Summary
En hurtig metode til flygtig forbindelse analyse frugt er beskrevet. De flygtige forbindelser til stede i frirummet i en homogenat af prøven er hurtigt separeret og detekteret med ultra-hurtige gaskromatografi (GC) kobles med en overflade akustisk bølge (SAW) sensor. En procedure for håndtering af data og analyse er også drøftet.
Abstract
Talrige og forskelligartede fysiologiske ændringer sker under frugtmodning, herunder udvikling af en specifik flygtig blanding, der karakteriserer frugt aroma. Modenhed ved høst er en af de vigtigste faktorer, der påvirker smagen kvaliteten af frugt og grøntsager 1. Valideringen af robuste metoder, der hurtigt at vurdere frugt modenhed og aroma kvalitet ville muliggøre forbedret styring af avancerede avlsprogrammer, produktion praksis og postharvest håndtering.
I løbet af de sidste tre årtier har megen forskning blevet udført på at udvikle såkaldte elektroniske næser, som er apparater i stand til hurtigt opdage lugt og smag 2-4. I øjeblikket er der adskillige kommercielt tilgængelige elektroniske næser i stand til at udføre flygtig analyse, baseret på forskellige teknologier. Den elektroniske næse anvendes i vores arbejde (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), består af ultra-hurtige gaskromatografi kombineret med en overflade akustisk sensor (UFGC-SAW). Denne teknologi er allerede blevet testet for sin evne til at overvåge kvaliteten af de forskellige råvarer, herunder påvisning af forringelse af æble 5, modenhed og råd evaluering mango 6, aroma profilering af thymus arter 7 c 6 flygtige forbindelser i druer, 8; karakterisering af vegetabilsk olie 9 og påvisning af adulterants i jomfru kokosolie 10.
Dette system kan udføre de tre store trin aromaanalyse: headspace prøveudtagning, adskillelse af flygtige forbindelser, og afsløring. I et minut, bliver output, et kromatogram, der produceres og efter en skylning cyklus, er instrumentet er klar til yderligere analyse. De opnåede resultater med zNose kan sammenlignes med de øvrige gaskromatografiske systemer ved beregning af Kovats Indices (KI). Når instrumentet er blevet indstillet med en alkan-standardopløsning, er retentionstiderne konverteres automatisk tilKIS. Imidlertid små ændringer i temperatur og strømningshastighed forventes at forekomme over tid, hvilket retentionstider at drive. Også afhængigt af polariteten af søjlen stationære fase, kan reproducerbarheden af KI beregninger varierer fra flere indeks enheder 11. En række programmer og grafiske grænseflader blev derfor udviklet til at sammenligne beregnede KIS blandt prøver i en semi-automatiseret måde. Disse programmer reducere den tid, der kræves for kromatogram analyse af store datasæt og minimere risikoen for misfortolkning af data, når kromatogrammerne ikke perfekt afstemt.
Vi præsenterer en fremgangsmåde til hurtig flygtig forbindelse analyse frugt. Prøveforberedelse, datafangst og håndtering procedurer er også diskuteret.
Protocol
1. Prøvefremstilling
- Harvest frugter på det ønskede modningen. Skylles med ledningsvand for at fjerne snavs og støv.
- Vælg frugt til analyse baseret på fraværet af eksterne og interne fejl, og størrelse homogenitet.
- Skær frugten på langs i kiler, der skal anvendes for flygtige prøvetagning. Hvis det er relevant, fjerne hud, frø, frø hulrum væv, eller pit. Frugt væv valg skal være konsekvent gennem hele forsøget og tage hensyn til variationer inden for en enkelt frugt (dvs. få prøve lige fra den ækvatoriale, blomstre og stilkenden dele).
- Kombiner den valgte frugt væv, bland det med henblik på at randomisere det, og derefter afvejes 200 g ind i en blender.
