Summary
水果中的挥发性化合物分析的一种快速的方法描述。顶空样品匀浆中的挥发性有机化合物迅速分离，超快速气相色谱耦合（GC）的表面声波（SAW）传感器检测。还讨论了数据处理和分析过程。
Abstract
多种多样的生理变化发生在果实成熟，包括发展的一个特定的挥发性混合特征的水果香气。在采收成熟度是影响水果和蔬菜的风味品质的关键因素之一。稳健快速评估的方法，果实成熟，将使改善香气质量管理先进的育种计划，生产实践和采后处理验证。
在过去的三十年中，已进行了大量的研究，发展所谓的电子鼻，这些设备能够快速检测气味和口味2-4。目前，有几种市售电子鼻能够执行挥发性的分析，根据不同的技术。电子鼻（zNose，东部，纽伯里公园，加利福尼亚，美国）在我们的工作，包括（超快速气相色谱耦合表面声波传感器UFGCSAW）。这项技术已经被测试，它能够监控各种商品的质量，包括检测苹果5恶化;芒果6成熟和腐烂的评价; 胸腺种香气分析7 6 8个葡萄浆果中的挥发性化合物;表征植物油和椰子油10搀杂检测。
该系统可以进行香气分析的三个主要步骤：顶采样，挥发性化合物的分离和检测。在一分钟左右，生产和输出，色谱，后清除周期，该仪器是准备作进一步的分析。与zNose所取得的成果，可以比其他气体色谱系统由计算的科瓦茨指数（碘化钾）。一旦仪器已调整烷烃的标准溶液的保留时间被自动转换成KIS。然而，在温度和流量的细微变化，预计随着时间的推移发生，导致保留时间漂移。此外，根据列固定相的极性，重复性的KI计算可以改变几个指标单位11。因此制定了一系列方案和图形界面比较样品在一个半自动化的方式计算的KIS。这些方案降低了色谱分析大型数据集所需的时间和尽量减少误解时，色谱图不完全一致的数据的潜力。
我们提出了一个快速水果中的挥发性化合物分析方法。样品的准备，数据采集和处理程序进行了讨论。
Protocol
1。样品制备
- 在所需的成熟阶段收获果实。用自来水冲洗，以去除污垢和灰尘。
- 选择进行分析的基础上，如果没有外部和内部缺陷，大小均匀性的水果。
- 纵向切开的水果到挥发性抽样楔子。如果适用，去除皮肤，种子，种子腔组织，或坑。水果组织的选择必须是一致的，整个实验过程中，考虑变异在一个单一的水果（即获得同样来自赤道，开花和果蒂部分样品）。
- 结合选定的水果组织，它混合以随机，然后放入搅拌机掂量出200克。
- 加入200毫升饱和氯化钙溶液（372.5 g在20°C的500毫升去离子水）和50μL的2 -甲基异戊酸甲醇100毫米的解决方案。 氯化钙是为了作为AC酶抑制剂活性，这可能发生的经过切割和均质果肉。 2 - 甲基异戊酸增加一条，作为内部标准，监测同质化过程中的任何挥发性化合物可能造成的损失。
- 在实验室搅拌机（华林，美国），30秒18,000 rpm的均质混合物，然后立即倒入玻璃瓶和特氟隆盖密封。保持在室温下匀浆瓶，直到所有的样品制备。
- 瓶倒入匀浆后，等待10分钟允许从液体分离的泡沫，然后吸取5毫升的液体分装，无泡沫，到20毫升玻璃瓶中，密封小瓶装有用聚四氟乙烯与钢螺钉帽/硅橡胶隔垫。这个过程是适合甜瓜和梨匀浆准备。如果其他水果都用于分析，离心步骤可能需要。因此，消除泡沫，然后离心液体沉淀颗粒可能阻碍移液器。准备至少3个样品瓶作为技术复制。
- 在这一点上，样品可立即分析，或在液氮中闪光冻结，并存储在超低温（-80℃）以供日后分析。
- 冷冻样本，分析当天从冰箱取出的样品，并让他们一小时在室温下解冻。解冻后，在分析之前，更换一个新的，有一个干净，干燥的隔瓶帽。如果没有更换，隔隔凝结水解冻被卷入仪器损坏。
2。气相色谱 - 表面声波（GC-SAW）设置和数据采集
- 上zNose加载适当的分析方法。
对于酯丰富的甜瓜挥发性个人资料的分析，我们在MicroSense版本5.44.22软件（纽伯里公园，加利福尼亚，美国）的参数如下：顶吸进进口为20秒30毫升分钟-1通过泵入口温度在200°C，TENAX阱温度在225℃，载气（氦气纯度99.999％）2.9毫升min-1的流速;柱（DB-5列，1米×0.25毫米ID×0.25微米薄膜厚度）温度从45方案°C至180°C时，速度10°C间秒-1;传感器的温度在40°C，阀门在165°C。每个样品总分析时间为1分钟。 - 非取芯尖的zNose入口连接不锈钢针，并多次与周围空气净化系统，直至基线稳定，无峰大于200计数（CT）检测。
- 调整仪器使用的是直链烷烃（C6 - C14）的解决方案。调的结果是使用仪器软件科瓦茨指数（KI）为单位时间单位转换成洗脱峰的保留时间。因此，系统调整后，保留时间报道碘化钾单位。 在分析之前，让样品平衡30分钟。为了分析的样品瓶之一，插入样品瓶隔一针，以缓解压力。然后插入针连接到小瓶隔仪器入口，并开始顶空进样。分析至少有三个技术复制每个样品。
