Summary
Vi viser den grunnleggende teknikken til å molecularly konstruere og utvikle syntetiske Adeno-tilknyttede viral (AAV) genterapi vektorer via DNA familie shuffling. Videre gir vi generelle retningslinjer og representative eksempler for utvalg og analyse av individuelle chimeric capsids med forbedrede egenskaper på målceller i kultur eller i mus.
Abstract
Adeno-tilknyttede viral (AAV) vektorene representerer noen av de mest potente og lovende biler for terapeutisk human genoverføring grunn av en unik kombinasjon av gode egenskaper 1. Disse inkluderer apathogenicity av de underliggende hvete virus og de svært avanserte metoder for produksjon av høy-titer, høy renhet og klinisk-grade rekombinante vektorer 2. En ytterligere spesiell nytte av AAV systemet over andre virus er tilgjengeligheten av et vell av naturlig forekommende serotypene som avviker i vesentlige egenskaper ennå kan alle enkelt konstruert som vektorer ved hjelp av en felles protokoll 1,2. Videre har en rekke grupper, inkludert vår egen nylig utviklet strategier for å bruke disse naturlige virus som maler for å lage syntetiske vektorer som enten kombinerer eiendelene til flere input serotyper, eller som forbedrer egenskapene til en enkelt isolere. De respektive teknologier for å oppnå disse målene are enten DNA familie tre shuffling, dvs. fragmentering av ulike AAV kapsid gener etterfulgt av sin re-montering basert på partielle homologies (typisk> 80% for de fleste AAV serotype), eller peptid visning 4,5, dvs. innsetting av vanligvis syv aminosyrer inn en utsatt løkke av viral kapsid der peptid ideelt formidler re-målretting til en ønsket celletype. For maksimal suksess, er begge metodene brukes i en high-throughput fashion der protokollene er opp-skaleres til å gi bibliotekene i rundt en million forskjellige kapsid varianter. Hver klone er da består av en unik kombinasjon av mange foreldre virus (DNA shuffling tilnærming) eller inneholder en særegen peptid innenfor samme viral ryggraden (peptid visning tilnærming). Den påfølgende siste trinnet er iterativ valg av et slikt bibliotek på målceller for å berike for individuelle capsids oppfyller de fleste eller ideelt sett alle krav i utvelgelsesprosessen. Sistnevnte helst kamInes positivt press, for eksempel vekst på en bestemt celletype av interesse, med negativ seleksjon, for eksempel eliminering av alle capsids reagerer med anti-AAV antistoffer. Denne kombinasjonen øker sjansen for at syntetiske capsids overlevende utvalget svarer behovene til den enkelte søknaden på en måte som trolig ikke ville ha blitt funnet i noen naturlig forekommende AAV isolere. Her fokuserer vi på DNA familien shuffling metode som teoretisk og eksperimentelt mer utfordrende av de to teknologiene. Vi beskriver og demonstrerer alle nødvendige skritt for generering og valg av stokkes AAV bibliotekene (Fig. 1), og deretter diskutere fallgruver og kritiske aspekter ved de protokoller som man trenger å være klar over for å lykkes med molekylær AAV evolusjon.
Protocol
1. Utarbeidelse av Plasmid sett koding AAV kapsid Genes
- For å lette rutine utarbeidelse av tilstrekkelige mengder av de ulike AAV kapsid (CAP) genene for påfølgende DNA shuffling, først subclone disse genene inn i en felles plasmid ryggrad. Det er viktig å inkludere identiske flankerer sekvenser av> 20 nukleotider for senere bruk som primer bindingssteder for nestet PCR og kloning (Fig. 2).
- Bruk av egnede primere (se tabell for eksemplarisk primere for AAV5), PCR forsterke ønskede cap gener fra lett tilgjengelige AAV plasmider som vanligvis inneholder AAV2 rep genet siden hetten genet av valget. Fordi PCR produktet vil bli brukt for standard kloning, er ~ 1 mikrogram av renset produkt allerede tilstrekkelig, og noen konvensjonell PCR protokollen kan dermed brukes.
- Fordøye renset PCR produkt (for eksempel ved bruk agarose gel rensing eller en standard PCR rensing kit) ogmottaker plasmidet med restriksjonsenzymer som anerkjennelse nettsteder er til stede i de primere som brukes for cap forsterkning (1,1) så vel som i mottakeren plasmidet. I vår lab, bruker vi Pac jeg og ASC I områder (Fig. 2) som de er fraværende i de fleste AAVs.
