Summary
Um método rápido para análise composto volátil na fruta é descrito. Os compostos voláteis presentes no espaço de topo de um homogenato da amostra são rapidamente separados e detectados com ultra-rápida cromatografia gasosa (GC) acoplado com uma onda acústica de superfície (SAW) do sensor. Um procedimento para manipulação de dados e análise também é discutida.
Abstract
Numerosas e diversas alterações fisiológicas ocorrer durante o amadurecimento de frutos, incluindo o desenvolvimento de uma mistura específica volátil que caracteriza aroma de fruta. Maturação na colheita é um dos principais fatores que influenciam a qualidade do sabor de frutas e vegetais 1. A validação de métodos robustos que avaliar rapidamente maturação e qualidade aroma permitiria uma melhor gestão de programas de melhoramento avançados, práticas de produção e manuseio pós-colheita.
Ao longo das últimas três décadas, muitas pesquisas têm sido realizadas para desenvolver os chamados narizes eletrônicos, que são dispositivos capazes de detectar rapidamente os odores e sabores 2-4. Actualmente, existem vários comercialmente disponíveis narizes electrónicos capazes de realizar a análise volátil, com base em tecnologias diferentes. O nariz eletrônico usado em nosso trabalho (zNose, EST, Newbury Park, CA, EUA), consiste em ultra-rápido de cromatografia gasosa acoplada com um sensor de onda acústica de superfície (UFGC-SAW). Esta tecnologia já foi testada por sua capacidade de monitorar a qualidade de várias commodities, incluindo a detecção de deterioração da maçã 5; maturação e avaliação podridão em manga 6; perfil de aroma de espécies timo 7; C 6 compostos voláteis em bagos de uva 8; caracterização de óleo vegetal 9 e detecção de adulterantes em óleo de coco virgem 10.
Este sistema pode executar as três etapas principais de análise aroma: headspace de amostragem, a separação de compostos voláteis, e de detecção. Em cerca de um minuto, a saída, um cromatograma, é produzida e, depois de um ciclo de purga, o aparelho está pronto para análise posterior. Os resultados obtidos com o zNose podem ser comparados com os de outros sistemas de gás-cromatográficos por cálculo dos Índices de Kovats (Kl). Uma vez que o instrumento foi ajustado com uma solução alcano padrão, os tempos de retenção são automaticamente convertidos emKIS. No entanto, pequenas alterações na temperatura e na taxa de fluxo Espera-se que ocorrem ao longo do tempo, fazendo com que os tempos de retenção à deriva. Além disso, dependendo da polaridade da fase de coluna estacionária, a reprodutibilidade dos cálculos Ki pode variar de acordo com as unidades de índice vários 11. Uma série de programas e interfaces gráficas foram desenvolvidas, portanto, comparar KIs calculadas entre amostras de uma forma semi-automatizada. Estes programas reduzir o tempo necessário para a análise cromatograma de grandes conjuntos de dados e minimizar o potencial para a interpretação errada dos dados quando cromatogramas não são perfeitamente alinhadas.
Nós apresentamos um método para análise de compostos voláteis em frutas rápida. Procedimentos de preparação de amostras, aquisição de dados e manipulação também são discutidos.
Protocol
1. Preparação da Amostra
- Frutos da colheita na fase de maturidade desejado. Lavar com água da torneira, a fim de remover a sujidade e poeira.
- Selecione frutos para análise com base na ausência de defeitos internos e externos, e homogeneidade de tamanho.
- Cortar frutas longitudinalmente em fatias para ser usados para a amostragem volátil. Se for o caso, retire a pele, sementes, tecidos da cavidade de sementes, ou cova. Seleção tecido de frutos deve ser consistente durante todo o experimento e ter em conta a variabilidade dentro de uma única fruta (isto é, obter amostra igualmente da flor, equatorial e peças finais tronco).
- Combine o tecido de frutos selecionado, misturá-lo, a fim de embaralhar e pesar 200 g em um liquidificador.
- Adicionar 200 mL de solução saturada de CaCl2 solução (372,5 g, a 20 ° C, em 500 mL de água desionizada) e 50 uL de uma solução 100 mM de 2-metilbutilo isovalerato em metanol. O 2 CaCl destina-se a actuar como um inibidor de ac enzimáticaca, que pode ocorrer após o corte e homogeneização da carne de fruta. 2-metilbutilo isovalerato é adicionado como um padrão interno para a monitorização de eventuais perdas de compostos voláteis durante o processo de homogeneização.
- Homogeneizar mistura em um misturador de laboratório (Waring, EUA), durante 30 segundos a 18.000 rpm, em seguida, imediatamente verter em frasco de vidro e de vedação com a tampa de teflon. Manter o homogeneizado no frasco à temperatura ambiente, até que todas as amostras são preparadas.
