Summary
Vi visar den grundläggande tekniken för att molekylärt konstruera och utveckla syntetiska Adeno-associerade virus (AAV) vektorer för genterapi via DNA-familjen skyffling. Dessutom ger vi allmänna riktlinjer och representativa exempel för urval och analys av enskilda chimärakapsider med förbättrade egenskaper på målceller i kultur eller möss.
Abstract
Adenoassocierade virala (AAV) vektorer utgör några av de mest potenta och lovande vehiklar för terapeutiska humana genöverföring på grund av en unik kombination av fördelaktiga egenskaper 1. Dessa inkluderar apathogenicity av de underliggande vildtyp virus och de mycket avancerade metoder för produktion av hög titer, hög renhet och klinisk kvalitet rekombinanta vektorer 2. En ytterligare särskild fördel med AAV-systemet jämfört med andra virus är att det finns en stor mängd naturligt förekommande serotypema som skiljer sig i väsentliga egenskaper ännu kan alla lätt konstrueras som vektorer genom användning av ett vanligt protokoll 1,2. Dessutom har ett antal grupper, inklusive vår egen utarbetade nyligen strategier för att använda dessa naturliga virus som mallar för att skapa syntetiska vektorer som antingen kombinerar tillgångar av flera ingående serotyper, eller som förbättrar egenskaperna hos en enstaka isolat. De respektive teknik för att uppnå dessa mål are antingen DNA familjen shuffling 3, dvs fragmentering av olika AAV kapsidgener följt av deras återmontering baserad på partiella homologier (vanligtvis> 80% för de flesta AAV serotyper) eller peptid display 4,5, dvs införande av vanligtvis sju aminosyror i en exponerad slinga av den virala kapsiden när peptiden helst medierar åter målsökning till en önskad celltyp. För maximal framgång, båda metoderna används i en hög genomströmning fashion där protokollen är upp-skalas för att ge bibliotek av omkring en miljon olika kapsid varianter. Varje klon sedan består av en unik kombination av flera föräldrar virus (DNA-omflyttning metod) eller innehåller ett distinkt peptid inom samma virala ryggraden (peptid visningsmetod). Det efterföljande sista steget är iterativ valet av ett sådant bibliotek på målceller för att berika enskilda capsids uppfyller de flesta eller helst alla krav i urvalsprocessen. Den senare företrädesvis kamInes positivt tryck, t.ex. tillväxt på en viss celltyp av intresse, med negativ selektion, till exempel avskaffande av alla kapsider reagerar med anti-AAV-antikroppar. Denna kombination ökar chanserna att syntetiska kapsidema överlever valet motsvarar behoven hos den given tillämpning på ett sätt som förmodligen inte skulle ha hittat på något naturligt förekommande AAV isolat. Här fokuserar vi på DNA-familjen blanda metod som teoretiskt och experimentellt mer utmanande av de två teknikerna. Vi beskriver och visa alla viktiga steg för generering och val av blandas AAV bibliotek (Fig. 1), och sedan diskutera fallgropar och kritiska aspekter av de protokoll som man behöver vara medveten om för att lyckas med molekylär AAV evolution.
Protocol
1. Beredning av Plasmid Set kodar för AAV kapsidgener
- För att underlätta rutin framställning av tillräckliga mängder av de olika AAV-kapsid (CAP) gener för efterföljande DNA-skyffling, initialt subklona dessa gener in i en gemensam plasmidens ryggrad. Det är viktigt att inkludera identiska flankerande sekvenser av> 20 nukleotider för senare användning som primerbindande ställen för innesluten PCR och för kloning (Fig. 2).
- Användning av lämpliga primers (se tabell för föredömliga primers för AAV5), PCR-amplifiera önskade cap gener från allmänt tillgängliga AAV plasmider som typiskt innehåller AAV2 rep genen intill locket genen val. Eftersom PCR-produkten kommer att användas för vanlig kloning, är ~ 1 | ig av renad produkt redan tillräcklig, och vilken som helst konventionell PCR-protokollet kan sålunda användas.
- Digerera den renade PCR-produkten (t.ex. använda agarosgelrening eller en standard-PCR-reningskit) ochMottagaren plasmiden med restriktionsenzymer vars igenkänningsställen är närvarande i de primrar som används för amplifiering locket (1,1) såväl som i den mottagande plasmiden. I vårt laboratorium, använder vi Pac I och Asc I-ställen (fig 2) som de är frånvarande i de flesta AAV.