- Tilsæt 200 ml mættet CaCl2-opløsning (372,5 g ved 20 ° C, i 500 ml deioniseret vand) og 50 pi af en 100 mM opløsning af 2-methylbutyl isovalerat i methanol. CaCI 2 er beregnet til at virke som en inhibitor af enzymatisk acvitet, som kan opstå efter opskæring og homogenisering af frugtkødet. 2-methylbutyl isovalerat er tilføjet som en intern standard for at overvåge for eventuelle tab af flygtige forbindelser under homogeniseringen processen.
- Homogenisere blandingen i en laboratorieblender (Waring, USA) i 30 sekunder ved 18.000 rpm og derefter straks hældes i glasflaske og forsegling med Teflon låg. Holde homogenat i flasken ved stuetemperatur, indtil alle prøver fremstilles.
- Efter udhældning af homogenatet i flasken, vent 10 minutter for at tillade separation af skummet fra væsken, derefter afpipetteres 5 ml portioner af væske uden skum, i 20 ml glas ravfarvede hætteglas og forsegle hætteglas med stål skruelåg forsynet med Teflon / silicone septa. Denne fremgangsmåde er egnet til melon og pære homogenat præparat. Hvis andre frugter anvendes til analysen, kan et centrifugeringstrin være påkrævet. Derfor fjerne skummet og centrifugeres væsken for at pelletere partikler, kunnehindre pipetten. Forbered mindst tre hætteglas pr prøve at tjene som teknisk gentagelser.
- På dette tidspunkt kan prøver analyseres øjeblikkeligt eller flash-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved ultra-lav temperatur (-80 ° C) til senere analyse.
- For frosne prøver fjernes på analysen dage prøverne fra fryseren og tillade dem at tø i en time ved stuetemperatur. Efter optøning, og før analyse hætteglashætte med en ny en, der har en ren, tør septum udskifte. Hvis skillevæggen ikke udskiftes, kan vand kondenseres på skillevæggen under optøning trækkes ind i instrumentet og beskadige den.
2. Gaskromatografi-overflade Acoustic Wave (GC-SAW) Set-up og Data Acquisition
- Læg den passende analysemetode på zNose.
Til analyse af esteren-rige flygtige profil melon, er vores parametre i MicroSense udgave 5.44.22 software (Newbury Park, CA, USA) som følger: headspace sugning iindløb i 20 sekunder ved 30 ml/min.-1 via pumpe; indgangstemperatur på 200 ° C; Tenax fælde temperatur på 225 ° C; bæregas (helium renhed 99,999%) strømningshastighed på 2,9 ml min-1, søjle (DB-5 kolonne, en m x 0,25 mm ID x 0,25 um filmtykkelse) temperaturprogram fra 45 ° C til 180 ° C med en hastighed på 10 ° C sek-1; sensor temperatur på 40 ° C; ventil ved 165 ° C. Den totale analysetid er 1 minut per prøve. - Tilslut en kanyle af rustfrit stål med ikke-udkerningen tip til zNose indløb og rense systemet flere gange med den omgivende luft, indtil basislinjen er stabil og ingen toppe større end 200 Counts (Ct) er fundet.
- Tune instrumentet under anvendelse af en opløsning af ligekædede alkaner (C6-C14). Melodien resultat anvendes af instrumentet software til at konvertere retentionstiden for de eluerede toppe fra tidsenheder til Kovats Index (KI) enheder. Følgelig, når systemet er indstillet, er retentionstiderne rapporteret i KI enheder. Før analysen tillader prøven at ækvilibrere i 30 minutter. For at analysere en af de prøvehætteglas, indsætte en nål ind i hætteglasset septum at aflaste. Sæt derefter nålen tilsluttet instrumentet indløb i hætteglasset septum og indlede headspace prøvetagning. Analyser mindst tre teknisk replikater per prøve.