- Após o vazamento do homogenato dentro da garrafa, esperar 10 minutos para permitir a separação da espuma a partir do líquido, em seguida, de pipeta alíquotas de 5 ml de líquido, sem espuma, em 20 ml frascos de vidro âmbar e selar os frascos com tampas de rosca de aço equipado com Teflon / silicone septos. Este procedimento é adequado para a preparação melão e homogenato de pêra. Se outros frutos são usados para a análise, um passo de centrifugação pode ser necessária. Portanto, remover a espuma e, em seguida, centrifugar o líquido para partículas de aglomerados que possamobstruir a pipeta. Preparar pelo menos três frascos por amostra para servir como técnica repetições.
- Neste ponto, as amostras podem ser analisadas imediatamente ou flash-congelados em azoto líquido e armazenado a ultra-baixa temperatura (-80 ° C) para posterior análise.
- Para amostras congeladas, no dia análise remover as amostras a partir do congelador e permitir-lhes a descongelar durante uma hora à temperatura ambiente. Após descongelação, e antes da análise, substituir a tampa do frasco com um novo que tem um septo, limpo e seco. Se o septo não é substituído, a água condensada sobre o septo durante o descongelamento pode ser arrastado para o instrumento e danificá-la.
2. Gas Chromatography onda acústica de superfície (SAW-GC) Set-up e Aquisição de Dados
- Carregar o método de análise apropriado na zNose.
Para a análise do perfil de éster-rico volátil do melão, os nossos parâmetros na versão Microsense 5.44.22 software (Newbury Park, CA, EUA) são como segue: headspace de aspiração node entrada durante 20 segundos a 30 mL min -1 através da bomba; temperatura de entrada de 200 ° C; Tenax temperatura armadilha a 225 ° C, caudal de gás portador (pureza de hélio 99,999%) de 2,9 mL min-1; coluna (DB-5 coluna, 1 m × 0,25 milímetros ID programa de temperatura × 0,25 espessura da película mm) a partir de 45 ° C a 180 ° C a uma taxa de 10 ° C seg -1; válvula a 165 ° C; sensor de temperatura a 40 ° C O tempo de análise total é de 1 minuto por amostra. - Conectar uma agulha de aço inoxidável com não-coring ponta para a entrada zNose e purgar o sistema várias vezes com o ar ambiente até que a linha de base é estável e sem picos maiores do que 200 contagens (Ct) são detectados.
- Ajustar o instrumento, utilizando uma solução de alcanos de cadeia linear (C6-C14). O resultado composição é utilizada pelo software do aparelho para converter o tempo de retenção dos picos eluídos a partir de unidades de tempo em Kovats Index (Kl) unidades. Por conseguinte, depois de o sistema é sintonizado, os tempos de retenção foram apresentados em unidades de KI. Antes da análise, permitir que a amostra a equilibrar durante 30 minutos. Para analisar um dos frascos de amostra, inserir uma agulha no septo do frasco para aliviar a pressão. Em seguida, inserir a agulha ligada à entrada do instrumento para o septo do frasco e iniciar a amostragem headspace. Analise pelo menos três técnica repetições por amostra.
- Iniciar manualmente o instrumento, clicando no botão "Play", a ativação da bomba e retira os vapores apresentam acima da amostra. No final da análise, um cromatograma aparece no ecrã, e do sensor é automaticamente aquecida a 150 ° C durante 10 segundos para o limpar. Quando o sistema de botão de caixa de status fica verde novamente, o aparelho está pronto para analisar outra amostra.
- Para garantir uma base estável e limpeza adequada do sistema, executar pelo menos um em branco ar entre cada amostra. Para monitorizar a contaminação possível volátil a partir do frasco ea tampa, analisar duas frasco de espaços em branco (frasco vazio com tampa), no início e no fim do dia. </ Li>
3. Exportação de Dados e Análise
- Exportar os dados em um arquivo do Microsoft Excel após a aquisição utilizando o "Peak registro" em função Microsense software. Uma vez que os dados são exportados, adicionar colunas contendo rótulos para variáveis e repetições.
- Transformar o formato de dados para facilitar a manipulação usando o Python (versão 2.6; disponível gratuitamente on-line) script que desenvolvemos, com o nome "reform_data.py" (ver Figura 1 para um exemplo do formato de dados antes e depois de usar o script "reform_data. py "). O nome do arquivo de origem (formato xls) e nome da folha para os dados de entrada, bem como o nome do arquivo desejado para a saída (formato xls), são editados diretamente no script.