2. DNase-baserte Cap Gene fragmentering
- PCR forsterke cap gener ønsker fra de plasmider som genereres i trinn 1.1-1.3. En reaksjon som beskrevet nedenfor vil gi ~ 3 mikrogram av PCR produktet. Avhengig av antall cap gener som skal inkluderes i biblioteket, for dette er nok opp til seks tassende reaksjoner.
- For PCR, sette opp en 50 mL reaksjon inneholder 200 ng cap plasmid, hver primer på 2 mM endelig konsentrasjon, 10 mL 5x Hifi buffer og en mL Hifi polymerase. Start med 5 minutter ved 95 ° C og deretter kjøre 40 runder med 15 sek 94 ° C, 30 sek 57 ° C og 3 min 68 ° C, etterfulgt av et siste 10 min skritt72 ° C. Renser PCR produktene via gel eller kit og deretter sette opp en kontrollert DNase digest å skape cap genet fragmenter for remontering i chimeras.
- Derfor like blande de ulike cap PCR-produkter til et samlet beløp på 4 mikrogram i 54 mL H 2 O. Legg 6 mL DNase reaksjon buffer og 0,5 mL DNase jeg til reaksjonen, nøye bla tre ganger, snurre kort og umiddelbart sette på en 25 ° C oppvarming blokk. Inkuber mellom 1 og 2 min (satt opp flere parallelle reaksjoner og avslutte dem i trinn på 15 sek), deretter stoppe reaksjonen ved å tilsette 6 mL 25 mM EDTA og med kort virvling og ruger 10 min ved 75 ° C.
- Renser cap fragmentene på en standard 1% agarose gel. Ideelt sett burde en smear være synlig mellom 100 og 500 basepar. Siden DNase Jeg er en svært potent enzym, riktig håndtering og timing er viktig på dette trinnet, og flere variasjoner i inkubasjonstiden i trinn 2.3 kan være behov for optimale results (Fig. 3). Renser eluted DNA ved hjelp av en standard kit og bestemme konsentrasjonen.
3. DNA Family shuffling
- Først re-montere cap fragmentene i full lengde sekvenser via en PCR der de selv-prime basert på partielle homologies. Derfor setter opp et 50 mL reaksjon med 500 ng rensede fragmenter (trinn 2,4), 10 mL 10x Phusion buffer, 1 mL 10 mm dNTPs, 1,5 mL DMSO og 0,5 mL Phusion II polymerase. Inkuber 30 sek ved 98 ° C og deretter kjøre 40 runder med 10 sek 98 ° C, 30 sek 42 ° C og 45 sek 72 ° C, etterfulgt av et siste 10 min skritt ved 72 ° C.
- I en påfølgende andre PCR, forsterke de re-monterte cap gener for påfølgende kloning, bruke primere som binder til de bevarte flankerer sekvenser (fig 2). Derfor setter opp et 50 mL reaksjon inneholder 2 mL av den første PCR (trinn 3,1), hver primer på en endelig konsentrasjon på 2 mM 0,5 mL MgCl2,10 mL 5x Hifi buffer og en mL Hifi polymerase. Vi anbefaler å kjøre 16-24 PCRs å sikre tilstrekkelig høy avkastning for påfølgende kloning. Pool de PCRs og rense full lengde cap band (gel eller kit).
- Fordøye renset lokket genbasen med Pac jeg og Asc jeg for kloning til et replikering-kompetent AAV plasmidet bærer AAV ITRs (inverterte terminal gjentar; replikering og emballasje signaler) samt AAV2 rep genet. Sistnevnte bør følges av de samme nettstedene for å imøtekomme hetten genet pool "i ramme" (se fig. 2 for detaljer). For å oppnå fullstendig fordøyelsen av PCR produktet, inkuber natten med overflødig enzym.
- Ligate de cap fragmenter og hensiktsmessig kutte AAV ITR / rep backbone på en 3:1 molar ratio. Lag en 40 mL totalt volum Mastermix (tilstrekkelig for 20 transformasjoner) med en endelig DNA konsentrasjon på 50 ng / mL og inkuber natten ved 16 ° C.
- Transform ligation reaksjon ved å blande (på is) 2 mL med 30 mL elektro-kompetent E. coli (vokst fra kommersielle celler og laget kompetent bruke noen standard protokoll). Legg inn pre-underkjølte electroporation kyvetter (1 mm gap) på is. Electroporate på 1,8 kV, 200 Ω og 25 μF. Tiden konstant bør være nær 5 ms. Umiddelbart tilsett 1 ml forvarmes SOC medium og overføring til en 250 ml flaske. 20 slike electroporations vil gi et bibliotek med et mangfold av om lag 1x10 6 forskjellige kloner.
