Summary
हम बुनियादी molecularly इंजीनियर और डीएनए परिवार फेरबदल के माध्यम से कृत्रिम एडिनो से जुड़े वायरल (AAV) जीन थेरेपी वैक्टर विकसित तकनीक का प्रदर्शन. इसके अलावा, हम सामान्य दिशा निर्देशों और संस्कृति में लक्ष्य या चूहों में कोशिकाओं पर बढ़ाया गुणों के साथ व्यक्तिगत chimeric capsids का चयन और विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान करते हैं.
Protocol
1. प्लास्मिड AAV capsid जीन एन्कोडिंग सेट की तैयारी
- बाद डीएनए फेरबदल के लिए विभिन्न AAV capsid (टोपी) जीन की पर्याप्त मात्रा की नियमित तैयारी की सुविधा, शुरू में एक आम प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी में इन जीनों subclone के. यह महत्वपूर्ण है के नेस्टेड पीसीआर के लिए प्राइमर और क्लोनिंग के लिए बाध्यकारी साइटों (छवि 2) के रूप में बाद में उपयोग के लिए> 20 nucleotides के समान flanking दृश्यों में शामिल है.
- उपयुक्त प्राइमरों AAV5 के लिए अनुकरणीय प्राइमरों के लिए (टेबल देखें) का प्रयोग, पीसीआर आमतौर पर उपलब्ध AAV प्लास्मिड कि आम तौर पर AAV2 प्रतिनिधि पसंद टोपी जीन को अगले जीन होते टोपी से वांछित जीन बढ़ाना. क्योंकि पीसीआर उत्पाद मानक क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, उत्पाद शुद्ध ~ 1 μg पहले से ही पर्याप्त है, और इसलिए किसी भी पारंपरिक पीसीआर प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया जा सकता है.
- शुद्ध पीसीआर उत्पाद (उदाहरण के लिए, agarose जेल शुद्धि या एक मानक पीसीआर शुद्धीकरण किट का उपयोग करें) और डाइजेस्टप्राप्तकर्ता प्रतिबंध एंजाइमों जिसका साइटों मान्यता टोपी प्रवर्धन (1.1) के लिए प्लाज्मिड प्राप्तकर्ता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया प्राइमरों में मौजूद हैं के साथ प्लाज्मिड. हमारी प्रयोगशाला में, हम पीएसी मैं और ए एस सी मैं साइटों (छवि 2) का उपयोग के रूप में वे सबसे AAVs में अनुपस्थित रहे हैं.
2. लिए DNase आधारित कैप जीन विखंडन
- पीसीआर प्लास्मिड 1.1-1.3 चरणों में उत्पन्न से पसंद की टोपी जीन बढ़ाना. एक प्रतिक्रिया के रूप में नीचे वर्णित है ~ पीसीआर उत्पाद के 3 μg निकलेगा. टोपी जीन पुस्तकालय में शामिल होने की संख्या पर निर्भर करता है, यह suffices छह फेरबदल प्रतिक्रियाओं के लिए.
- पीसीआर के लिए, एक 50 μl 200 एनजी प्लाज्मिड टोपी, 2 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता में प्रत्येक प्राइमर, 10 μl 5x Hifi बफर और 1 μl Hifi पोलीमरेज़ युक्त प्रतिक्रिया सेट. 95 ° C और फिर 15 के 40 चक्र को चलाने के 94 सेकंड डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड 57 डिग्री सेल्सियस और 3 मिनट 68 डिग्री सेल्सियस पर, एक अंतिम 10 मिनट कदम के बाद 5 मिनट के साथ शुरू72 डिग्री सेल्सियस जेल या किट के माध्यम से पीसीआर उत्पादों शुद्ध और फिर एक नियंत्रित DNase पचाने chimeras में फिर से विधानसभा के लिए टोपी जीन टुकड़े बना.
- इसलिए, समान रूप से 54 μl एच 2 ओ में 4 μg की कुल राशि के लिए विभिन्न टोपी पीसीआर उत्पादों के मिश्रण प्रतिक्रिया के लिए 6 μl DNase प्रतिक्रिया बफर और 0.5 μl DNase मैं जोड़ने के लिए, ध्यान से तीन बार झटका, संक्षेप में स्पिन और तुरंत एक 25 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक पर डाल दिया. 1 और 2 के बीच मिनट (एकाधिक समानांतर प्रतिक्रियाओं की स्थापना की और उन्हें 15 सेकंड की वेतन वृद्धि में समाप्त) सेते हैं, तो 6 μl 25 मिमी EDTA जोड़कर और संक्षिप्त vortexing और incubating के 10 मिनट में 75 डिग्री सेल्सियस के द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो
- एक मानक 1% agarose जेल पर टोपी टुकड़े शुद्ध. आदर्श रूप में, 100 और 500 के आधार जोड़े के बीच एक धब्बा दिखाई जानी चाहिए. चूंकि DNase मैं एक अत्यधिक शक्तिशाली एंजाइम, उचित हैंडलिंग और समय है इस कदम पर महत्वपूर्ण हैं, और 2.3 चरण में ऊष्मायन समय में कई रूपों इष्टतम Res के लिए की जरूरत हो सकती हैults छवि (3). Eluted डीएनए एक मानक किट का उपयोग कर शुद्ध और अपनी एकाग्रता का निर्धारण.
3. डीएनए परिवार फेरबदल
- सबसे पहले, एक पीसीआर के माध्यम से पूर्ण लंबाई दृश्यों में वे स्वयं प्रधानमंत्री आंशिक homologies पर आधारित में फिर से टोपी टुकड़े इकट्ठा. इसलिए, एक 50 500 एनजी शुद्ध (2.4 कदम) टुकड़े, 10 μl 10x Phusion बफर, 1 μl 10 मिमी dNTPs, 1.5 μl DMSO के और 0.5 μl Phusion द्वितीय पोलीमरेज़ साथ μl प्रतिक्रिया सेट. अंडों पर बैठना 30 सेकंड 98 डिग्री सेल्सियस और फिर 10 के 40 चक्र को चलाने के 98 सेकंड डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड 42 डिग्री सेल्सियस और 45 सेकंड 72 डिग्री सेल्सियस, 72 पर एक अंतिम 10 मिनट कदम के बाद ° सी.