2. DNas-baserade Cap Gene Fragmentering
- PCR-amplifiera cap-gener i valet av de plasmider som genereras i steg 1.1-1.3. En reaktion som beskrivs nedan kommer att ge ~ 3 ^ g av PCR-produkt. Beroende på antalet cap gener som ska ingå i biblioteket, för detta räcker upp till sex blandningsavdelningama reaktioner.
- För PCR, inrättat en 50 pl reaktion innehållande 200 ng locket plasmiden, varje primer vid 2 ^ M slutlig koncentration, 10 | il 5x Hifi-buffert och 1 pl Hifi-polymeras. Starta med 5 min vid 95 ° C och sedan köra 40 cykler av 15 sek 94 ° C, 30 sek 57 ° C och 3 min 68 ° C, följt av en slutlig 10 min steg vid72 ° C. Rena PCR-produkterna via gel eller kit och sedan ställa in en kontrollerad DNas digest att skapa fragment cap genen för återmontering på chimärer.
- Därför, lika blanda olika cap PCR produkter till ett totalt belopp av 4 pg i 54 pl H 2 O. Tillsätt 6 pl DNAs reaktionsbuffert och 0,5 | il DNas I till reaktionen försiktigt knacka tre gånger, centrifugera kort och omedelbart ut på en 25 ° C värmeblock. Inkubera mellan 1 och 2 min (sätta upp flera parallella reaktioner och avsluta dem i steg om 15 sek), sedan stoppa reaktionen genom att tillsätta 6 pl 25 mM EDTA och genom att kort virvling och inkubation 10 minuter vid 75 ° C.
- Rena cap-fragmenten på en standard 1% agarosgel. Idealt bör ett utstryk vara synlig mellan 100 och 500 baspar. Eftersom DNas I är ett mycket potent enzym, korrekt hantering och timing är kritiska i detta steg, och flera variationer i inkubationstid i steg 2,3 kan behövas för optimal upplösningÜLTS (fig. 3). Rena eluerat DNA med en vanlig sats och bestämma dess koncentration.
3. DNA-familjen Skyffling
- Första, återmontera huvudskruvarna fragment i full längd sekvenser via en PCR där de självsugande baserade på partiell homologier. Därför inrättas en 50 ^ reaktion med 500 renade ng fragment (steg 2,4), 10 ul 10x Phusion buffert, 1 pl 10 dNTPs mM, 1,5 pl DMSO och 0,5 pl Phusion II polymeras. Inkubera 30 sek vid 98 ° C och sedan köra 40 cykler av 10 sek 98 ° C, 30 sek 42 ° C och 45 sek 72 ° C, följt av en slutlig 10 min vid 72 ° C.
- I en efterföljande andra PCR, amplifiera de åter hopsatta cap-gener för efterföljande kloning, med användning av primrar som binder till de konserverade flankerande sekvenser (fig. 2). Därför upprättas en 50 pl reaktion innehållande 2 | il av den första PCR (steg 3.1), varje primer vid en slutlig koncentration av 2 | iM, 0,5 | il MgCl2,10 | il 5x Hifi-buffert och 1 pl Hifi-polymeras. Vi rekommenderar att du kör 16-24 PCR för att säkerställa tillräckligt hög avkastning för efterföljande kloning. Pool av PCR och rena den oavkortade locket bandet (gel eller kit).
- Digerera det renade poolen cap-gen med PacI och Asc I för kloning in i en replikationskompetent AAV-plasmid som bär AAV-ITR (inverterade terminala upprepningar; replikering och signaler förpackningar) samt AAV2 rep-genen. Den senare bör följas av samma sajter för att rymma poolen cap-genen "i ram" (se figur 2 för detaljer). För att uppnå fullständig uppslutning av PCR-produkten, inkubera över natten med ett överskott av enzym.
- Ligera cap-fragment och den lämpligt skära AAV-ITR / rep-ryggrad vid ett molförhållande 3:1. Göra en 40 | il total volym mastermix (tillräckligt för 20 transformationer) med en slutlig DNA-koncentration av 50 ng / | il och inkubera över natten vid 16 ° C.
- Transformera ligeringsreaktion genom blandning (på is) 2 | il med 30 ^ il elektro-kompetenta E. coli (ökat från kommersiella celler och gjorts kompetenta att använda någon standardprotokoll). Lägg till i förväg kylda elektroporation kyvetter (1 mm mellanrum) på is. Elektroporera till 1,8 kV, 200 Ω och 25 pF. Tidskonstanten bör vara nära 5 ms. Tillsätt omedelbart 1 ml förvärmd SOC-medium och överförs till en 250 ml kolv. 20 sådana elektroporeringar kommer att ge ett bibliotek med en mångfald av cirka 1x10 6 olika kloner.