- Tilsett 1 volum forvarmes SOC medium til de oppsamlede transformasjoner og rist ved 37 ° C og 180 rpm i 1 time. Så få opp det totale volumet til 800 ml med LB medium pluss ampicillin (endelig konsentrasjon på 50 mikrogram / ml) og inkuberes for en annen 16 timer under de samme vilkår. Rense biblioteket plasmid DNA ved hjelp av f.eks. en Qiagen Mega prep kit.
Valgfritt på trinn 3.6: For å beregne nøyaktig bibliotek mangfoldet, plate en aliquot av 800 ml løsning (før 16 timers inkubering) på LB-ampicillin plater (f.eks 10 mL på en 10 cm plate) og teller kolonier neste dag. Også for å validere høye tassende effektivitet, sekvens f.eks 24 kloner og justere dem til foreldrenes cap genene (se også fig. 8). Til slutt, for å bekrefte bibliotek vitalitet og høy funksjonell mangfold, subclone tilfeldig plukket cap gener inn i en AAV hjelper plasmid og bruke dem til å produsere og analysere rekombinante vektorer i liten skala (Fig. 4-5) (se også trinn 5.4 nedenfor).
4. Produksjon av Viral Library
- Seed 10 15 cm 2 retter av HEK293T celler (4.5x10 6 celler / oppvask) og 48 timer senere transfektere med 220 mikrogram AAV bibliotek og 220 mikrog adenoviral plasmid (nødvendig for AAV formering). Derfor forvarme PEI (polyethylenimine) og 300 mM NaCl ved 37 ° C. Bland deretter 7,9 ml NaCl og DNA, og legg H 2 O til en samlet volumeg på 15,8 ml. I en separat rør, blande 3,52 ml PEI, 7,9 ml NaCl og 4,38 ml H 2 O (alle volumer for ti transfections). Kombiner de mikser (vortex) og inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur, før du distribuerer løsningen jevnt over rettene (3 ml per fat).
- Etter 48 timers, skrape av cellene i medium og spinne dem ned ved 1200 rpm i 15 min. Resuspender cellen pellet i 6 ml lysis buffer (50 mM Tris-HCl 8,5 pH, 50 mM NaHCO 3) og underlagt 5 fryse-tine sykluser (-80/37 ° C). Inkuber med 50 U benzonase per ml i 1 time ved 37 ° C, før spinning ned celleavfall ved 3750 rpm i 20 min.
- Forbered 15%, 25% og 40% fortynninger (med 2,5 mL / ml phenolred) fra en 60% iodixanol (OptiPrep i PBS-MK) lager i PBS-MK (1x PBS, 1 mm 2 MgCl, 2,5 mM KCl).
- Sett opp en gradient for AAV rensing ved hjelp av en Pasteur pipette for å legge 5 ml virus suspensjon i en Beckman Quick-Seal sentrifugerør (14x89 mm), etterfulgt av 1,5 ml EACh på 15%, 25% og 40% iodixanol løsning. Toppen av gradient med lysis buffer.
- Ultrasentrifuger på 50.000 K for 2 timer ved 4 ° C i en Beckman Ti70.1 rotor. Deretter rengjør utsiden av røret med 70% etanol, stikke en nål inn i toppen av røret for ventilasjon og trekke 1,2 ml av 40% iodixanol brøkdel hjelp av en nål. Pass på å unngå å trekke fra 25% fraksjonen som den inneholder tomme AAV capsids.
5. Screening og utvelgelse
- På dette punktet, kan man enten iterativt forsterke hele biblioteket i dyrkede celler eller dyr til chimeric capsids stiller ønskede egenskaper har dukket (Fig. 6-11).
- Slik velger i dyrkede celler, co-infisere ulike alikvoter av biblioteket (f.eks 1, 10 og 100 mL) og adenovirus-5 til støtte AAV vekst. Testing flere varianter av bibliotek og adenoviral hjelperen er viktig som bibliotek smittsomhet i en gitt celle type kan ikke forutsies. Høsteceller etter ~ 3 dager, pakke forsterket AAV via fryse-tine, inaktivere Adenovirus i 30 min ved 56 ° C og re-infisere nye celler. Gjenta opptil 5 ganger til forskjellige capsids bli beriket (validere ved sekvensering).
- For valget i dyr, infisere med biblioteket og trekke ønsket vev eller celletype etter ~ 1 uke. Ikke co-smitte med Adenovirus som dette vil føre til negative effekter på dyrene. Rescue viral DNA via PCR bruke de samme primerne som før (Fig. 2), re-klone cap bassenget, produsere et friskt bibliotek og gjenta inntil distinkte capsids bli beriket (validere ved sekvensering).