- आगामी 2 पीसीआर में, बाद में क्लोनिंग के लिए फिर से इकट्ठा टोपी जीन बढ़ाना, प्राइमरों कि संरक्षित flanking दृश्यों (छवि 2) के लिए बाध्य. इसलिए, एक 50 μl 1 (3.1 कदम) पीसीआर, 2 माइक्रोन, 0.5 μl MgCl2 के अंतिम एकाग्रता में प्रत्येक किताब के 2 μl युक्त प्रतिक्रिया सेट,10 μl 5x Hifi बफर और 1 μl Hifi पोलीमरेज़. हम 16-24 PCRs चलने के बाद क्लोनिंग के लिए पर्याप्त उच्च पैदावार सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं. PCRs पूल और पूर्ण लंबाई टोपी बैंड (जेल या किट) शुद्ध.
- पीएसी मैं और क्लोनिंग के लिए ए एस सी मैं साथ में शुद्ध टोपी जीन पूल डाइजेस्ट एक प्रतिकृति - सक्षम AAV AAV (औंधा टर्मिनल को दोहराता है, प्रतिकृति और पैकेजिंग संकेत) ITRS ले प्लाज्मिड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से AAV2 प्रतिनिधि जीन. बाद ही साइटों के द्वारा पीछा किया जाना चाहिए (विवरण के लिए चित्र 2) "फ्रेम में" टोपी जीन पूल को समायोजित. पीसीआर उत्पाद की पूरी पाचन प्राप्त करने के लिए, अतिरिक्त एंजाइम के साथ रात भर सेते हैं.
- एक 3:1 दाढ़ अनुपात में टोपी टुकड़े और उचित कटौती AAV रीढ़ की हड्डी / आईटीआर प्रतिनिधि कटी घमनी को बांधना. 50 / एनजी μl और रातोंरात सेते हैं 16 में डिग्री सेल्सियस के अंतिम डीएनए एकाग्रता के साथ एक 40 μl कुल मात्रा mastermix के (20 परिवर्तनों के लिए पर्याप्त) बनाओ
- 30 μl विद्युत सक्षम ई. के साथ मिश्रण द्वारा बंधाव प्रतिक्रिया (बर्फ पर) 2 μl रूपांतरण कोली (वाणिज्यिक कोशिकाओं से विकसित और सक्षम किसी भी मानक प्रोटोकॉल का उपयोग). पूर्व ठंडा बर्फ पर electroporation cuvettes (1 मिमी अंतर) में जोड़ें. 1.8 केवी, Ω 200 और 25 μF पर Electroporate. निरंतर समय 5 MS के करीब होना चाहिए. तुरंत 1 मिलीग्राम पूर्व गर्म समाज मध्यम और एक 250 मिलीलीटर कुप्पी हस्तांतरण जोड़ें. 20 ऐसे electroporations के 1x10 के बारे में 6 अलग क्लोनों में से एक विविधता के साथ एक पुस्तकालय निकलेगा.
- जमा परिवर्तनों मात्रा 1 पूर्व गर्म समाज मध्यम जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 1 घंटे के लिए 180 rpm पर हिला. फिर लेग मध्यम प्लस एम्पीसिलीन (50 μg / एमएल की अंतिम एकाग्रता) के साथ कुल मात्रा 800 मिलीलीटर के लिए लाने के लिए और एक ही परिस्थितियों में एक और 16 घंटे के लिए सेते हैं. पुस्तकालय प्लास्मिड डीएनए जैसे का उपयोग कर शुद्ध. क्विएज़न मेगा प्रस्तुत करने का किट.
वैकल्पिक: 3.6 कदम पर सटीक पुस्तकालय विविधता, थाली एक aliqu की गणनालेग एम्पीसिलीन (उदाहरण के लिए, एक 10 सेमी की प्लेट पर 10 μl) प्लेटें और गिनती कालोनियों अगले दिन पर 800 मिलीलीटर समाधान (पहले 16 घंटे ऊष्मायन) के ओ.टी.. इसके अलावा, उच्च क्षमता फेरबदल, अनुक्रम जैसे 24 क्लोनों को मान्य करने के लिए और उन्हें पैतृक टोपी जीन के लिए पंक्ति में (भी देखने के चित्र 8.). अंत में, पुस्तकालय जीवन शक्ति और उच्च कार्यात्मक विविधता की पुष्टि, subclone बेतरतीब ढंग से एक AAV सहायक में टोपी जीन उठाया प्लाज्मिड और उन का उपयोग करने के लिए उत्पादन और छोटे पैमाने (4-5 Figs.) में पुनः संयोजक वैक्टर विश्लेषण (यह भी देखने के लिए 5.4 से नीचे कदम).
4. वायरल पुस्तकालय का उत्पादन
- बीज 10 15 2 HEK293T कोशिकाओं के बर्तन (4.5x10 6 कोशिकाओं डिश /) और 48 घंटे बाद 220 μg AAV पुस्तकालय के साथ transfect और 220 μg adenoviral प्लाज्मिड सेमी (AAV प्रचार के लिए आवश्यक). इसलिए, पूर्व गर्म पी (polyethylenimine) के और 37 में 300 मिमी NaCl डिग्री सेल्सियस तब 7.9 मिलीलीटर NaCl और डीएनए मिश्रण है, और कुल volu के लिए एच 2 हेमुझे 15.8 मिलीलीटर की. एक अलग ट्यूब में 3.52 मिलीग्राम पी, 7.9 मिलीग्राम NaCl और 4.38 मिलीग्राम एच 2 हे (दस transfections के लिए सभी संस्करणों) मिश्रण. घोला जा सकता है (भंवर) का मिश्रण है और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए समाधान के बर्तन (3 पकवान प्रति मिलीलीटर) भर में समान रूप से वितरण से पहले, सेते हैं.