- Iniciar "kim_interface.py" (também escrito em Python 2.6, ver Figura 2), e importar os dados do arquivo gerado no passo anterior. Especificamente, a análise baseia-se na visualização e analisando o número de vezes que cada valor de Ki foi detectado("Hits KI"). Assim, o programa exibe um gráfico de barras de hits Ki para cada valor de KI.
- Avaliar os hits KI de subconjuntos específicos de amostras, analisando cada grupo de técnicos replicado em conjunto. Para isso, analisar cada tratamento ou variável separadamente, marcando / desmarcando as caixas correspondentes. Ver legenda Figura 2 para uma descrição detalhada da interface gráfica do usuário (GUI) características.
- Depois de identificar a largura de cada janela KI usando o GUI, escolher aleatoriamente alguns dos cromatogramas correspondentes em software Microsense e avaliar a sobreposição entre os picos do técnico repetições. Ver Figura 3 para um exemplo de cromatogramas sobrepostas de duas repetições técnica.
- Quando a janela do KI é individuado, utilize o recurso "mala direta" disponível na GUI para mesclar as KIs que caem na janela, para o KI mais populosa. Ao usar esse recurso, os picos marcados com um intervalo de valores Ki são consolidadas em um único rótulo KI, allowing tratar esses picos como uma única variável.
Para isso, primeiro clique no botão 'merge' para ativar o recurso e selecione o KI mais populoso como o centro da janela ao clicar na barra correspondente. Uma vez que o bar tenha sido selecionado, ele muda de cor e ficar verde. Para mesclar os KIs que caem dentro da janela para o KI selecionado, botão direito do mouse sobre as barras correspondentes, o que faz com que as barras de vermelho, enquanto uma barra azul do comprimento correspondente é adicionado no topo do KI central (veja a Figura 4 ). Depois que todos os KIs selecionados foram incorporadas ao KI central adequado, clique no botão 'Mesclar' novamente para aceitar as alterações, o que provoca o botão "Mesclar" a virar amarelo. Em caso de erros, o botão 'Separar "também está disponível. Para desinstalar, clique no botão "Separar" no GUI, então botão direito do mouse sobre a barra vermelha que você deseja desinstalar. De vermelho, a barra fica azul. Clique no botão "Separar" botão novamente para aceitar as alterações. - Se alguém tenta incorrectly mesclar dois picos em uma única amostra em um valor único KI, uma mensagem de erro será impressa. Em tais circunstâncias, verificar rigorosamente o cromatograma e redefinir a janela de KI na região.
- Depois de todas as operações de fusão foram realizados, salve o arquivo.
- Antes de prosseguir com a análise estatística, os cromatogramas do ar e espaços em branco dos frascos são analisados para monitorar possíveis contaminações. Uma vez que o KI dos picos nos espaços em branco foram identificados, subtrair a área do pico detectado no ar e / ou frasco em branco a partir da área do pico presente na amostra.
Em seguida, proceder com a análise estatística.
4. Os resultados representativos
O nariz eletrônico foi capaz de detectar diferenças nos perfis de voláteis entre melão, colhidos em diferentes estádios de maturação (Figura 5). Vinte KI janelas foram identificados em todas as amostras. Uma análise de variância mostrou que 14 picos DeteCTED pelo nariz eletrônico variou significativamente entre os estádios de maturação. Na Figura 6, o registro das áreas médias máximas de 14 componentes estes são plotados para mostrar diferenças na abundância de pico entre dois estágios de maturidade, cedo maduros e frutas maduras.
Figura 1. Exemplos de formato de dados exportados a partir de software do aparelho (A) e após a transformação, realizada utilizando script "reform_data.py" (B). Para facilitar a manipulação de dados e análise, todas as KIs únicas são identificados através de todas as amostras, então os dados são reordenadas com informação da amostra em linhas e da área do pico em colunas, correspondentes a KIs únicas. Se um pico não for detectada por um valor de Ki numa amostra, a célula correspondente permanece vazio.
Figura captura de tela 2. Do script arquivo "kim_interface.py". O enredo no centro exibe o número de visitas por KI KI contra. 'Hit por Kl' é o número de amostras em que um pico com que KI específica foi detectada. No lado esquerdo, existem três caixas amarelas que controlam os dados seleccionados. Eles exibem parâmetros para dividir o conjunto de dados (tratamentos, repetições, variáveis qualitativas, etc.) Nessa figura, eles são (de cima para baixo): variedade, data de plantio e estádio de maturação na colheita. Na parte inferior: clicando nas barras 3 e movendo-se a barra de azul para a esquerda ou para a direita, um pode seleccionar o mínimo eo valor máximo da gama de KI, ea área de pico mínima ('Limiar'). À direita: o botão "Mesclar" permite fusão KIs selecionados manualmente clicando nas barras da parcela. O botão "Separar" permite inverter o processo para casos selecionados.