- 手动启动仪器，通过点击“播放”按钮;泵的启动和退出的蒸气以上的样本呈现。在分析结束时，屏幕上会出现一个色谱，传感器会自动加热到150°C 10秒清理。当系统的状态框“按钮再次变绿，该仪器是准备另一样本进行分析。
- 为了确保一个稳定的基准和适当的系统清洗，运行每个样品之间的空气至少有一个空白。可能从样品瓶和瓶盖的挥发性污染监测，分析2小瓶的空白（空帽瓶），在一天的开始和结束。/ LI>
3。数据导出和分析
- 数据导出到Microsoft Excel文件后使用的“巅峰记录”功能MicroSense软件收购。一旦数据被导出，添加列包含变量和复制的标签。
- 脚本中，我们的发展，名为“reform_data.py”（见图1的数据格式的一个例子之前和之后使用脚本“reform_data的数据格式转化为更容易操作（使用Python 2.6版本;免费提供上线）。 PY“）。源文件（xls格式）和表的名称为输入数据，以及输出所需的文件名（xls格式）的名称，直接在脚本编辑。
- 启动“kim_interface.py”（也写在Python 2.6; 见图2），并在上一步生成的文件导入数据。具体来说，分析的基础上观察和分析每个KI值检测的数量倍（“碘化钾命中”）。因此，该程序显示了每个KI值碘化钾点击条形图。
- 样品的特定子集的评价的碘化钾命中，分析各组的技术复制一起。要做到这一点，分析每一个治疗或变量分别通过检查/取消选中相应的框中。图形用户界面（GUI）功能的详细描述，请参阅图2标题。
- 每个KI使用GUI窗口的宽度确定后，随机选择一些相应的色谱Microsense软件和评估技术之间重叠峰复制。例如两个技术复制的重叠色谱图3。
- 一旦KI窗口个体化，使用“合并”功能在GUI合并属于窗口中，人口最多的碘化钾，KIS。通过使用此功能，标有一系列的KI值的峰合并在一个单一的的碘化钾标签，allowi吴视为一个单一的变量这样的高峰。
要做到这一点，首先点击“合并”按钮来激活该功能，并选择中心窗口作为人口最多的左键点击相应栏碘化钾。一旦酒吧已被选中，它改变颜色变绿。合并KIS落入窗口内选定碘化钾，用鼠标右键单击相应的酒吧，这会导致条变成红色，而中央碘化钾顶部添加了相应的长度的蓝色横条（ 见图4 ）。一旦选定KIS已合并到相应的中央碘化钾，点击“合并”按钮，再次接受更改，这将导致“合并”按钮变黄。 “取消合并”按钮，在出现失误的情况下，也可用。要取消合并，在GUI中点击“取消合并”按钮，然后右键单击红色的酒吧，你要取消合并。由红，酒吧变成蓝色。再次点击“取消合并”按钮，以接受更改。 - 如果一个尝试到incorrectly在一个单一的样本合并到一个单一的KI值的两个峰，一个错误消息被打印出来。在这种情况下，密切检查色谱和重新在该地区的碘化钾窗口。
- 一旦合并行动已全部完成，保存该文件。
- 进行统计分析之前，空气和小瓶空白的色谱分析，以监测可能的污染物。一旦在空白的峰碘化钾已经确定，减去面积峰面积峰目前在样品中检测到的空气和/或小瓶空白。
然后进行统计分析。
4。代表结果
电子鼻是能够探测到在不同的成熟阶段（ 图5）收获的瓜果之间的差异，在动荡的型材。第二十碘化钾窗户被确定所有样品。方差分析表明，14座山峰DETE反恐执行局由成熟阶段之间的显着变化的电子鼻。在图6中，记录了这14个组件的平均峰面积绘制，显示在繁忙的丰度的差异，两个成熟阶段，提早成熟和完全成熟的果实。
图1从仪器软件（A）和改造后，使用的“reform_data.py”脚本（二）执行。导出的数据格式。为了方便数据处理和分析，确定所有的独特的KIS所有样品，然后将数据重新排序的行和列，相应的独特的KIS峰面积与样品的信息。如果不是KI值在样本中检测到一个高峰，相应的单元格是空的。
图2。以股代息的抓屏T文件kim_interface.py“。在中心小区显示每KI与碘化钾的命中数。 “命中每碘化钾”是在一个特定的KI峰值检测样品的数量。在左侧，有三个控制所选数据的黄色盒子。他们显示参数来划分数据集（处理，复制，定性变量等）。在这个数字中，他们是（从上到下）：品种，播种日期和收获时的成熟阶段。底部：按一下3个酒吧和向左或向右移动蓝色酒吧，人们可以选择的的碘化钾范围，和最低的峰面积（'门槛'）最低和最高值。上右：“合并”按钮，允许合并选定的KIS通过手动点击情节酒吧。 “取消合并”按钮，允许一对选定的情况下扭转过程。
图3叠加色谱（在黑色和红色），两个技术复制从甜瓜挥发性顶空，说明在保留时间漂移。