- 48 घंटे के बाद, मध्यम में कोशिकाओं परिमार्जन और उन्हें 15 मिनट के लिए 1200 rpm पर नीचे स्पिन. 6 मिलीग्राम lysis बफर (50 मिमी Tris - एचसीएल 8.5 पीएच, 50 मिमी 3 NaHCO) और 5 फ्रीज पिघलना चक्र (-80/37 डिग्री सेल्सियस) के लिए विषय में सेल गोली Resuspend. नीचे 20 मिनट के लिए 3750 rpm पर कताई सेल मलबे से पहले 1 घंटे के लिए 50 मिलीग्राम प्रति यू 37 ° benzonase सी, के साथ सेते हैं.
- 15%, 25% और 40% 60% (पीबीएस-एम.के. में OptiPrep) iodixanol पीबीएस एम.के. (1x पीबीएस, 1 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी KCl) में स्टॉक से dilutions (2.5 μl / मिलीलीटर phenolred है के साथ) तैयार करें.
- पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के Beckman अपकेंद्रित्र त्वरित सील ट्यूब (14x89 मिमी) में 5 मिलीलीटर वायरस के निलंबन जोड़ने AAV शुद्धि के लिए एक ढाल स्थापित करने के लिए, 1.5 मिलीग्राम पूर्वी वायु कमान द्वारा पीछा15%, 25% और 40% iodixanol समाधान के घंटे. Lysis बफर के साथ ढाल बंद शीर्ष.
- 4 में 2 घंटे के लिए 50.000 कश्मीर पर ultracentrifuge ° सी के Beckman Ti70.1 रोटर में. तो 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब के बाहर साफ, वेंटिलेशन के लिए ट्यूब के शीर्ष में एक सुई छड़ी एक सुई का उपयोग 40% iodixanol के अंश के 1.2 मिलीलीटर आकर्षित. ख्याल रखना 25% अंश से ड्राइंग से बचने के रूप में इसे खाली AAV capsids हैं.
5. स्क्रीनिंग और चयन
- इस बिंदु पर, एक या तो iteratively संवर्धित कोशिकाओं में या पशुओं में पूरे पुस्तकालय बढ़ाना कर सकते हैं जब तक वांछित गुणों का प्रदर्शन chimeric capsids (6-11 Figs.) में उभरा है.
- संवर्धित कोशिकाओं में चयन करने के लिए, लायब्रेरी के विभिन्न aliquots (उदाहरण के लिए, 1, 10 और 100 μl) और Adenovirus-5 सह संक्रमित AAV विकास का समर्थन है. पुस्तकालय और adenoviral सहायक के कई रूपों का परीक्षण आवश्यक है एक दिया सेल प्रकार में पुस्तकालय संक्रामकता के रूप में भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है. फसल~ 3 दिनों के बाद कोशिकाओं, फ्रीज विगलन के माध्यम से परिलक्षित AAV निकालने के लिए, 56 में 30 मिनट डिग्री सेल्सियस और फिर से संक्रमित कोशिकाओं के लिए Adenovirus निष्क्रिय. 5 बार दोहराएँ जब तक अलग capsids समृद्ध अनुक्रमण द्वारा मान्य हो.
- जानवरों में चयन के लिए पुस्तकालय के साथ संक्रमित हैं और वांछित ~ 1 सप्ताह के बाद ऊतक या सेल प्रकार निकालने. Adenovirus साथ नहीं सह संक्रमित के रूप में इस पशुओं में प्रतिकूल विषाक्तता का कारण होगा. बचाव पीसीआर के माध्यम से वायरल डीएनए पहले की तरह ही प्राइमरों (छवि 2) का उपयोग करने के लिए, टोपी पूल फिर क्लोन करने के लिए, अलग capsids समृद्ध अनुक्रमण द्वारा मान्य हो जाते हैं जब तक एक ताजा पुस्तकालय और दोहराने का उत्पादन.
- vivo में चयन के लिए सही स्थिति (मात्रा, अनुमापांक, मार्ग) हित के लक्ष्य ऊतक पर निर्भर करेगा. जिगर के लिए, चूहों आमतौर पर पूंछ नस इंजेक्शन (चतुर्थ) के माध्यम से 200 μl पीबीएस की कुल मात्रा में 1x10 11 से 1x10 12 वायरल कणों से संक्रमित होते हैं. आमतौर पर सीमित कारक origina की वायरल अनुमापांकएल की तैयारी, है क्योंकि 200 μl में 12 1x10 AAV की इंजेक्शन 5x10 कम से कम 12 मिलीग्राम / अनुमापांक की आवश्यकता है, जो नियमित रूप से सभी प्रयोगशालाओं नहीं प्राप्त कर सकते हैं. इसलिए, जबकि एक अधिकतम अनुमापांक पहली संक्रमण के लिए फायदेमंद है क्योंकि पुस्तकालय अभी तक नहीं दिया ऊतक में कुशल capsids के लिए समृद्ध किया गया है और इस तरह एक अपेक्षाकृत कम समग्र संक्रामकता हो सकता है, हम प्रति 1x10 कम से कम 11 कणों का उपयोग करने की सिफारिश करेंगे जिगर के चयन के लिए माउस.
- यदि कई चूहों उपलब्ध हैं, यह बहुत उपयोगी है अलग कण संवर्धित कोशिकाओं में चयन करने के लिए समान संख्या इंजेक्षन करने के लिए, और समूह प्रति कई चूहों (और फिर प्रत्येक समूह के भीतर एकत्र यकृत पूल) का उपयोग करने के लिए आदेश में परिवर्तनशीलता को कम करने और सफलता में वृद्धि दर, 11 1x10 पर जैसे 3 चूहों और 1x10 12 कणों में 3 चूहों.
- चूंकि AAV एक गैर रोगजनक और प्रतिकृति - अक्षम (helpervirus बिना) वायरस है, वहाँ कोई प्रतिकूल प्रतिक्रिया कर रहे हैं के लिए अदन की अनुपस्थिति में देखने के लिएovirus.
- Euthanization के लिए, पशुओं एक isoflurane vaporizer और बाद में गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था के माध्यम से euthanized का उपयोग anesthesized गया.