- De eksakte betingelser (volum, titer, rute) for valg in vivo vil avhenge målvevet av interesse. For lever, er mus vanligvis smittet med 1x10 11 til 1x10 12 viruspartikler i totalt volum på 200 mL PBS via halen åre injeksjon (IV). Den begrensende faktoren er vanligvis viral titer av original forberedelse, fordi injeksjon av 1x10 12 AAV i 200 mL krever en titer på minst 5x10 12 / ml, som ikke alle laboratorier kan rutinemessig oppnå. Derfor, mens en maksimal titer er gunstig for den første infeksjon (fordi biblioteket ikke har blitt beriket etter effektive capsids i en gitt vev og kan dermed ha en forholdsvis lav samlet smittsomhet), vil vi anbefale å bruke minst 1x10 11 partikler per mus for leveren valg.
- Hvis flere mus er tilgjengelig, er det svært nyttig å injisere ulike partikler tall beslektet med utvalget i dyrkede celler, og å bruke flere mus per gruppe (og deretter pool innsamlede lever innenfor hver gruppe) for å minimere variasjon og for å øke suksess priser, f.eks tre mus ved 1x10 11 og 3 mus på 1x10 12 partikler.
- Siden AAV er en ikke-sykdomsfremkallende og replikering-inkompetent (uten helpervirus) virus, er det ingen bivirkninger å se etter i fravær av Adenovirus.
- For euthanization, ble dyrene anesthesized bruker en isofluran vaporizer og senere avlives via cervical forvridning.
- Vev (lever i dette tilfellet) ble høstet etter at dyrene ble bekreftet avlives. Generelt er det ikke behov også for andre vev til perfuse dyrene eller å høste AAV-infiserte organer før døden, siden AAV DNA er stabil og kan lett bli reddet fra frosne celler / vev.
- Å studere enslige capsids (fra biblioteket (trinn 3,6) eller etter valget (trinn 5.2-5.3)), produsere AAV vektorer som koder en reporter gen (f.eks 6 GFP) ved å følge trinnene 04.01 til 04.05. Derfor klone hetten genet av interesse i en standard AAV hjelper plasmid to. På trinn 4,1, trippel-transfektere cellene med 14,7 mikrogram hver av AAV vektor (koding reporteren), AAV hjelper og adenoviral helper. Infisere dyrkede celler eller dyr med renset virus på forskjellige mengder og bestemne transduksjon effektivitet f.eks via FACS eller mikroskopi.
6. Representative Resultater
Bruk av protokollen er skissert her vanligvis resulterer i virale biblioteker med et mangfold av om lag 1x10 6 unike capsids som deretter undersøkes for enslige partikler som viser mest eller alle ønskede egenskaper på en gitt celle linje eller i dyr. I det følgende vil vi gi representative eksempler for resultatene fra slik in vitro eller in vivo screeninger.
Før det, men anser vi det som viktig å igjen påpeke nytten av å analysere individuelle kloner fra den opprinnelige plasmidet biblioteket for sin funksjonalitet og mangfold (valgfritt på trinn 3,6). Dette er fordi de to sistnevnte parametrene er ytterste kritiske forutsetninger for å lykkes med valg av selve viral biblioteket som er laget av plasmidet biblioteket. Derfor kan en tilfeldig plukke enkelt stokketcap gener og bruker dem til å produsere rekombinante AAV vektorer (råolje ekstrakter eller renset partikler, avhengig av ønsket grad av nøyaktighet) uttrykker en lett synlig og kvantifiserbare reporter genet. En typisk analyse for å sammenligne de ulike kapsid variantene er så fluorescens mikroskopi, som vist i representativt eksempel i fig. 4.
En alternativ metode er FACS-basert måling av fluorescerende reporter genuttrykk som innehar de ekstra fordelene som det også gir mulighet for bestemmelse av genekspresjon per celle, pluss at det fungerer for suspensjon celler. Fig. 5 viser et typisk resultat fra en slik FACS-basert analyse av råolje AAV vektorgrafikk lysates i ulike celletyper.
Fordi ovenfor beskrevet utvalg av individuelle cap chimeras er tilfeldig og begrenset, er det selvfølgelig ikke nyttig som en faktisk tilnærming til anrikning av ønskede kandidater. I stedet valg av viral bibliotek i målcellene eller vev i dyr er mer hensiktsmessig. Som tilstander og parametere vil variere med hver applikasjon, vil vi bare markere noen representative retningslinjer og resultater.