- Tillsätt 1 volym för-värmd SOC-medium till de sammanslagna transformationer och skaka vid 37 ° C och 180 rpm under 1 timme. Därefter ta fram den totala volymen till 800 ml med LB-medium plus ampicillin (slutlig koncentration av 50 pg / ml) och inkubera under ytterligare 16 h under samma betingelser. Rena biblioteket plasmid-DNA med användning av t. ex. en Qiagen Mega prep kit.
Valfritt vid steg 3,6: För att beräkna den exakta biblioteket mångfald, plåt ett aliquot av 800 ml lösning (före 16 h inkubation) på LB-ampicillinplattor (t.ex. 10 | il på ett 10 cm platta) och räkna kolonier nästa dag. Dessutom, för att validera hög hasande effektivitet, sekvens t.ex. 24 kloner och anpassa dem till de föräldrar cap-gener (se även figur 8). Slutligen, för att bekräfta biblioteket vitalitet och hög funktionell mångfald, plockade subklonen slumpmässigt cap gener i en AAV-hjälpare plasmid och använda dem för att producera och analysera rekombinanta vektorer i liten skala (fig. 4-5) (se också steg 5,4 nedan).
4. Produktion av virala bibliotek
- Seed 10 15 cm 2 skålar med HEK293T-celler (4.5x10 6 celler / skål) och 48 h senare transfektera med 220 ug AAV biblioteket och 220 mikrogram adenoviral plasmid (krävs för AAV förökning). Därför, i förväg varm PEI (polyetylenimin) och 300 mM NaCl vid 37 ° C. Därefter blanda 7,9 ml NaCl och DNA och tillsätt H2O till en total volymig om 15,8 ml. I ett separat rör, blanda 3,52 ml PEI, 7,9 ml NaCl och 4,38 ml H2O (alla volymer för tio transfektioner). Kombinera de blandningarna (virvel) och inkubera under 10 min vid rumstemperatur, innan fördelning av lösningen jämnt över diskgodset (3 ml per skål).
- Efter 48 h skrapa av cellerna i mediet och centrifugera dem ned vid 1200 rpm under 15 min. Återsuspendera cellen pelleten i 6 ml lysbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 50 mM NaHCOs 3) och i enlighet med 5 frysnings-upptiningscykler (-80/37 ° C). Inkubera med 50 U bensonas per ml under 1 h vid 37 ° C, innan spinning ned celldebris vid 3750 rpm under 20 min.
- Framställ 15%, 25% och 40 spädningar% (med 2,5 | il / ml phenolred) från en 60% jodixanol (OptiPrep i PBS-MK) lager i PBS-MK (1 x PBS, 1 mM MgCl2, 2,5 mM KCl).
- Inrättat en gradient för AAV rening genom användning av en Pasteur-pipett för att lägga 5 suspensionen ml virus i en Beckman Quick Seal-centrifugrör (14x89 mm), följt av 1,5 ml each 15%, 25% och 40% iodixanol lösning. Toppen av gradienten med lysbuffert.
- Ultracentrifug vid 50,000 K under 2 h vid 4 ° C i en Beckman rötor Ti70.1. Rengör utsidan av röret med 70% etanol, sticka en nål i toppen av röret för ventilation och dra 1,2 ml av 40% iodixanol bråkdel hjälp av en nål. Undvik att dra från 25% andel eftersom det innehåller tomma AAV kapsider.
5. Screening och selektion
- Vid denna punkt kan man antingen iterativt förstärker hela biblioteket i odlade celler eller i djur förrän chimärakapsider uppvisar önskade egenskaper har uppstått (fig. 6-11).
- Att välja i odlade celler, co-infektera olika alikvoter av biblioteket (t.ex. 1, 10 och 100 | il) och adenovirus-5 för att stödja AAV tillväxt. Testa flera varianter av bibliotek och adenoviral medhjälpare är nödvändig eftersom biblioteket smittsamhet i en viss celltyp kan inte förutsägas. Skördaceller efter ca 3 dagar, extrahera amplifierade AAV via frysning-tining, inaktivera adenovirus under 30 min vid 56 ° C och åter-infektera nya celler. Upprepa upp till 5 gånger tills olika capsids blir berikad (validera genom sekvensering).