- ऊतकों (इस मामले में जिगर) के बाद जानवरों euthanized पुष्टि की गई काटा गया. सामान्य में, वहाँ कोई भी अन्य ऊतकों के लिए की जरूरत है जानवरों को छिड़कना या AAV संक्रमित अंगों को मौत से पहले फसल, AAV डीएनए के बाद से स्थिर है और आसानी से जमे हुए कोशिकाओं / ऊतकों से बचाया जा सकता है है.
- एकल capsids (पुस्तकालय (3.6 कदम) या चयन के बाद से (5.2-5.3 कदम)) का अध्ययन करने के लिए, AAV वैक्टर उपज 4.1-4.5 के बाद कदम के द्वारा एक पत्रकार जीन (उदाहरण के लिए, GFP 6) कूटबन्धन. इसलिए, एक मानक AAV प्लाज्मिड सहायक 2 में ब्याज की टोपी जीन क्लोन. 4.1 कदम पर, ट्रिपल 14.7 μg AAV वेक्टर (संवाददाता एनकोडिंग), AAV सहायक और adenoviral सहायक के प्रत्येक के साथ कोशिकाओं transfect. संवर्धित कोशिकाओं या अलग अलग मात्रा और determi में शुद्ध वायरस के साथ पशुओं को संक्रमितFACS या माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पूर्वोत्तर पारगमन दक्षता जैसे.
6. प्रतिनिधि परिणाम
प्रोटोकॉल का उपयोग करें यहाँ उल्लिखित 1x10 के बारे में 6 अद्वितीय capsids है जो फिर एक सबसे प्रदर्शित कणों या एक दिया सेल लाइन पर या पशुओं में सभी वांछित गुणों के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है की विविधता के साथ वायरल पुस्तकालयों में आमतौर पर परिणाम है. बाद में, हम ऐसे या इन विट्रो में vivo स्क्रीनिंग में से परिणाम के लिए प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान करेगा.
उसके पहले, तथापि, हम यह महत्वपूर्ण फिर से बाहर करने के लिए मूल प्लाज्मिड पुस्तकालय से अपनी कार्यक्षमता और विविधता (3.6 कदम पर वैकल्पिक) के लिए अलग - अलग क्लोन विश्लेषण की उपयोगिता बिंदु पर विचार करें. यह इसलिए है क्योंकि बाद के दो मापदंडों वास्तविक वायरल पुस्तकालय कि प्लाज्मिड पुस्तकालय से बनाया गया है के चयन की सफलता के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण आवश्यक शर्तें हैं. इसलिए, एक बेतरतीब ढंग से फेरबदल एकल चुन सकते हैंटोपी जीन और उन का उपयोग करने के लिए पुनः संयोजक AAV (कच्चे अर्क या शुद्ध कणों, सटीकता के वांछित डिग्री पर निर्भर करता है) एक आसानी से detectable और quantifiable संवाददाता जीन व्यक्त वैक्टर का उत्पादन. अलग capsid वेरिएंट की तुलना में एक ठेठ परख तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जैसा कि चित्र में प्रतिनिधि उदाहरण में दिखाया गया है. 4.
एक वैकल्पिक तरीका है, FACS आधारित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति है जो अतिरिक्त लाभ है कि यह भी सेल प्रति जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है धारण की माप से अधिक कि यह निलंबन कोशिकाओं के लिए काम करता है चित्र. 5 विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में कच्चे AAV वेक्टर lysates के ऐसे एक FACS आधारित विश्लेषण से एक विशिष्ट परिणाम से पता चलता है.
क्योंकि व्यक्ति टोपी chimeras के ऊपर वर्णित चयन यादृच्छिक और प्रतिबंधित है, यह पाठ्यक्रम के वांछित उम्मीदवारों के संवर्धन के लिए एक वास्तविक दृष्टिकोण के रूप में उपयोगी नहीं है. छह की बजाय चयन,पशुओं में लक्ष्य कोशिकाओं या ऊतकों में ral पुस्तकालय अधिक उपयुक्त है. शर्तों और पैरामीटर्स के रूप में प्रत्येक आवेदन के साथ अलग अलग होंगे, हम केवल कुछ प्रतिनिधि दिशा निर्देशों और परिणामों पर प्रकाश डाला जाएगा.
पुस्तकालय प्रवर्धन सभ्य सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं (5.2 चरण) पर चलने का चयन आसान है. के बाद से अपने प्रचार के लिए AAV Adenovirus सह संक्रमण की आवश्यकता है, लक्ष्य कोशिकाओं Adenovirus के लिए अतिसंवेदनशील होना चाहिए. एक तो बढ़ने और 6 अच्छी तरह प्लेटें जो प्रति पर्याप्त सेल संख्या पुस्तकालय का पूरा कवरेज सुनिश्चित पकड़ में उन्हें जैसे संक्रमित कर सकते हैं. एक दूसरा महत्वपूर्ण धारणा है कि AAV के संतुलन और Adenovirus नाजुक है, बहुत ज्यादा AAV Adenovirus रोकना है, जबकि बाद के एक अतिरिक्त कोशिकाओं (AAV विपरीत, Adenovirus lytic संक्रमण का कारण बनता है) को मारने के है पहले AAVs दोहराने सकता जाएगा.
Adenovirus अनुपात पर हालांकि, के बाद से एक निश्चित सेल प्रकार पर पुस्तकालय संक्रामकता अज्ञात है, "अच्छा" AAV खोजदोनों प्रचार कर सकते हैं समानांतर पुस्तकालय की खुराक और adenoviral सहायक (जैसे, 10:01, 01:01 और 01:10) के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण की आवश्यकता है. शक्तिशाली Adenovirus संक्रमण के लिए एक अच्छा उपाय वायरस टीका के बाद तीन दिन कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव, सेल इकट्ठा और detaching के रूप में छवि में देखा द्वारा evidenced की घटना है. 6. ठीक इसके विपरीत, AAV संक्रमण के लिए पढ़ने के लिए बाहर उपयोगी प्रवर्धन और सोख्ता पश्चिमी द्वारा capsid प्रोटीन की पहचान है, बी 1 एंटीबॉडी कि एक अत्यधिक संरक्षित AAV capsid छवि (7) मिलान 7 पहचानता का उपयोग.