Det enkleste valget er iterativ bibliotek forsterkning på dyrkede cellelinjer og primære celler (trinn 5,2). Siden AAV krever Adenovirus co-infeksjon for formering sin, må målcellene være mottakelige for Adenovirus. Man kan da vokse og infisere dem, f.eks i seks-brønns plater som holder et tilstrekkelig antall celler per brønn for å sikre full dekning av biblioteket. Et annet viktig begrep er at balansen av AAV og Adenovirus er delikat, for mye AAV vil hemme Adenovirus, mens et overskudd av sistnevnte vil drepe cellene (i motsetning AAV, forårsaker Adenovirus lytiske infeksjoner) før AAVs kunne replikere.
Men siden bibliotek smittsomhet på en bestemt celletype er ukjent, finne "gode" AAV: adenovirus forholdstall påsom både kan forplante krever parallell testing av ulike kombinasjoner av doser av bibliotek og adenoviral helper (f.eks 10:01, 01:01 og 01:10). Et godt mål for potent Adenovirus infeksjon er forekomsten av cytopathic effekter tre dager etter virus inokulasjon, dokumentert av celle avrunding og løsne sett i fig. 6. Vice versa, en nyttig lese-out for AAV infeksjon og forsterkning er påvisning av kapsid proteiner ved Western blotting, bruke B1 antistoff som gjenkjenner et høyt konservert AAV kapsid epitop (Fig. 7) 7.
En viktig beslutning er så som råolje AAV trekker å plukke for påfølgende re-infeksjon av friske celler (trinn 5,2). Ideelt sett vil en ta dem der de AAV kapsid band er minst bemerkelsesverdige (Fig. 7), fordi disse antyder en stram genotype-fenotype linkage. Sistnevnte beskriver situasjonen som et genom koding en viss kapsid variant erfaktisk pakket inn i tilsvarende kapsid. For å oppnå og opprettholde en stram genotype-fenotype linkage er nøkkelen til vellykket valg av enkelte virale kandidater som det i sin tur sikrer at capsids med ønskede egenskaper levere cognate genetiske malen inn i cellene under påfølgende infeksjon runder. Derfor anbefaler vi å plukke de grove ekstrakter med moderat kapsid uttrykk for re-infeksjon og for å bruke minimale mengder. Sammen vil disse to tiltakene hindre overbelastning av nysmittede cellene med ulike kapsid / genom kombinasjoner som ellers kunne forurolige genotypen-fenotypen linkage når re-infiserte virus begynner å replikere og ompakking sine genomer til ikke-beslektet capsids.
I tillegg er det avgjørende å overvåke bibliotek mangfold under gjentatte infeksjoner runder av DNA-sekvensering. Ideelt sett vil man legge merke til endringer i sammensetningen av enkelte kloner som tyder på vellykket valg, dvs. akkumulerteulation distinkte serotype fragmenter og tap av andre, som eksemplifisert i fig. 8. I den perfekte tilfellet, vil bare noen få eller en enkelt klon slutt bli oppdaget som deretter kan analyseres som beskrevet ovenfor. Hvis, derimot, er ingen skift observert etter fire eller fem partier, bør man enten øke utvalget trykket (se omtale) eller vurdere at cellelinje som brukes kan være upassende fordi det kan være for utsatt til for mange serotyper.
For bibliotek forsterkning in vivo (trinn 5,3), de samme regler og hensyn gjelder, med to kritiske forskjeller: For det første gjør man ikke skjermen tilfeldig utvalgte kloner i dyr på grunn av de tilknyttede kostnader og etiske hensyn. Andre vil man ikke samtidig smitte med helper Adenovirus som det forårsaker bivirkninger eller dødsfall i dyr, pluss adenoviral tropisme ville begrense utvalget til celler som er mottakelige for hjelperen viruset. I stedet er det AAV biblioteket tilført i the dyr, reddet fra målcellene / vev med PCR (Fig. 9) og deretter re-klonet og re-pakket for en ny infeksjon runde. Som med utvalget i kultur, er denne prosessen gjentas til individuelle kandidater har dukket opp.