- För selektion i djur, infekterade med biblioteket och extrahera den önskade vävnaden eller celltypen efter ~ 1 vecka. Inte samtidigt infekterar med adenovirus som detta kommer att orsaka negativa effekter på djur. Rädda viralt DNA genom PCR med användning av samma primrar som ovan (fig 2), åter klona locket poolen, producerar en färsk bibliotek och upprepa tills distinkta kapsider berikats (validera genom sekvensering).
- De exakta betingelserna (volym-titer, väg) för selektion in vivo kommer att bero på målvävnaden av intresse. För lever, möss typiskt infekterade med 1x10 11 till 1x10 12 virala partiklar i en total volym av 200 pl PBS via injektion i svansvenen (IV). Den begränsande faktorn är vanligtvis den virala titern för Original beredning, eftersom injektion av 1x10 12 AAV i 200 | il kräver en titer av minst 5x10 12 / ml, vilket inte alla laboratorier kan rutinmässigt uppnås. Därför, medan en maximal titer är fördelaktigt för den första infektionen (eftersom biblioteket ännu inte har berikats för effektiva kapsidema i en viss vävnad och kan således ha en relativt låg total smittsamhet), skulle vi rekommenderar att använda minst 1x10 11 partiklar per mus för levern val.
- Om flera möss är tillgängliga, är det mycket värdefullt att injicera olika partikel nummer besläktad med valet i odlade celler, och att använda flera möss per grupp (och sedan slå ihop de insamlade lever inom varje grupp) för att minimera variabilitet och öka framgången priser, t.ex. 3 möss vid 1x10 11 och 3 möss på 1x10 12 partiklar.
- Eftersom AAV är en icke-patogen och replikering-inkompetenta (utan helpervirus)-virus, finns det inga biverkningar att leta efter i frånvaro av Adenovirus.
- För eutanasi, djuren bedövades med en isofluran förångare och därefter avlivades via cervikal dislokation.
- De vävnader (lever i detta fall) skördades efter att djuren hade bekräftats avlivades. I allmänhet finns det inget behov även för andra vävnader att perfundera djuren eller för att skörda AAV-infekterade organ före döden, eftersom det AAV-DNA är stabil och kan lätt räddas från frusna cellerna och vävnaderna.
- För att studera enstaka kapsidema (från biblioteket (steg 3,6) eller efter valet (steg 5.2-5.3)), ger AAV vektorer som kodar en reportergen (t.ex. GFP 6) genom att följa stegen 4,1-4,5. Därför klona cap-gen av intresse in i en vanlig AAV-hjälparplasmiden 2. I steg 4,1, trippel-transfektera cellerna med 14,7 ug vardera av AAV-vektor (som kodar för reporter), AAV hjälpare och adenoviral hjälpare. Infektera odlade celler eller djur med renat virus vid olika mängder och bestämningarne transduktion effektiviteten, exempelvis genom FACS eller mikroskopi.
6. Representativa resultat
Användning av det protokoll som beskrivs här resulterar normalt i virala bibliotek med en mångfald av cirka 1x10 6 unika kapsidema som sedan kan screenas för enskilda partiklar uppvisar de flesta eller alla önskade egenskaper på en given cellinje eller djur. I det följande kommer vi att tillhandahålla representativa exempel på resultat från sådana in vitro eller in vivo visningar.
Dessförinnan, men anser vi det viktigt att återigen påpeka nyttan av att analysera individuella kloner från den ursprungliga plasmiden biblioteket för sin funktionalitet och mångfald (tillval vid steg 3,6). Detta beror på att de två sistnämnda parametrarna är yttersta kritiska förutsättningar för framgång valet av den faktiska viral biblioteket som görs från plasmiden biblioteket. Därför kan en pick slumpmässigt enda skyffladecap-gener och använda dem för att producera rekombinanta AAV-vektorer (råextrakt eller renade partiklar, beroende på den önskade graden av precision) som uttrycker en lätt detekterbar och mätbar reportergen. En typisk analys för att jämföra de olika kapsid varianter är då fluorescens-mikroskopi, såsom visas i det representativa exemplet i FIG. 4.
En alternativ metod är FACS-baserad mätning av fluorescerande reportergenuttryckning, som håller de extra fördelarna att den även medger bestämning av genuttryck per cell, samt att det fungerar för suspensionsceller. Fig.. 5 visar ett typiskt resultat från en sådan en FACS-baserad analys av råa AAV-vektorförråd lysat i olika celltyper.
Eftersom den ovan beskrivna urval av enskilda cap chimärer är slumpmässig och begränsad, är det naturligtvis inte användbart som en verklig strategi för anrikning av önskade kandidater. Istället val av viRAL biblioteket i målceller eller vävnader i djur är mer lämpligt. Eftersom villkoren och parametrar varierar med varje ansökan kommer vi att lyfta fram bara några representativa riktlinjer och resultat.