एक महत्वपूर्ण फैसला तो है जो कच्चे AAV बाद फिर से ताजा कोशिकाओं के संक्रमण (5.2 कदम) के लिए लेने के लिए निकालता है. आदर्श रूप में, उन में से एक है जहां AAV capsid बैंड कम से कम उल्लेखनीय छवि (7) ले, क्योंकि इन तंग उठाना जीनोटाइप-phenotype के सुझाव देगा. बाद स्थिति में एक निश्चित capsid संस्करण एन्कोडिंग जीनोम का वर्णनवास्तव में को इसी कैप्सिड में पैक. को प्राप्त करने और एक तंग जीनोटाइप-phenotype उठाना बनाए रखने के सफल व्यक्ति वायरल उम्मीदवारों के चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह बारी में यह सुनिश्चित करता है कि वांछित गुणों के साथ capsids कोशिकाओं में लगातार संक्रमण के दौर के दौरान आत्मीय आनुवंशिक टेम्पलेट वितरित. इसलिए, हम फिर से संक्रमण के लिए मध्यम capsid की अभिव्यक्ति के साथ कच्चे अर्क लेने और न्यूनतम मात्रा का उपयोग करने की सलाह देते हैं. एक साथ, इन दो उपायों अलग / capsid जीनोम संयोजन है जो अन्यथा से उठाना जीनोटाइप-phenotype के उपद्रव एक बार फिर से संक्रमित वायरस नकल और फिर से पैकेजिंग गैर आत्मीय capsids में उनके जीनोम शुरू कर सकता है के साथ हाल में संक्रमित कोशिकाओं की ओवरलोडिंग को रोकने जाएगा.
इसके अलावा, यह डीएनए अनुक्रमण द्वारा दोहराया संक्रमण के दौर के दौरान पुस्तकालय विविधता पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. आदर्श रूप में, एक व्यक्ति क्लोन की संरचना में बदलाव सफल चयन का संकेत, यानी, accum नोटिस जाएगाअलग सीरोटाइप टुकड़े और दूसरों के नुकसान के रूप में छवि में उदाहरण की आबादी. 8. सही मामले में, केवल कुछ या यहाँ तक कि एक एकल क्लोन के अंत में पता चला है जो तो ऊपर वर्णित के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है किया जाएगा. अगर, हालांकि, चार या पाँच मार्ग के बाद कोई बदलाव नहीं मनाया जाता है, या तो एक चयन दबाव (चर्चा देखें) में वृद्धि करना चाहिए या कि सेल लाइन इस्तेमाल किया अनुचित हो सकता है क्योंकि यह भी बहुत सारे सीरमप्रकारों के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है पर विचार करें.
Vivo में पुस्तकालय प्रवर्धन (5.3 कदम) के लिए, एक ही नियम और विचार दो महत्वपूर्ण अंतर के साथ लागू होते हैं: सबसे पहले, एक स्क्रीन संबद्ध लागत और नैतिक विचारों के कारण पशुओं में बेतरतीब ढंग से चुनी क्लोन नहीं करता है. दूसरे, एक सहायक Adenovirus साथ नहीं सह संक्रमित के रूप में पशुओं में toxicities या मौत का कारण बनता है, प्लस adenoviral tropism चयन को सहायक वायरस के लिए अतिसंवेदनशील कोशिकाओं के लिए सीमित होगा. इसके बजाय, AAV पुस्तकालय वीं में संचार होता हैई जानवर, पीसीआर छवि (9) द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं / ऊतक से बचाया और फिर पुन: क्लोन और फिर से एक नए संक्रमण के दौर के लिए पैक. संस्कृति में चयन के साथ के रूप में, इस प्रक्रिया को दोहराया है जब तक व्यक्तिगत उम्मीदवारों उभरा है.
चयन प्रक्रिया के बावजूद, अंतिम चरण के उपयुक्त प्रणाली में समृद्ध capsid वेरिएंट की मान्यता है अंजीर. 10 और 11 शो प्रतिनिधि उदाहरण AAV chimeras कि टिशू कल्चर में या चूहों के यकृत में असाधारण अच्छा प्रदर्शन हमारे अपने पिछले चयन से. के रूप में छवि में देखा. 10, एक विशेष क्लोन (3 AAV - डीजे) वास्तव में सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला में आठ प्राकृतिक AAV wildtypes के एक संग्रह से बेहतर साबित. अंत में, एक सुसंस्कृत hepatoma लाइनों में चयनित क्लोन के murine जिगर के लिए एक उच्च tropism दर्शाती है और तदनुसार कम बंद लक्ष्यीकरण जब सतही तौर पर शक्तिशाली AAV8 नियंत्रण प्रत्यक्ष कॉम में परीक्षण वेक्टर से वयस्क चूहे में संचारparison छवि (11). ध्यान दें कि जिगर के लिए और अधिक विशिष्ट किया जा रहा यद्यपि, AAV डी.एन. क्लोन वास्तव में इस AAV8 से थोड़ा कम कुशल अंग transduces है है. इस संबंध में, AAV डी.एन. AAV विकास और चयन जहां अंतिम उम्मीदवारों को आम तौर पर वांछित गुणों का एक संख्या एक्ज़िबिट लेकिन जरूरी सभी पहलुओं में सही नहीं हैं के परिणाम के लिए एक अच्छा प्रतिनिधि उदाहरण है.
चित्रा 1 योजना: सिंथेटिक डीएनए परिवार फेरबदल और बाद में चयन के माध्यम से कोशिकाओं में या पशुओं में AAV capsid इंजीनियरिंग. प्रोटोकॉल कदम ग्रे में डाला जाता है.