Cromatogramas Figura 3. Sobrepostas (em vermelho e preto), de duas repetições técnica de headspace melão volátil para ilustrar uma mudança no tempo de retenção.
Figura 4. Exemplo de KI fusão procedimento. Na trama central, a barra verde (Central KI) representa o KI mais populosa, que foi escolhido como centro da janela KI. KI KI X e Y são KIs queda na janela de juros e elas precisam ser incorporadas ao KI central. Clicando na barra de KI X, ela torna-se vermelho e, ao mesmo tempo, uma barra azul do mesmo comprimento da barra de KI X, aparece na parte superior do um verde. Ao repetir o mesmo procedimento para KI Y, o comprimento da barra de azul (KIs Mesclados) aumentará o comprimento correspondente. Depois que todos os KIs foram adicionados, clicando no botão verde "direta", termina o processo de fusão, as alterações são salvas, e a cor do botão fica amarelo.
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Figura 5. Dois cromatogramas das amostras de melão, colhidas em diferentes estádios de maturação precoce, madura (superior) e completamente maduras (inferior), para ilustrar a capacidade do nariz electrónico para detectar diferenças na abundância voláteis.
Figura 6. Enredo Radar mostrando a área do pico de 14 componentes presentes em duas amostras de melão em dois estádios de maturação diferentes, cedo maduros e totalmente maduros. As áreas de pico são relatados em escala logarítmica para ajudar a visualizar a comparação. Os números no final de cada raio representam os Índices de Kovats correspondentes.
Discussion
Narizes eletrônicos representam um método promissor para a avaliação rápida e objetiva de perfis de aroma de frutas ou volátil ricas amostras. No entanto, se desloca em tempo de retenção representam um desafio para a identificação de pico e pode levar a erros de interpretação dos dados, quando dois cromatogramas não estão perfeitamente alinhados. A inspecção visual dos cromatogramas indicaram que a variabilidade de tempos de retenção entre as amostras frequentemente causada mesmo pico de ser rotulados com valores de Ki ligeiramente diferente (aproximadamente ± 10). Isso se traduziu em um número exagerado de KIs únicos detectados. A fim de tirar vantagem dos factos de que (a) compostos diferentes estão presentes em diferentes estádios de maturação e (b) técnico repetições são aproximadamente idênticas, dois scripts baseados em computador ("kim_merge.py", que contém as rotinas para a manipulação dos dados conjunto, e "kim_interface.py", que fornece uma interface gráfica de usuário (GUI)) foram desenvolvidos de forma sistemáticacomparar amostras de uma forma semi-automatizada, reduzindo significativamente o tempo necessário para análise cromatograma de grandes conjuntos de dados. Estes programas permitir a consolidação, se for caso disso, de picos marcados com uma gama de valores de Ki sob uma etiqueta KI único. Isso serve para duas finalidades importantes: (a) que permite uma análise estatística para tratar esses picos como uma única variável, e (b) que facilita a identificação de pico e comparação com outros sistemas e os valores publicados. Os resultados apresentados aqui indicam que as amostras de melão, puderam ser discriminados com base na maturidade e aroma utilizando o sistema de zNose em combinação com a identificação KI adequada. Isto representa uma nova tecnologia promissora para a análise de compostos voláteis que podem ser utilizados para os programas de controlo de qualidade.
Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Bill Copes (Harris Seed Company Moran, Davis) para fornecimento de frutos de melão para esta análise. Este projecto é apoiado pelo Programa de Investigação de Culturas Especialidade Initiative Grants Competitiva conceder nenhum. 2009-51181-05783 do USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | MP Biomedicals | 195088 | |
| 2-Methylbutyl isovalerate | SAFC Global | W350613 | ≥ 98%, natural, FCC |
| Methanol | Fisher Scientific | A411-4 | |
| Vial | Sigma-Aldrich | SU860098 | |
| Cap | Sigma-Aldrich | SU860101 | |
| Laboratory blender | Waring Laboratory | 7009G | 2-speed blender; 1- Liter glass container |
| Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Pyrex, 500 mL; polypropylene plug-seal |
| Needle | Electronic Sensor Technology | TLC101046 | Side hole luer |
| Alkanes solution | Electronic Sensor Technology | C6-C14 alkanes solution in methanol | |
| zNose | Electronic Sensor Technology | Model 4500 | |
| DB-5 GC column | Electronic Sensor Technology | SYS4500C5 | |
| MicroSense | Electronic Sensor Technology | Version 5.44.22 | |
| Python 2.6 | Freely available on-line | ||
| "reform_data.py" and "kim_interface.py" scripts | Scripts available as supplementary material on JoVE |
References
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