Det enklaste valet är iterativ biblioteket förstärkning på odlade cellinjer eller primära celler (steg 5,2). Eftersom AAV kräver adenovirus-infektion för sin förökning, måste målcellerna vara känsliga för adenovirus. Man kan sedan växa och infektera dem, t.ex. i 6-brunnar som håller tillräckligt cellantal per brunn för att säkerställa full täckning av biblioteket. En annan viktig föreställning är att balansen av AAV-och adenovirus är känslig, för mycket AAV kommer att hämma Adenovirus, medan ett överskott av den senare kommer att döda cellerna (till skillnad från AAV orsakar adenovirus lytiska infektioner) innan AAV kan replikera.
Eftersom biblioteket infektivitet på en viss celltyp är okänd, finna "bra" AAV: Adenovirus-förhållanden vidvilka båda kan propagera kräver parallell testning av olika kombinationer av doser av biblioteket och den adenovirala hjälpar (t.ex. 10:01, 01:01 och 01:10). Ett bra mått för potent adenovirus-infektion är förekomsten av cytopatiska effekter tre dagar efter virusinympning och representerade av cell-avrundning och lösgörande såsom framgår av fig. 6. Vice versa, en som är användbara avläsning för AAV-infektion och amplifiering är detektion av kapsidproteiner med Western blotting, med användning av B1 antikropp som känner igen en mycket konserverad AAV-kapsid-epitopen (fig 7) 7.
Ett viktigt beslut är då vilken råolja AAV extraherar att plocka för efterföljande återinfektion av färska celler (steg 5,2). Helst ska man ta dem där de AAV-kapsid banden är minst anmärkningsvärda (Fig. 7) eftersom dessa tyder på en tight genotyp-fenotyp koppling. Den senare beskriver den situation i vilken ett genom som kodar för en viss kapsid variant ärfaktiskt förpackas in i motsvarande kapsiden. Att uppnå och bibehålla en stram genotyp-fenotyp koppling är nyckeln till en framgångsrik urval av enskilda virala kandidater som i sin tur säkerställer att kapsidema med önskade egenskaper leverera besläktade genetiska mallen i cellerna under varandra infektion rundor. Därför rekommenderar vi att plocka råa extrakt med måttlig kapsid uttryck för återinfektion och använda minimala mängder. Tillsammans kommer dessa två åtgärder för att förhindra överbelastning av de nyligen infekterade celler med olika kapsid / genomet kombinationer som annars skulle kunna störa genotypen-fenotyp kopplingen när re-infekterade virusen börjar replikera och åter-förpackningar sina genom till icke-besläktade kapsider.
Dessutom är det kritiskt att övervaka biblioteksvariation under upprepade infektioner omgångar av DNA-sekvensering. Idealt kommer en märka förskjutningar i kompositionen av individuella kloner indikerar framgångsrik selektion, dvs sammanlagdaulation distinkta serotyp fragment och förluster av andra, som exemplifieras i figur. 8. I perfekt fall kommer endast ett fåtal eller till och med en enda klon slutligen detekteras, som sedan kan analyseras enligt beskrivning ovan. Om emellertid inga förändringar observerades efter fyra eller fem stycken, bör en ökning antingen selektionstryck (se diskussion) eller anser att den cellinje som används kan vara olämpligt, eftersom det kan vara alltför känslig för alltför många serotyper.
För biblioteket förstärkning in vivo (steg 5,3), samma regler och överväganden gäller, med två kritiska skillnader: För det första, gör man inte skärmen slumpmässigt utvalda kloner i djur på grund av de höga kostnaderna och etiska överväganden. För det andra kommer man inte samtidigt infekterar med helper Adenovirus eftersom det orsakar toxicitet eller dödsfall hos djur, plus adenovirala tropism skulle begränsa urvalet till celler som är mottagliga för hjälparvirus. I stället är AAV biblioteket infunderas i the djur, räddats från målcellerna / vävnad med PCR (Fig. 9) och sedan åter klonas och om för en ny infektion omgång. Som med val i kulturen, denna process upprepas tills enskilda kandidater har dykt upp.