चित्रा 2. AAV टोपी जीन दाता और प्राप्तकर्ता प्लास्मिड डीएनए परिवार फेरबदल और पुस्तकालय पीढ़ी के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया. ध्यान रखें कि ये केवल प्रतिनिधि उदाहरण हैं, और सटीक साइटों और दृश्यों किअनुकूलित किया जा सकता है. हमारे बुनियादी दाता प्लाज्मिड व्यावसायिक रूप से उपलब्ध pBlueScript द्वितीय के एस (+) वेक्टर जो हम करने के लिए दिखाया प्राइमर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाध्यकारी प्रतिबंध साइटों, तीर या त्रिकोण से चित्रित, क्रमशः शामिल इंजीनियर से ली गई है. हम तो इस प्लाज्मिड में AAV सीरमप्रकारों 1-9 (प्राइमरों / capF आर के साथ प्रवर्धित) की टोपी जीन क्लोन, पीएसी मैं और ए एस सी मैं प्रतिबंध साइटों द्वारा flanked हो. प्राइमरों T3 और T7 2.2 चरण में टोपी अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है, जबकि फिर से इकट्ठा chimeric दृश्यों (3.2 कदम) के बाद प्रवर्धन या तो प्राइमर जोड़े का उपयोग कर पूरा किया जा सकता सैफ / आर या / CUF आर, या एक नेस्टेड पीसीआर में दोनों. प्रतिकृति - सक्षम प्लाज्मिड प्राप्तकर्ता AAV औंधा टर्मिनल (ITRS, प्रतिकृति और पैकेजिंग संकेत) दोहराता AAV2 प्रतिनिधि जीन AAV p5 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत flanking किया जाता पीएसी मैं और ए एस सी मैं प्रतिबंध साइटों प्रतिनिधि के बहाव के लिए क्लोनिंग "फ्रेम में" की अनुमति टोपी जीन के पूल के shuffled.से दिखाया Lseq प्राइमर बाध्यकारी साइटों टोपी जीन अनुक्रमण (3.6 कदम) के लिए उपयोगी होते हैं.
चित्रा 3 DNase मैं पचाने टोपी जीन (AAV2, 8 और 9) के लिए उदाहरण. टोपी जीन के उत्पादों की एक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण दिखाया संकेत अलग ऊष्मायन समय (मिनट में: सेकंड) का उपयोग हज़म. लेन यू से पचाया नियंत्रण के रूप में इनपुट टोपी टुकड़ा पूल से पता चलता है. डीएनए मार्कर बैंड की गलियों में आकार एम kilobases के हैं. इस उदाहरण में, आदर्श हज़म 1:45 या 2:00 मिनट है, जो 100 से 500 आधार जोड़े के आसपास पसंदीदा प्रबल चोटी (पीला बॉक्स) झुकेंगे ऊष्मायन समय के साथ प्राप्त किया गया.
चित्रा 4 तीन मानव कोशिका लाइनों की माइक्रोस्कोपी आधारित विश्लेषण पाँच अलग अलग पुनः संयोजक YFP व्यक्त AAV ve के साथ संक्रमित के लिए उदाहरण.(शीर्ष पर नाम) ctors फेरबदल टोपी जीन के साथ किए गए बेतरतीब ढंग से एक मूल AAV2, 8 और 9 के आधार पर पुस्तकालय से चयनित हैं.
चित्रा 5 FACS आधारित चार सेल संक्रमित 18 अलग पुनः संयोजक YFP व्यक्त AAV वैक्टर (शीर्ष पर नाम छवि से उन सहित, 4.) धारावाहिक दस गुना dilutions के साथ प्रकार के विश्लेषण के लिए उदाहरण के साथ टोपी बेतरतीब ढंग से चुनी जीन में फेरबदल एक मूल पुस्तकालय से AAV2, (8 और 9). YFP अभिव्यक्ति आसान दृश्य के लिए रंग कोडित. कर रहे हैं चित्रित प्रतिशत कोशिकाओं transduced, जिससे काला हमेशा 0% और सफेद उच्चतम प्रत्येक कोशिका प्रकार में मापा संख्या इंगित करता है. क्लोन बी 2 (लाल) गरीब समग्र प्रभाव के साथ एक क्लोन एक मिसाल है, के रूप में अचयनित capsids से उम्मीद की जा सकती है. ध्यान दें कि FACS विश्लेषण और अधिक संवेदनशील है और भी निलंबन की कोशिकाओं (जैसे SupT1 के रूप में) है कि कम माइक्रोस्कोपी करने के लिए उत्तरदायी हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. हू, मानव, म्यू, murine है.
चित्रा 6 कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव की कोशिकाओं में विशिष्ट उपस्थिति AAV और Adenovirus साथ उत्पादक सह संक्रमण के बाद (इस मामले में HeLa). कोशिकाओं या तो (शीर्ष बाएँ पैनल) असंक्रमित छोड़ दिया गया या Adenovirus का संकेत मात्रा (सेल प्रति कण) से संक्रमित है.
7 चित्रा पुस्तकालय संक्रमण और प्रवर्धन के लिए एक उपाय के रूप में पश्चिमी सोख्ता के द्वारा AAV capsid प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच. बाईं धब्बा एक AAV पुस्तकालय है और सहायक Adenovirus (μl में) के विभिन्न संस्करणों के साथ सह - संक्रमित कोशिकाओं से पता चलता है. पहले दो लेन में सह के लिए अच्छा उदाहरण हैंबमुश्किल detectable AAV प्रोटीन अभिव्यक्ति की उपज है, लेकिन नहीं अत्यधिक पर्याप्त AAV संक्रमण और प्रवर्धन और इसलिए वांछित तंग उठाना जीनोटाइप-phenotype के संकेत nditions. इस प्रकार, 0.1, 1 इन supernatants की या 10 μl ताजा कोशिकाओं के पुन: संक्रमण (सही धब्बा) के लिए इस्तेमाल किया गया. सी लेन कोशिकाओं में AAV अकेले के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण (नहीं detectable helpervirus की अनुपस्थिति के कारण अभिव्यक्ति) के रूप में संक्रमित थे.
AAV क्लोनों प्रोटीन (संख्या एमिनो एसिड) एक पुस्तकालय से दृश्यों की संख्या 8. तुलना AAV2, 8 और 9 से पहले और चयन के बाद आधारित है. लाल रेखा से ऊपर दृश्यों पैतृक AAVs दिखा. बैंगनी तीर मुताबिक़ पुनर्संयोजन घटनाओं से संकेत मिलता है. लाल तीर के निशान एक ओवर पार के बीच AAV2 और AAV9 सभी चयनित क्लोन में उल्लेख किया है.