Uavhengig av valg prosedyre, er det siste trinnet validering av berikede kapsid varianter i egnede systemer. Fig. 10 og 11 viser representative eksempler fra vår egen tidligere valg av AAV chimeras som utfører svært godt i vevskultur eller i leveren hos mus. Som sett i fig. 10, utkonkurrerer en spesiell klone (AAV-DJ 3) virkelig en samling av åtte naturlige AAV wildtypes i et bredt spekter av cellelinjer. Til slutt, viser en annen klone valgt i dyrkede hepatoma linjer høyere tropisme for murine leveren og dermed mindre off-targeting når perifert tilført i voksne mus enn den potente AAV8 kontroll vektor testet i direkte comparison (Fig. 11). Merk at selv om å være mer spesifikk for leveren, klone AAV-DN faktisk transduces dette organet litt mindre effektiv enn AAV8. I denne forbindelse er AAV-DN et godt representativt eksempel for utfallet av AAV evolusjon og valg der endelige kandidatene typisk viser en rekke ønskede egenskaper, men er ikke nødvendigvis perfekt i alle aspekter.
Figur 1 Scheme:. Syntetisk AAV kapsid prosjektering via DNA familie stokke og påfølgende valg i celler eller i dyr. Protokoll trinn er markert i grått.
Figur 2. AAV cap genet giver og mottaker plasmider som brukes i vårt laboratorium for DNA familie stokke og bibliotek generasjon. Merk at disse er bare representative eksempler, og at de nøyaktige stedene og sekvenserkan tilpasses. Vår grunnleggende donor plasmid er avledet fra det kommersielt tilgjengelig pBlueScript II KS (+) vektor som vi laget for å inneholde vist primer bindende samt restriksjoner nettsteder, avbildet med piler eller trekanter, henholdsvis. Vi så klonet cap gener AAV serotype 1-9 (forsterket med primere capF / R) inn i denne plasmid, til å bli flankert av Pac jeg og ASC I restriksjonsenzymer nettsteder. Primere T3 og T7 brukes for hetten isolasjon i trinn 2,2, mens senere forsterkning av re-monterte chimeric sekvenser (trinn 3.2) kan utføres ved hjelp enten primer parene SAF / R eller CUF / R, eller begge i en nestet PCR. Replikering-kompetente mottaker plasmidet bærer AAV inverterte terminal repetisjoner (ITRs, replikering og emballasje signaler) flankerer AAV2 rep genet under kontroll av AAV P5 promotoren. Pac jeg og ASC I restriksjonsenzymer områder nedstrøms rep tillate "i ramme" kloning av bassenget av stokkes cap gener. Detvist Lseq primer bindingssteder er nyttige for cap genet sekvensering (trinn 3,6).
Figur 3. Eksempel DNase jeg sammendrag av cap gener (AAV2, 8 og 9). Synlig er en agarose gel elektroforese analyser av produkter som cap genet fordøyer bruke de angitte forskjellige inkubasjonstider (i minutter: sekunder). Lane U viser ufordøyd inngang lokket fragment pool som kontroll. Størrelser av DNA-markør band i kjørefelt M er i kilobases. I dette eksempelet, fordøyer ideell ble oppnådd med inkubasjonstider med 1:45 eller 2:00 min, som ga den foretrukne dominerende topp rundt 100 til 500 basepar (gul boks).
Figur 4. Eksempel for mikroskopi-basert analyse av tre menneskelige cellelinjer infisert med fem forskjellige rekombinant Yfp-uttrykke AAV vectors (navn på topp) laget med stokkes cap gener tilfeldig valgt fra en original bibliotek basert på AAV2, 8 og 9.
Figur 5. Eksempel FACS-basert analyse av fire celletyper infisert (ved serielle ti-fold fortynninger) med 18 ulike rekombinante Yfp-uttrykker AAV vektorer (navn på topp, inkludert de fra figur 4). Laget med stokkes cap gener tilfeldig utvalgte fra en opprinnelig bibliotek (AAV2, 8 og 9). Yfp uttrykket ble fargekodet for lettere visualisering. Avbildet er prosenter av transduced celler, der svart alltid indikerer 0% og hvitt flest målt i hver celle type. Clone B2 (rødt) eksemplifiserer en klone med dårlig samlet effekt, som kan forventes fra uselekterte capsids. Merk at FACS analyse er mer sensitiv og kan også brukes til oppheng celler (for eksempel SupT1) som er mindre mottakelig for mikroskopi. hu, Menneske; mu, murine.
Figur 6. Typisk utseende cytopathic effekter i celler (Jakten i dette tilfellet) etter produktiv co-infeksjon med AAV og adenovirus. Celler ble enten forlatt infisert (øverst til venstre panel) eller infisert med de indikerte beløp (partikler per celle) av adenovirus.