- Manuelt starte instrumentet ved at klikke på "Play" knappen er pumpen aktiveres og trækker dampene præsenterer over prøven. Ved afslutningen af analysen vises et kromatogram på skærmen, og sensoren bliver automatisk opvarmes til 150 ° C i 10 sekunder for at rense den. Når systemet status kassen knappen bliver grønt igen, instrumentet er klar til at analysere en anden prøve.
- At sikre en stabil basislinie og passende system rengøring køre mindst én luft råemnet mellem hver prøve. For at overvåge for eventuelle flygtige forurening fra hætteglasset og hætte, analysere to hætteglas-emner (tomme hætteglas med hætte), i begyndelsen og slutningen af dagen. </ Li>
3. Data Export og analyse
- Eksportere data i en Microsoft Excel-fil efter erhvervelsen ved hjælp af "Peak logging" funktionen i MicroSense software. Når data eksporteres, skal du tilføje kolonner, der indeholder etiketter til variabler og gentagelser.
- Omdan data format for lettere manipulation ved hjælp af Python (version 2,6, frit tilgængelig on-line) script vi udviklede, kaldet "reform_data.py" (se figur 1 for et eksempel på dataformat før og efter brug af scriptet "reform_data. py "). Navnet på kildefilen (xls-format) og arknavn for input-data, samt det ønskede filnavn for output (xls-format), der redigeres direkte i scriptet.
- Start "kim_interface.py" (også skrevet i Python 2,6, se figur 2), og importere data fra filen genereres i det foregående trin. Konkret er analysen baseret på visning og analysere det antal gange hver KI værdi blev påvist("Ki hits"). Således programmet viser et søjlediagram af KI hits for hver KI værdi.
- Vurdere KI hits specifikke delmængder af prøver, analysere hver gruppe af teknisk gentagelser sammen. For at gøre dette, analysere enhver behandling eller variabel separat ved at markere / afmarkere de tilsvarende felter. Se figur 2 billedtekst detaljeret beskrivelse af den grafiske brugergrænseflade (GUI) funktioner.
- Efter identifikation af bredden af hver KI vindue ved hjælp af GUI, vælges tilfældigt nogle af de tilsvarende kromatogrammer i Microsense software og evaluere overlappende toppe mellem det tekniske replikater. Se figur 3 for et eksempel på overlejrede kromatogrammer af to tekniske gentagelser.
- Når KI vinduet individueres, skal du bruge "Flet"-funktion til rådighed i GUI at fusionere de KIS, der falder i vinduet, i den mest befolkede KI. Ved at bruge denne funktion, er toppe mærket med en række Ki-værdier samles under en enkelt KI etiket, allowing behandling af sådanne toppe som en enkelt variabel.
For at gøre dette, skal du først klikke på 'Flet' knappen for at aktivere funktionen og vælge den mest befolkede KI som centrum af vinduet ved at venstre-klikke på den tilsvarende bar. Når stangen er blevet valgt, den ændrer farve og bliver grøn. Hvis du vil flette de Kis der falder ind under vinduet i den valgte KI, skal du højreklikke på de tilsvarende barer, hvilket forårsager barer til røde, mens en blå bjælke af den tilsvarende længde lægges oven i det centrale KI (se figur 4 ). Når alle de valgte KIS er blevet fusioneret ind i den relevante centrale KI, skal du klikke på 'Merge' knappen igen for at acceptere de ændringer, dette medfører "Flet"-knappen for at slå gul. I tilfælde af fejl, er den »unmerge 'knappen også tilgængelig. For at splitte, skal du klikke på "unmerge" knappen i GUI, så højre-klik på den røde bjælke, du ønsker at splitte. Fra rød, vender bar blå. Klik på 'unmerge' knappen igen for at acceptere ændringerne. - Hvis man forsøger at incorrectly fusionere to toppe i en enkelt prøve i en enkelt Ki-værdi, er en fejlmeddelelse trykt. Under sådanne omstændigheder, se nøje kromatogrammet og omdefinere KI vinduet i den pågældende region.
