבל את התוצאות הטובות ביותר עם שברי החל בטווח של100 עד 500 זוגות בסיסים ובכך ממליצים לנסות תנאים שונים DNase (למשל, כמויות של פעמים האנזים הדגירה) עד תמונה ג'ל דומה נתיבים בארגזים שבאיור. 3.
אי אפשר גם כן באופן מלא סטנדרטיזציה צעדים בודדים במהלך בחירת ספריה תרבית תאים. כאמור, היבט חשוב הוא חוסר הוודאות לגבי infectivity של ספריה חדשה או של adenovirus בסוג תא מסוים, המחייב מדידות עקיפות כגון Western תיאר סופג. למרבה המזל, על פי הניסיון שלנו, מציאת "טובים" AAV / adenovirus כרכים חיסון בדרך כלל לוקח רק כמה מאמצים מקבילים ספורות.
שיקולים דומים חלים על בחירת ספריה AAV אצל בעלי חיים אשר גם באופן אידיאלי כרוכה בדיקה בו זמנית של מספר פרמטרים (למשל, מנות של הספרייה ויראלי, נקודת הזמן של היבול לאחר חיסון בהזרקה, כביש) בשל חוסר אפשרויות ניסיוניות כדי predic ישירותלא הספרייה infectivity in vivo. באופן כללי, חשוב לציין כי בבחירת vivo הוא בדרך כלל הרבה יותר מבחינה פיזיולוגית רלוונטי, מכמה סיבות, כולל פער ידוע בין infectivities AAV במבחנה in vivo 3. יתר על כן, באבולוציה vivo מאפשר להחדיר את הספרייה באותו אופן כי בסופו של דבר לשמש בסביבה קלינית. זה מספק הזדמנות לא רק להעשיר את capsids כי potently להדביק את סוג התא הרצוי, אבל חשוב לעשות זאת בדרך מקובלת משלוח.
ללא קשר למערכת הבחירה, בדרך כלל אנחנו רואים את זה עדיף לשלב לחצים חיוביים ושליליים כפי שהוא יגדיל את סיכויי העשרת מועמדים בודדים. אחת הסיבות האחרון הוא הסיכוי capsids נבחרים אך ורק תחת לחץ חיובי (למשל, הצמיחה לסוג תא מסוים) גם עדיין potently שיתוף להדביק תאים אחרים (א) לקולטן התאי (ים). הסיבה השנייה היא סוג תא היעד יכול כבר להיות רגישים וירוסים קלט כמה מספריה, הקטנת הסיכוי להעשיר capsids גם יעילים יותר בהיעדר לחץ שלילי נוסף.
דוגמה אחת עבור השנייה כי השתמשנו בהצלחה לפני הגברה הוא הספרייה בנוכחות נסיובי אדם נקווה המכיל נוגדנים נגד קפסיד AAV הרווחות באוכלוסייה האנושית. בניגוד פחות הליכי הבחירה מחמירים החלים במקביל, רק זה שילוב של לחץ חיובי ושלילי אפשרה לנו לחלץ שיבוט אחד (AAV-DJ, איור. 10) מתוך ספריה של כ 7x10 5 גרסאות 3.
בכל מקרה, נרצה לנסח מחדש את החשיבות של בדיקות capsids עופרת מספר העולים מתוך תוכנית הבחירה, ולא רק מועמד העליון. למעשה, אפשר גם כי שיבוטים השני או השלישי שולטים ביותר הם לא פחות או אפילו מ 'בצר שימושי יותר מאשר המועמד המוביל, ו / או עשויות להציג פנוטיפים רצוי עוד יותר על יישום נתון. ולכן אנו ממליצים תמיד לקחת לפחות שני capsids יותר מהרשימה הסופית של המועמדים לאחר השלמת פרוטוקול הבחירה ללמוד אותם כפי שמתואר בשלב 5.4.
אחרון חביב, אנו מבקשים לחזור ולהדגיש כי משפחת ה-DNA של גרירת רגליים אינה השיטה היחידה להנדסת AAV. גישות חלופיות כוללות הכנסת מוטציות נקודה אקראית בתוך הגן AAV בפרט שווי דרך מועדת לטעויות PCR 14,15, כמו גם את התצוגה של ספריות פפטידים באזורים חשופים של AAV מסוים capsid 4,5. תוך דיון מקיף או השוואת גישות אלו ניתן למצוא במקומות אחרים 16-18, נוכל בקלות להסיק כי על רקע זה שפע של אפשרויות, עתיד בתחום הנדסת AAV ואבולוציה בהחלט בהיר מאוד ויש לו כנראה רק החלה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל היוצרים מצהירים כי אין להם מה לחשוף.
Acknowledgments
החוקרים בתודה להכיר תמיכה יוצאת דופן של המעבדה שלהם, חברי הצוות ולעבוד לפי אשכול של אקסלנס CellNetworks באוניברסיטת היידלברג, כמו גם על ידי Chica והיינץ שאלר (CHS) קרן. אנו מעריכים כי אבולוציה מולקולרית AAV באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים הפך להיות פעיל מאוד בתחום מאז הפרסום הראשוני שלנו לפני שלוש שנים, ולכן מתנצל בפני כל כותבי פרסומים רלוונטיים שעבודתם לא ניתן לצטט כאן בגלל אילוצי מקום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S (part of kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| Ampicilin sodium salt | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Heating block | BIOER | MB-102 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS analyser | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | Custom primer | |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