Figur 7. Påvisning av AAV kapsid protein uttrykk ved Western blotting som et mål for bibliotek infeksjon og forsterkning. Den venstre blot viser celler samtidig er infisert med ulike volumer (i mL) av en AAV bibliotek og helper Adenovirus. De første to kjørefelt er gode eksempler for conditions som gir knapt synlig AAV protein uttrykk, noe som indikerer tilstrekkelig men ikke overdreven AAV infeksjon og forsterkning og dermed ønsket stramme genotype-fenotype linkage. Dermed var 0,1, 1 eller 10 mL av disse supernatants brukt til re-infeksjon av friske celler (høyre blot). Celler i lane C ble smittet med AAV alene som en negativ kontroll (ingen påvisbare uttrykk på grunn av fravær av helpervirus).
Figur 8. Sammenligninger av proteinsekvenser (tallene er aminosyrer) av AAV kloner fra et bibliotek basert på AAV2, 8 og 9 før og etter valget. Sekvenser over den røde linjen viser foreldrenes AAVs. Purple piler indikerer homolog rekombinasjon hendelser. Den røde pilen markerer en cross-over mellom AAV2 og AAV9 bemerket i alle valgte kloner.
Figur 9. </ Strong> Redning av vellykket smittet AAV kloner fra mus vev via PCR. I dette eksempelet var AAV cap gener PCR-amplifisert fra mus lever ekstrahert en uke etter perifer bibliotek infusjon, bruke primer par SAF / R (Fig. 2). Lane 1 viser forventet 2,2 kilobase bandet, mens kjørefelt 2 er en non-mal kontroll. Etter Pac jeg og Asc jeg begrensning, ble forsterket fragmenter igjen klonet inn i den opprinnelige mottakeren plasmidet (Fig. 2) for senere produksjon og re-infusjon av en sekundær bibliotek. Størrelser av DNA-markør band i kjørefelt M er angitt i kilobases.
Figur 10. Eksempel for overlegen ytelse av en beriket AAV Chimera i dyrkede celler. Clone AAV-DJ har blitt rapportert av oss før tre, det meste representerer en hybrid mellom AAV serotype 2, 8 og 9, og er valgt fra en librar y som inneholder disse tre pluss fem ekstra serotypene i humane leverceller i nærvær av samlet menneskelig antisera. Å sammenligne effektiviteten til åtte naturlige AAV serotype (indikert med 1-6, 8 og 9 på toppen), ble alle cap gener brukes til å produsere renset selv komplementære GFP-uttrykke vektorer 8,19. Disse ble normalisert å inneholde 2x10 9 vektor genomer per ml, og deretter brukt til å transduce de vist cellelinjene på ti-fold seriefortynning. Tre dager senere ble GFP-uttrykker cellene telles og smittsomme titere ble bestemt ved å ta hensyn fortynningsfaktoren. I motsetning til koden i fig. 5, mørkere farger her indikerer høyere infectivities pr partikkel nummer. Som det fremgår, utkonkurrerer den valgte AAV-DJ Chimera alle naturlige AAV wildtypes, eksemplifiserer suksessen av anvendt utvalget ordningen. fibr, fibroblaster, HA, hamster, Hu, menneske; mu, murine; si, Simian.
Figur 11. Eksempel på analyse av en valgt AAV Chimera i mus leveren. Clone AAV-DN ble valgt på murine hepatoma cellene og deretter brukt til å produsere luciferase-uttrykke rekombinante vektorer 8. Vist er representative mus (tre per gruppe) en uke etter perifer infusjon av like doser av denne vektoren eller en kontroll basert på AAV8 hvete, en av de mest potente kjente naturlige isolater i mus lever 9. Merk at mens AAV-DN klone gir litt mindre samlet uttrykk i leveren (panel (I)), er det mer spesifikt for dette organet siden det viser vesentlig mindre off-målretting i ikke-hepatiske vev Når leveren uttrykk nivåer har vært justeres via bildebehandling (panel (II)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi skissert viktige eksperimentelle skritt og retningslinjer for AAV kapsid prosjektering via DNA familie stokke og for evolusjon i celler eller i dyr. I hovedsak er disse protokollene er standardiserte versjoner av prosedyrene vi først rapportert innen AAV feltet i 2008 3. Mens en kave av oppfølgingsstudier av andre har rapportert om en rekke modifikasjoner for eksempel 10-13, våre nåværende versjoner representerer grunnleggende strategier og ga reproduserbare resultater samtidig som mottagelig for oppskalering og tilpasning til eventuelle behov.
Til tross for vår innsats for å standardisere hele prosedyren, noen skritt fortsatt krever prøving og feiling-baserte tilnærminger. Dette gjelder særlig hetten genet fragmentering på grunn av det faktum at DNase jeg er svært følsom for reaksjons forhold, for eksempel inkubasjonstiden (se eksempler i fig. 3). Vi får de beste resultatene med start fragmenter i en rekke100 til 500 basepar og dermed anbefale å prøve ulike DNase tilstander (f.eks mengder enzym og inkubering ganger) helt til gel bildet ligner eske kjørefelt i fig. 3.