图4。合并过程碘化钾的例子。在中央的阴谋，绿色的酒吧（中央碘化钾）代表的人口最稠密的碘化钾，这已被选择为中心的KI窗口。碘化钾X和碘化钾ŸKIS在窗口的兴趣下降，需要将它们合并到中央的KI。由碘化钾X的酒吧右键点击，它会变成红色，蓝色的相同长度的碘化钾X的酒吧，酒吧在同一时间，出现在顶部的绿色。通过碘化钾Y的蓝色条的长度（合并KIS）重复相同的过程将增加相应的长度。一旦所有的KIS点击绿色的“合并”按钮，合并过程结束，已添加，更改保存，按钮的颜色变成黄色。
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图5两种不同成熟阶段收获的甜瓜样品色谱图，早熟（上）和完全成熟（下），来说明电子鼻的能力，以检测挥发性丰度的差异。
图6。雷达图显示了14个部分组成，两个样品在两个不同的成熟阶段，提早成熟和完全成熟的瓜峰面积。据报道，在对数刻度的峰面积，帮助可视化的比较。在每个射线年底的数字代表相应科瓦茨指数。
Discussion
电子鼻代表水果香味或挥发性丰富的样品剖面迅速，客观地评价一个很有前途的方法。然而，移动代表峰识别是一个挑战，并可能导致误解的数据时，两个色谱不完全一致，保留时间。色谱目视检查表明，样品间的保留时间的变化经常导致相同的峰值略有不同的Ki值（约±10）标记。这翻译成夸张独特的KIS检测。以优势的事实（一）不同的化合物，目前在不同的成熟阶段，（b）技术复制的大致相同，两台计算机为基础的脚本（的“kim_merge.py”，其中包含用于处理数据的例程系统地开发集，“kim_interface.py”，它提供了一个图形用户界面（GUI））在一个半自动化的方式比较样本，色谱分析大型数据集所需的时间大大减少。这些程序允许合并，在适当情况下，峰下单碘化钾标签与标记的Ki值的范围。这有两个重要目的：（一）它使统计分析视为一个单一的变量如峰，（二）有利于峰识别和比较，与其他系统和出版值。本文结果表明，冬瓜样本zNose系统结合使用，有足够的KI识别的成熟度与香气分析的基础上，可以歧视。这是一个有前途的新技术，质量控制程序，可用于挥发物的分析。
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢COPES条例草案“（哈里斯的莫兰种子公司，戴维斯）为这种分析提供了甜瓜果实。特色作物研究倡议计划的竞争性拨款支持这个项目是由授予。 2009-51181-05783从美国农业部国家食品和农业研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | MP Biomedicals | 195088 | |
| 2-Methylbutyl isovalerate | SAFC Global | W350613 | ≥ 98%, natural, FCC |
| Methanol | Fisher Scientific | A411-4 | |
| Vial | Sigma-Aldrich | SU860098 | |
| Cap | Sigma-Aldrich | SU860101 | |
| Laboratory blender | Waring Laboratory | 7009G | 2-speed blender; 1- Liter glass container |
| Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Pyrex, 500 mL; polypropylene plug-seal |
| Needle | Electronic Sensor Technology | TLC101046 | Side hole luer |
| Alkanes solution | Electronic Sensor Technology | C6-C14 alkanes solution in methanol | |
| zNose | Electronic Sensor Technology | Model 4500 | |
| DB-5 GC column | Electronic Sensor Technology | SYS4500C5 | |
| MicroSense | Electronic Sensor Technology | Version 5.44.22 | |
| Python 2.6 | Freely available on-line | ||
| "reform_data.py" and "kim_interface.py" scripts | Scripts available as supplementary material on JoVE |
References
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