Oavsett urvalsförfarande, är det sista steget validering av berikade kapsid varianterna i lämpliga system. Fikon. 10 och 11 visar exempel representant från vår egen tidigare val av AAV chimärer som utför exceptionellt bra i vävnadskultur eller lever av möss. Såsom ses i FIG. 10, överträffar en särskild klon (AAV-DJ 3) verkligen en samling av åtta naturliga AAV wildtypes i ett brett spektrum av cellinjer. Slutligen uppvisar en klon vald i odlade hepatoma linjer en större tropism för murina levern och därför mindre off-inriktning vid perifert infunderas i vuxna möss än potenta AAV8 styrvektorn testas i Directämnet (Fig. 11). Observera att även vara mer specifik för levern, klon AAV-DN faktiskt omvandlar detta organ lite mindre effektiv än AAV8. I detta avseende är AAV-DN en god representant exempel på resultatet av AAV evolution och val där slutkandidaterna vanligtvis uppvisar ett antal önskvärda egenskaper, men är inte nödvändigtvis perfekta i alla avseenden.
Figur 1 Schema:. Syntetisk AAV-kapsid teknik genom DNA-skyffling familj och efterföljande selektion i celler eller i djur. Protokoll steg markeras i grått.
Figur 2. AAV cap-gen givar-och plasmider mottagare som används i vårt labb för DNA familjen skyffling och bibliotek generation. Notera att dessa endast är representativa exempel, och att de exakta ställen och sekvenserkan anpassas. Vår grundläggande donatorplasmid härleds från kommersiellt tillgängliga pBlueScript II KS (+)-vektorn som vi manipuleras till att innehålla den visade primerbindningsstället och restriktionsställen, som visas med pilar respektive trianglar. Vi klonade sedan cap-generna hos AAV-serotyper 1-9 (amplifierad med primers capF / R) i denna plasmid, att bli flankerad av Pac I och Asc I-restriktionsställen. Primers T3 och T7 används för locket isolering i steg 2,2, medan senare amplifiering av åter hopsatta chimära sekvenser (steg 3.2) kan åstadkommas med användning av antingen primerpar SAF / R eller CUF / R, eller båda i en innesluten PCR. Den replikationskompetent mottagaren plasmiden bär AAV inverterade terminala repetitioner (ITRs, replikation och förpackning signaler) som flankerar AAV2 rep-genen under kontroll av AAV-P5-promotom. Pac I och Asc I-restriktionsställen nedströms om rep möjliggöra "i ram"-kloning av hela gruppen av blandade cap gener. Denvisas Lseq primerbindningssäten är användbara för cap-gen-sekvensering (steg 3.6).
Figur 3. Exempel för DNas I-spjälkning av cap-gener (AAV2, 8 och 9). Visas är en agaros-gelelektrofores-analys av produkterna från cap-gen digereringar med användning av de angivna olika inkubationstider (i minuter: sekunder). Lane U visar osmält ingången poolen locket fragment som kontroll. Storlekar av band DNA-markör i banor är M i kilobaser. I detta exempel digererar ideala erhölls med inkubationstider av 1:45 eller 2:00 min, vilket gav den föredragna dominerande topp runt 100 till 500 baspar (gul ruta).
Figur 4. Exempel för mikroskopi-baserad analys av tre humana cellinjer infekterade med fem olika rekombinanta YFP-uttryckande AAV vectors (namn på överst) gjorda med blandas cap gener slumpmässigt från en ursprunglig bibliotek baserat på AAV2, 8 och 9.
Figur 5. Exempel för FACS-analys av fyra infekterade celltyper (till tiofaldiga spädningar) med 18 olika rekombinanta YFP-uttrycker AAV vektorer (namn på toppen, även de från figur 4) görs med blandad cap gener slumpmässigt utvalda från en ursprunglig bibliotek (AAV2, 8 och 9). YFP uttryck färgkodade för enklare visualisering. Avbildade är procentsatser av omvandlade celler, där svarta alltid anger 0% och vitt flest mätt i varje celltyp. Klon B2 (röd) exemplifierar en klon med dålig total effekt, som kan förväntas från oselekterade kapsider. Notera att FACS-analys är mer känslig och kan också användas för suspensionsceller (såsom SupT1) som är mindre mottagliga för mikroskopi. hu, Mänsklig, mu, mus.
Figur 6. Typiska utseendet av cytopatiska effekter i celler (HeLa i detta fall) efter produktiv samtidig infektion med AAV-och adenovirus. Cellerna lämnades antingen oinfekterade (övre vänster fält) eller infekterades med de angivna mängderna (partiklar per cell) av adenovirus.