- Når alle de fusionerende operationer er blevet udført, skal du gemme filen.
- Før der fortsættes med statistisk analyse, er chromatogrammer af luft og hætteglasset råemner analyseret for at kontrollere for eventuelle forureninger. Når KI af toppene i emnerne er blevet identificeret, trækkes den del af top detekteres i luft-og / eller hætteglas-emnet fra arealet af toppen til stede i prøven.
Fortsæt derefter med statistiske analyser.
4. Repræsentative resultater
Den elektroniske næse var i stand til at påvise forskelle i flygtige profiler mellem melon frugt høstet på forskellige udløb trin (figur 5). Tyve KI vinduer blev identificeret på tværs af alle prøver. En analyse af varians viste, at 14 toppe forværringcted den elektroniske næse varierede betydeligt mellem modenhed trin. I figur 6, er log af de gennemsnitlige peak områder i disse 14 komponenter planlagt at vise forskelle i peak mængderne mellem to løbetid faser, tidlig modne og fuldmodne frugt.
Figur 1. Eksempler på dataformat eksporteres fra instrumentet software (A) og efter transformation under anvendelse af "reform_data.py" script (B) udføres. For at lette data manipulation og analyse, er alle de unikke Kis identificeret på tværs af alle de prøver, så de data, der er omorganiseret med oplysningerne om prøverne i rækker og toparealet i kolonner, svarende til unikke KIS. Hvis en top ikke detekteres en Ki-værdi i en prøve, den tilsvarende celle forbliver tomt.
Figur 2. Skærmbillede fra skrifternet fil "kim_interface.py". Plottet i centrum viser antallet af hits pr KI versus KI. 'Hit pr KI' er antallet af prøver, hvor et højdepunkt med den pågældende KI blev påvist. På venstre side er der tre gule bokse styrer de markerede data. De udviser parametre til at opdele datasæt (behandlinger, replikater, kvalitative variabler osv.). I denne figur er de (fra top til bund): Sort, plantning dato og modningen ved høst. På den nederste: ved at klikke på de 3 barer og flytte den blå bjælke til venstre eller til højre, kan man vælge den mindste og den maksimale værdi af KI rækkevidde, og den minimale arealet ("Threshold"). Til højre: den "Flet"-knappen giver mulighed for sammenlægning udvalgte KIS ved manuelt at klikke på barer i plottet. Den "unmerge 'knappen gør det muligt at vende processen for udvalgte tilfælde.
Figur 3. Overlejrede kromatogrammer (i sort og rød) af to tekniske replikater fra melon flygtige headspace at illustrere et skift i retentionstid.
Figur 4. Eksempel KI fusionerende procedure. I den centrale plot, repræsenterer den grønne bjælke (Central KI) den mest befolkede KI, som er blevet valgt som centrum for KI vinduet. KI X og KI Y er Kis falder i vinduet af interesse og de skal flettes ind i den centrale KI. Ved at højre-klikke på KI X bar, bliver det rødt, og på samme tid, vises en blå linje af samme længde af KI X bar, på toppen af den grønne. Ved at gentage den samme fremgangsmåde for KI Y er længden af den blå bjælke (fusioneret KIS) vil øge den tilsvarende længde. Når alle Kis er blevet tilføjet, ved at klikke på det grønne 'Flet' knappen, de fusionerende proces ender, gemmes ændringerne, og knappen farven bliver gul.
/ Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg "/>
Figur 5. To kromatogrammer af melon prøver høstet på forskellige udløb faser tidlig modne (øverst) og fuldt modne (bund), for at illustrere evnen af den elektroniske næsen at påvise forskelle i flygtige mængder.
Figur 6. Radar afbildning, der viser topareal af 14 komponenter i to melon prøver ved to forskellige udløb trin, tidlig modne og fuldt modne. Toparealerne er rapporteret i logaritmisk skala til at visualisere sammenligningen. Tallene i slutningen af hver ray repræsenterer de tilsvarende Kovats Indices.