Det er likeledes umulig å fullt standardisere de enkelte trinnene under bibliotek utvalg i cellekultur. Som nevnt, er en kritisk aspekt usikkerheten om smittsomhet av et nytt bibliotek eller Adenovirus i en gitt celle type, som krever indirekte målinger som beskrevet Western blotting. Fortuitously, basert på vår erfaring, finne "gode" AAV / Adenovirus inokulasjon volumer vanligvis bare tar noen få parallelle innsats.
Lignende vurderinger gjelder for AAV bibliotek utvalg i dyr som også ideelt sett innebærer samtidig testing av flere parametre (f.eks doser av viral biblioteket, tidspunkt for innhøsting etter inokulasjon, injeksjonsvei) på grunn av mangel på eksperimentelle muligheter til direkte predict bibliotek smittsomhet in vivo. Generelt er det viktig å merke seg at in vivo utvalget er vanligvis langt mer fysiologisk relevant, av flere grunner, inkludert den kjente avviket mellom AAV infectivities in vitro og in vivo tre. Videre in vivo evolusjon tillater å sette mot biblioteket på samme måte som til slutt vil bli brukt i en klinisk setting. Dette gir muligheten til ikke bare berike for capsids som er potente infisere en ønsket celletype, men viktigst gjøre det fra en akseptabel levering rute.
Uavhengig av valg system, vi generelt anser det best å kombinere positive og negative presset som det vil øke sjansene for berikende individuelle kandidater. En årsak til sistnevnte er sannsynligheten for at capsids utelukkende valgt under overtrykk (f.eks vekst på en bestemt celletype) kan også fremdeles potente infisere andre celler deling (a) mobil reseptor (s). En annen grunn er at målet celletype kan allerede være mottakelig for flere innspill virus fra biblioteket, reduserer sjansene for å berike enda mer effektive capsids i fravær av ytterligere negativt press.
Et eksempel på sistnevnte som vi har med hell brukt før er bibliotek forsterkning i nærvær av sammenslåtte menneskelig antisera inneholder antistoffer mot AAV serotype som er utbredt i den menneskelige befolkning. I motsetning til mindre strenge utvelgelsesprosedyrer anvendt parallelt, tillates kun denne kombinasjonen av positive og negative trykket oss til å trekke ut en enkelt klon (AAV-DJ, fig. 10) ut av et bibliotek på rundt 7x10 5 varianter 3.
I alle fall ønsker vi å omarbeide viktigheten av å teste flere bly capsids fremvoksende fra et utvalg ordningen, og ikke bare den øverste kandidat. Faktisk er det vel mulig at den andre eller tredje mest dominerende kloner er like eller enda mmalm nyttig enn bly kandidat, og / eller kan vise ytterligere ønskelige fenotyper for den gitte søknaden. Vi anbefaler derfor å alltid velge minst to flere capsids fra den endelige listen over kandidater etter ferdigstillelse av et utvalg protokoll og å studere dem som beskrevet i trinn 5.4.
Sist men ikke minst, ønsker vi å gjenta at DNA familien shuffling er ikke den eneste AAV Engineering metode. Alternative tilnærminger omfatter innføring av tilfeldige punktmutasjoner inn i en bestemt AAV cap gen via feilutsatt PCR 14,15 samt visning av peptid bibliotekene i utsatte områder av en bestemt AAV kapsid 4,5. Mens en omfattende diskusjon eller sammenligning av disse tilnærmingene kan finnes andre steder 16-18, kan vi lett konkludere med at i lys av denne mengde alternativer, er fremtiden for feltet av AAV engineering og evolusjon sikkert veldig lyst og har trolig bare så vidt begynt .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at de ikke har noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke for utmerket støtte av laboratoriet deres, gruppemedlemmer og arbeidet ved Cluster of Excellence CellNetworks ved Heidelberg Universitet, samt av Chica og Heinz Schaller (CHS) stiftelse. Vi forstår at molekylær AAV evolusjon via DNA familie shuffling har blitt en svært aktiv feltet siden vår første publikasjon tre år siden, og derfor beklager til alle forfattere av relevante publikasjoner som arbeidet kunne ikke bli sitert her på grunn av plassbegrensninger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S (part of kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| Ampicilin sodium salt | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Heating block | BIOER | MB-102 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS analyser | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | Custom primer | |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