Figur 7. Detektering av AAV-kapsid-protein-expression genom Western blotting såsom ett mått på bibliotekets infektion och amplifiering. Den vänstra blot visar celler samtidigt är infekterade med olika volymer (i fil) av en AAV bibliotek och hjälpare adenovirus. De två första banorna är goda exempel för samarbetenditions ger knappt detekterbart AAV proteinuttryck, vilket tyder på tillräckligt men inte överdrivet AAV infektion och förstärkning och därmed den önskade täta genotyp-fenotyp koppling. Således var 0,1, 1 eller 10 | il av dessa supernatanter användes för återinfektion av färska celler (höger blöt). Celler i spår C var infekterade med AAV ensam som en negativ kontroll (ingen detekterbar expression på grund av frånvaron av helpervirus).
Figur 8. Jämförelser av proteinsekvenser (siffrorna är aminosyror) av AAV-kloner från ett bibliotek baserat på AAV2, 8 och 9 före och efter selektion. Sekvenser över den röda linjen visar föräldrarnas AAV. Lila pilar indikerar homologa rekombinationshändelser. Den röda pilen markerar en cross-over mellan AAV2 och AAV9 noteras i alla valda kloner.
Figur 9. </ Strong> Räddning av smittade framgångsrikt AAV kloner från musvävnader via PCR. I detta exempel var AAV cap-generna PCR-amplifierades från muslevrar extraherades en vecka efter perifer bibliotek infusion med användning av primerpar SAF / R (fig. 2). Bana 1 visar det förväntade 2,2 kb-bandet, medan spår 2 är en icke-mall-kontroll. Efter Pac I och Asc I-restriktionsställe, de amplifierade fragmenten åter-klonades in i den ursprungliga mottagaren plasmiden (fig 2) för efterföljande produktion och återinfusion av ett andra bibliotek. Storlekar av band DNA-markör i spåren M indikeras i kilobaser.
Figur 10. Exempel på överlägsna prestanda av en berikad AAV chimär i odlade celler. Klon AAV-DJ har rapporterats av oss före den 3, det mesta är en hybrid mellan AAV serotyper 2, 8 och 9, och har valts ut ur en librar y innehållande dessa tre plus fem ytterligare serotyperna i humana leverceller i närvaro av sammanslaget humant antiserum. För att jämföra effektiviteten till åtta naturliga AAV serotyper (anges med 1-6, 8 och 9 på toppen), var alla cap gener används för att producera renat själv kompletterande GFP-uttryckande vektorer 8,19. Dessa normaliserades till innehålla 2x10 9 vektorgenom per ml och användes sedan för att transducera de visade cellinjer vid tiofaldiga serieutspädningar. Tre dagar senare togs GFP-uttryckande celler räknades och infektiösa titrar bestämdes genom att ta hänsyn till utspädningsfaktorn. I motsats till den kod i fig. 5, mörkare färger här indikerar högre infectivities per antalet partiklar. Såsom är uppenbart, överträffar den valda AAV-DJ-chimären alla naturliga AAV wildtypes, exemplifierar framgång tillämpats selektionsschema. fibr och fibroblaster, ha, hamster, HU, mänskliga, mu, murina, si, Simian.
Figur 11. Exempel för analys av en vald AAV-chimären i muslever. Klon AAV-DN valdes på murina hepatomceller och sedan användas för att producera luciferas-uttryckande rekombinanta vektorer 8. Visas är representativa möss (tre per grupp) en vecka efter perifer infusion av lika stora doser av denna vektor eller en kontroll baserat på vildtyp AAV8, en av de kända mest potenta naturliga isolat i muslever 9. Notera att under det att AAV-DN-klon ger något mindre total expression i levern (panel (I)), är det mer specifik för detta organ eftersom den uppvisar väsentligt mindre utanför målinriktning i icke-levervävnader när levern expressionsnivåerna har justeras via bildbehandlingsprogram (panel (II)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi sammanställt viktiga experimentella åtgärder och riktlinjer för AAV-kapsiden engineering via DNA familjen skyffling och för evolutionen i celler eller i djur. I huvudsak dessa protokoll är standardiserade versioner av de förfaranden som vi först rapporteras inom AAV området år 2008 3. Medan en uppsjö av uppföljande studier av andra har rapporterat ett flertal modifikationer t.ex. 10-13, våra nuvarande versioner representerar grundläggande strategier som ger reproducerbara resultat samtidigt som mottaglig för upp-skalning och anpassning till eventuella behov.