9 चित्रा </ मजबूत> का बचाव सफलतापूर्वक पीसीआर के माध्यम से माउस के ऊतकों से संक्रमित AAV क्लोन. इस उदाहरण में, AAV टोपी जीनों थे पीसीआर प्रवर्धित माउस यकृत से परिधीय पुस्तकालय जलसेक के बाद एक सप्ताह निकाले, प्राइमर जोड़ी सैफ / R (छवि 2) का उपयोग. 1 लेन उम्मीद 2.2 kilobase बैंड से पता चलता है, जबकि 2 लेन एक गैर टेम्पलेट नियंत्रण है. पीएसी मैं और ए एस सी मैं प्रतिबंध के बाद, परिलक्षित टुकड़े थे और एक माध्यमिक पुस्तकालय के बाद फिर से जान फूंकना उत्पादन के लिए मूल प्लाज्मिड प्राप्तकर्ता (छवि 2) में फिर से क्लोन. गलियों एम में डीएनए मार्कर बैंड के आकार kilobases में संकेत कर रहे हैं.
10 चित्रा संवर्धित कोशिकाओं में एक समृद्ध कल्पना AAV के बेहतर प्रदर्शन के लिए उदाहरण. AAV - डीजे क्लोन 3 से पहले किया गया है हमारे द्वारा की सूचना दी, यह ज्यादातर AAV 2 सीरमप्रकारों, 8 और 9 के बीच एक संकर का प्रतिनिधित्व करता है, और एक librar से चुना गया y जमा मानव antisera की उपस्थिति में मानव यकृत कोशिकाओं में इन तीनों के अलावा पांच अतिरिक्त सीरमप्रकारों युक्त. आठ प्राकृतिक AAV सीरमप्रकारों (1-6, 8 और 9 शीर्ष पर संकेत) के लिए अपनी क्षमता की तुलना करने के लिए, सभी टोपी जीन स्वयं पूरक GFP-व्यक्त वैक्टर 8,19 शुद्ध उत्पादन में इस्तेमाल किया गया. इन 2x10 9 मिलीग्राम प्रति वेक्टर जीनोम को शामिल करने के लिए सामान्य थे और फिर दस गुना धारावाहिक dilutions पर दिखाया सेल लाइनों transduce किया. तीन दिन बाद Gfp व्यक्त कोशिकाओं गिना रहे थे और कमजोर पड़ने कारक खाते में ले जा रही द्वारा संक्रामक titers निर्धारित किया गया है. छवि में कोड के विपरीत. 5, गहरे रंग यहाँ कण संख्या प्रति और उच्च infectivities संकेत मिलता है. जैसा कि स्पष्ट है, चयनित AAV-डीजे कल्पना सभी प्राकृतिक AAV wildtypes को बेहतर साबित लागू चयन योजना की सफलता एक उदाहरण है. fibr, fibroblasts, हा, हम्सटर, हू, मानव, म्यू murine, सी, एक प्रकार का बंदर.
11 चित्रा चयनित माउस जिगर में कल्पना AAV के विश्लेषण के लिए उदाहरण. क्लोन AAV डी.एन. के murine hepatoma कोशिकाओं पर चुना गया था और फिर luciferase व्यक्त पुनः संयोजक वैक्टर 8 उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया. दिखाया प्रतिनिधि (समूह प्रति तीन) इस वेक्टर या wildtype AAV8, एक सबसे शक्तिशाली प्राकृतिक आइसोलेट्स माउस 9 जिगर में जाना जाता है के आधार पर नियंत्रण के बराबर खुराक के परिधीय जलसेक के बाद एक सप्ताह के चूहे कर रहे हैं. ध्यान दें कि जब AAV-डी.एन. क्लोन जिगर (पैनल (मैं)) में थोड़ा कम समग्र अभिव्यक्ति देता है, यह इस अंग के लिए विशिष्ट है के बाद से यह काफी कम दर्शाती गैर यकृत के ऊतकों में बंद लक्ष्यीकरण एक बार जिगर अभिव्यक्ति के स्तर किया गया है इमेजिंग सॉफ्टवेयर (पैनल (द्वितीय)) के माध्यम से समायोजित.
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Discussion
यहाँ, हम के माध्यम से डीएनए परिवार फेरबदल और कोशिकाओं में या पशुओं में विकास के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक चरणों और AAV capsid इंजीनियरिंग के लिए दिशा निर्देशों को रेखांकित किया है. संक्षेप में, इन प्रोटोकॉल मानकीकृत प्रक्रियाओं हम पहली बार 2008 में 3 AAV क्षेत्र के भीतर रिपोर्ट के संस्करणों रहे हैं. जबकि दूसरों के द्वारा अनुवर्ती अध्ययन की बाढ़ कई संशोधनों जैसे, 10-13 की सूचना दी है, हमारे वर्तमान संस्करण बुनियादी जबकि ऊपर स्केलिंग और किसी की जरूरत के लिए अनुकूलन करने के लिए उत्तरदायी जा रहा है प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उपज रणनीतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं.
हमारे लिए पूरी प्रक्रिया मानकीकरण के प्रयासों के बावजूद, कुछ कदम अभी भी परीक्षण और त्रुटि आधारित दृष्टिकोण की आवश्यकता है. यह विशेष रूप से तथ्य यह है कि मैं DNase ऊष्मायन समय के रूप में स्थितियों की प्रतिक्रिया, (चित्र में उदाहरण देखें 3.) को अत्यधिक संवेदनशील है टोपी जीन की वजह से विखंडन के लिए लागू होता है. हम की एक श्रेणी में शुरू टुकड़े के साथ सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के100 से 500 आधार जोड़े और इस प्रकार विभिन्न DNase शर्तें (जैसे, एंजाइम और ऊष्मायन समय की मात्रा) की कोशिश तक जेल तस्वीर छवि में बॉक्सिंग गलियों जैसा दिखता है की सलाह देते हैं. 3.