Discussion
Elektroniske næser repræsenterer en lovende metode til hurtig, objektiv vurdering af aromaprofiler fra frugter eller flygtige-rige prøver. Men skift i retentionstid udgør en udfordring for peak identifikation og kan føre til misfortolkning af de data, når to kromatogrammer ikke er perfekt afstemt. Visuel inspektion af chromatogrammer indikerede, at variation af retentionstiderne blandt prøver ofte forårsaget samme top, der skal mærkes med lidt forskellige Ki-værdier (ca. ± 10). Dette blev omsat til en overdrevet antallet af unikke opdaget KIS. For at drage fordel af de faktiske omstændigheder, der (a) forskellige forbindelser er til stede på forskellige løbetid stadier og (b) teknisk gentagelser er ca ens, to edb-baserede scripts ("kim_merge.py", som indeholder rutiner til håndtering af data sæt, og "kim_interface.py", som tilvejebringer en grafisk brugergrænseflade (GUI)) blev udviklet til systematisksammenligne prøver i en semi-automatisk mode, hvilket reducerer den nødvendige tid til kromatogram analyse af store datasæt. Disse programmer tillader konsolidering, hvor det er relevant, af toppe mærket med en række Ki-værdier under en enkelt KI etiket. Dette tjener to vigtige formål: (a) det muliggør en statistisk analyse til at behandle sådanne toppe som en enkelt variabel, og (b) den letter maksimal identifikation og sammenligning med andre systemer og offentliggjorte værdier. Resultaterne præsenteret her viser, at melon prøver kunne blive diskrimineret baseres på modenhed og aroma profilering ved hjælp af zNose system i kombination med tilstrækkelig KI identifikation. Dette udgør en lovende ny teknologi til analyse af flygtige stoffer, der kan anvendes til kvalitetskontrol programmer.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Bill Copes (Harris Moran Seed Company, Davis) for at give melon frugt til denne analyse. Dette projekt er støttet af specialafgrøder Research Initiative konkurrencedygtige tilskud Program ikke give. 2009-51181-05783 fra USDA National Institute for Fødevarer og Landbrug.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | MP Biomedicals | 195088 | |
| 2-Methylbutyl isovalerate | SAFC Global | W350613 | ≥ 98%, natural, FCC |
| Methanol | Fisher Scientific | A411-4 | |
| Vial | Sigma-Aldrich | SU860098 | |
| Cap | Sigma-Aldrich | SU860101 | |
| Laboratory blender | Waring Laboratory | 7009G | 2-speed blender; 1- Liter glass container |
| Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Pyrex, 500 mL; polypropylene plug-seal |
| Needle | Electronic Sensor Technology | TLC101046 | Side hole luer |
| Alkanes solution | Electronic Sensor Technology | C6-C14 alkanes solution in methanol | |
| zNose | Electronic Sensor Technology | Model 4500 | |
| DB-5 GC column | Electronic Sensor Technology | SYS4500C5 | |
| MicroSense | Electronic Sensor Technology | Version 5.44.22 | |
| Python 2.6 | Freely available on-line | ||
| "reform_data.py" and "kim_interface.py" scripts | Scripts available as supplementary material on JoVE |
References
- Kader, A. A. Flavor quality of fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).
- Persaud, K., Dodd, G. Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose. Nature. 299, 352-355 (1982).
- Gardner, J. W., Bartlett, P. N. A brief-history of electronic noses. Sensors and Actuators. 18, 211-220 (1994).
- Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. Electronic nose: Current status and future trends. Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).
- Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose. Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).
- Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection. J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).
- Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species. J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).
- Watkins, P., Wijesundera, C. Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds. Talanta. 70, 595-601 (2006).
- Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose. Food Chem. 89, 507-518 (2005).
- Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein. Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).
- Evans, M. B., Haken, J. K. Recent developments in the gas-chromatographic index scheme. Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).