Trots våra ansträngningar att standardisera hela förfarandet, några steg krävs fortfarande trial-and-error-baserade metoder. Detta gäller särskilt för locket genen fragmentering grund av det faktum att DNas I är mycket känslig för de reaktionsbetingelser, såsom inkubationstiden (se exemplen i fig. 3). Vi får bästa resultat med start fragment i en rad100 till 500 baspar och därmed rekommenderar att prova olika DNas förhållanden (t ex mängder av enzym och inkubation gånger) tills gelen bilden liknar de inramade banorna i figur. 3.
Det är också omöjligt att helt standardisera de enskilda stegen under biblioteket val i cellkultur. Såsom nämnts är en kritisk aspekt av osäkerhet om infektiviteten av ett nytt bibliotek eller av adenovirus i en given celltyp, som kräver indirekta mätningar såsom beskrives Western blotting. Slump, baserat på vår erfarenhet, att hitta "bra" AAV / Adenovirus ympning volymer oftast bara tar några parallella insatser.
Liknande överväganden gäller för AAV biblioteket selektion hos djur som också idealt innebär samtidigt testning av flera parametrar (t.ex. doser av det virala biblioteket tidpunkt för skörd efter inokulering, injektionsväg) på grund av bristande experimentella möjligheter att direkt predicT-bibliotek smittsamhet in vivo. Generellt är det viktigt att notera att in vivo urvalet är oftast mycket mer fysiologiskt relevant av flera skäl, inklusive den välkända skillnaden mellan AAV infectivities in vitro och in vivo 3. Dessutom in vivo evolutionen medger att infundera biblioteket på samma sätt som slutligen kommer att användas i en klinisk miljö. Detta ger möjlighet att inte bara anrika kapsidema som kraftigt infekterar en önskad celltyp, men viktigare att göra det från en acceptabel leverans rutt.
Oavsett val av system, anser vi generellt att föredra att kombinera positiva och negativa tryck som det kommer att öka chanserna att berika enskilda kandidater. En orsak till det senare är sannolikheten att kapsidema enbart valt under positivt tryck (t.ex. tillväxt på en viss celltyp) också kan fortfarande kraftigt infektera andra celler att dela (a) cellulär receptor (er). En andra orsak är att den mål-cell-typ som redan kan vara mottagliga för flera inmatade virus från biblioteket, vilket minskar risken för att berika ännu effektivare kapsider i frånvaro av ytterligare negativt tryck.
Ett exempel på det senare som vi framgångsrikt har använt tidigare är biblioteket amplifiering i närvaro av sammanslaget humant antisera innehållande antikroppar mot AAV serotyper som är vanliga i den mänskliga befolkningen. Till skillnad från mindre stränga urvalsförfaranden tillämpas parallellt, tillåten endast denna kombination av positiva och negativa tryck vi kan få ut en enda klon (AAV-DJ, Fig. 10). Av ett bibliotek av ca 7x10 5 varianter 3.
I varje fall vill vi upprepa vikten av att testa flera ledande capsids nya från ett urval system, och inte bara den översta kandidaten. I själva verket är det väl möjligt att de andra eller tredje mest dominerande kloner är lika eller till och med mmalm användbar än ledningen kandidat och / eller kan uppvisa ytterligare önskvärda fenotyper för given tillämpning. Vi rekommenderar därför att alltid ta minst två kapsidema från den slutliga listan över kandidater efter slutförandet av ett urval protokoll och att studera dem som beskrivs i steg 5,4.
Sist men inte minst, vill vi påminna om att DNA familjen skyffling är inte den enda AAV Teknisk metod. Alternativa metoder innefattar införande av slumpmässiga punktmutationer i en särskild AAV cap-genen via felbenägen PCR 14,15 samt visning av peptidbibliotek i exponerade områden av en specifik AAV-kapsid 4,5. Medan en omfattande diskussion eller jämförelse av dessa metoder kan hittas någon annanstans 16-18, kan vi konstatera lätt att med tanke på denna uppsjö av alternativ, är framtiden för området AAV teknik och utveckling säkerligen mycket ljus och har förmodligen bara börjat .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar att de inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt enastående stöd för deras lab, gruppmedlemmar och arbete med Cluster of Excellence CellNetworks i Heidelberg universitet samt med Chica och Heinz Schaller (CHS) Foundation. Vi uppskattar att molekylär AAV evolution via DNA familjen skyffling har blivit en mycket aktiv området sedan vår första publiceringen tre år sedan och därför be om ursäkt till alla som lämnat relevanta publikationer vars arbete inte kunnat citeras här på grund av det begränsade utrymmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S (part of kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| Ampicilin sodium salt | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Heating block | BIOER | MB-102 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS analyser | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | Custom primer | |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