यह वैसे ही असंभव है पूरी तरह से सेल संस्कृति में पुस्तकालय चयन के दौरान अलग - अलग चरणों के मानकीकरण. के रूप में उल्लेख किया है, एक महत्वपूर्ण पहलू एक दिया सेल प्रकार में एक नए पुस्तकालय या Adenovirus की संक्रामकता के बारे में अनिश्चितता है, के रूप में वर्णित सोख्ता पश्चिमी अप्रत्यक्ष माप की आवश्यकता होती है. संयोगवश, हमारे अनुभव के आधार पर, "अच्छा" AAV / Adenovirus टीका आम तौर पर लेता है एक कुछ समानांतर प्रयासों केवल संस्करणों को खोजने.
समान विचार AAV पुस्तकालय चयन पशुओं में जो भी आदर्श कई मापदंडों के एक साथ परीक्षण शामिल है (उदाहरण के लिए, वायरल पुस्तकालय की खुराक, समय बिंदु फसल की टीका के बाद, इंजेक्शन मार्ग) से सीधे predic कारण प्रायोगिक विकल्पों की कमी के लिए लागू होते हैंvivo में पुस्तकालय संक्रामकता. आम तौर पर, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि vivo चयन में आम तौर पर और अधिक physiologically तक इन विट्रो में और vivo में 3 AAV infectivities के बीच प्रसिद्ध विसंगति सहित कई कारणों के लिए प्रासंगिक है. इसके अलावा, vivo विकास में एक ही रास्ता है कि अंततः एक नैदानिक सेटिंग में इस्तेमाल किया जाएगा में पुस्तकालय बिगोना करने के लिए परमिट. यह capsids है कि शक्ति के साथ एक वांछित सेल प्रकार को संक्रमित करने के लिए न केवल समृद्ध है, लेकिन महत्वपूर्ण बात यह एक स्वीकार्य वितरण मार्ग से ऐसा करने का मौका प्रदान करता है.
चयन प्रणाली के बावजूद, हम आम तौर पर यह बेहतर सकारात्मक और नकारात्मक दबाव गठबंधन के रूप में यह व्यक्ति उम्मीदवारों को समृद्ध करने की संभावना में वृद्धि होगी पर विचार करें. बाद के लिए एक कारण है संभावना है कि केवल सकारात्मक दबाव (जैसे, एक निश्चित सेल प्रकार पर विकास) के तहत चयनित अभी भी तेज़ी के साथ अन्य कोशिकाओं साझा () सेलुलर रिसेप्टर (ओं) को संक्रमित कर सकते हैं capsids. एक दूसरा कारण यह है कि लक्ष्य कक्ष प्रकार पहले से ही पुस्तकालय से कई इनपुट वायरस के लिए अतिसंवेदनशील हो, हो सकता है संभावना को कम करने के लिए अतिरिक्त नकारात्मक दबाव के अभाव में भी अधिक कुशल capsids को समृद्ध.
बाद के लिए एक उदाहरण है कि हम सफलतापूर्वक से पहले का इस्तेमाल किया है जमा मानव युक्त antisera AAV सीरमप्रकारों कि मानव आबादी में प्रचलित हैं के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति में पुस्तकालय प्रवर्धन है. कम कठोर चयन के समानांतर में लागू प्रक्रियाओं के विपरीत, केवल सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के इस संयोजन हमें एक एकल क्लोन (AAV डीजे, चित्र 10) 7x10 लगभग 5 3 वेरिएंट के एक पुस्तकालय के बाहर निकालने के लिए अनुमति दी.
किसी भी मामले में, हम कई नेतृत्व चयन योजना, और नहीं सिर्फ शीर्ष उम्मीदवार से उभरते capsids परीक्षण के महत्व को फिर से बयान करना चाहते हैं. वास्तव में, यह अच्छी तरह से संभव है कि दूसरे या तीसरे सबसे हावी क्लोन के समान रूप से या भी कर रहा हूँनेतृत्व उम्मीदवार, और / या की तुलना में उपयोगी अयस्क आगे दिए गए आवेदन के लिए वांछनीय phenotypes प्रदर्शन कर सकते हैं. हम इसलिए हमेशा एक चयन प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद उम्मीदवारों की अंतिम सूची में से कम से कम दो और अधिक capsids और लेने के लिए उन के रूप में 5.4 चरण में उल्लिखित अध्ययन करने की सलाह देते हैं.
पिछले नहीं बल्कि कम से कम, हम दोहराना डीएनए परिवार फेरबदल केवल AAV इंजीनियरिंग विधि नहीं है कि इच्छा. वैकल्पिक दृष्टिकोण त्रुटि - प्रवण 14,15 पीसीआर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक विशिष्ट AAV के उजागर क्षेत्रों में पेप्टाइड पुस्तकालयों का प्रदर्शन 4,5 capsid के माध्यम से एक विशेष AAV टोपी जीन में यादृच्छिक बिंदु उत्परिवर्तन की शुरूआत. जबकि एक व्यापक चर्चा या इन तरीकों की तुलना 16-18 कहीं और पाया जा सकता है, हम आसानी से निष्कर्ष है कि विकल्पों की यह अधिकता के ध्यान में रखते, AAV इंजीनियरिंग और विकास के क्षेत्र के लिए भविष्य में निश्चित रूप से बहुत उज्ज्वल है और शायद अभी शुरू ही कर सकते हैं .
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Disclosures
सभी लेखकों की घोषणा है कि वे खुलासा नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों कृतज्ञता हीडलबर्ग विश्वविद्यालय में उत्कृष्टता CellNetworks क्लस्टर के रूप में अच्छी तरह से Chica और हाइन्ज़ (CHS) स्कालर नींव के द्वारा उनकी प्रयोगशाला के बकाया समर्थन, टीम के सदस्यों और काम को स्वीकार करते हैं. हम डीएनए परिवार फेरबदल के माध्यम से हमारी प्रारंभिक तीन साल पहले प्रकाशन के बाद से एक बहुत सक्रिय क्षेत्र बन गया है और इसलिए प्रासंगिक प्रकाशनों जिसका काम जगह की कमी के कारण यहाँ उद्धृत नहीं किया जा सकता है के सभी लेखकों के लिए माफी माँगता हूँ कि आणविक AAV विकास की सराहना करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S (part of kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| Ampicilin sodium salt | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Heating block | BIOER | MB-102 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS analyser | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | Custom primer | |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
