Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling af faktor V aktivitet i humant plasma ved hjælp af en Microplate koagulationsassay

Published: September 9, 2012 doi: 10.3791/3822
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science, University of Ontario Institute of Technology, 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology, 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology

Summary

Denne undersøgelse beskriver en hidtil ukendt mikroplade assay, der måler FV koagulationsaktivitet under fibrinkoagel i humant plasma, som ikke er blevet rapporteret tidligere. Fremgangsmåden anvender en kinetisk mikropladelæser kontinuerligt at måle ændringen i absorbans ved 405 nm under fibrinkoagel i humant plasma.

Abstract

Som reaktion på skade, er blodkoagulation aktiveres og resulterer i frembringelsen af ​​koagulation protease, thrombin. Thrombin spalter fibrinogen til fibrin, som danner et uopløseligt koagulat der standser blødning. Faktor V (FV) i sin aktiverede form, FVA, er en kritisk co-faktor for protease FXa og accelerator for thrombindannelse ved fibrinkoagel dannelse som en del af prothrombinase 1, 2. Manuelle FV assays er blevet beskrevet 3, 4, men de er tidsrøvende og subjektiv. Automatiserede FV assays er rapporteret 5-7, men analysatoren og reagenser er dyre og giver normalt kun clottid, ikke hastigheden og omfanget af fibrindannelse. Mikroplade platform foretrækkes til måling enzymkatalyserede hændelser på grund af bekvemmelighed, tid, omkostninger, lille volumen, kontinuerlig overvågning og højt gennemløb 8, 9. Mikroplade-assays er blevet rapporteret for clotlyse 10, blodpladeaggregering11 og koagulationsfaktorer 12, men ikke for FV-aktivitet i humant plasma. Målet med fremgangsmåden var at udvikle en mikroplade assay, der måler FV aktivitet under fibrindannelse i humant plasma.

Denne hidtil ukendte mikroplade Metoden giver en enkel, billig og hurtig analyse af FV-aktivitet i humant plasma. Assayet udnytter en kinetisk mikropladelæser at overvåge absorbansændringen ved 405 nm under fibrindannelse i humant plasma (figur 1) 13. Assayet nøjagtigt måler den tid, begyndelseshastighed, og omfanget af fibrin koageldannelsen. Det kræver kun pi mængder plasma, er komplet i 6 min, er high-throughput, er følsom over for 24-80pM FV, og måler mængden af ​​utilsigtet aktiveret (1-trins-aktivitet) og thrombin-aktiveret FV (2-trins-aktivitet ) for at opnå en fuldstændig vurdering af dens samlede funktionel aktivitet (2-fase-aktivitet - 1-trins aktivitet).

Formidlede intravascular koagulation (DIC) er en erhvervet koagulopati, der oftest udvikler sig fra allerede eksisterende infektioner 14. DIC er forbundet med en dårlig prognose og øger dødeligheden over den allerede eksisterende patologi 15. Assayet blev det vist, at hos 9 patienter med DIC, FV 1-fase 2-trins, og de samlede aktiviteter blev reduceret i gennemsnit med 54%, 44% og 42% sammenlignet med normal poolet humant henvisning plasma (NHP).

FV mikroplade-assay kan let tilpasses til måling af aktiviteten af ​​en koagulationsfaktor. Denne analyse vil øge vores forståelse af FV biokemi gennem en mere nøjagtig og fuldstændig måling af dets aktivitet inden for forskning og kliniske omgivelser. Denne information vil medvirke hospitalsmiljøer gennem tidligere diagnose og udvikling af mere effektive behandlinger for koagulationsforstyrrelser, såsom DIC.

Protocol

1. Fremstilling af FV-deficient human plasma

  1. Denne metode er en modifikation af fremgangsmåden oprindeligt beskrevet af Bloom et al 4.
  2. Opnå humant fuldblod fra en samtykkende rask voksen frivillig (Mand eller Kvinde, alder 18 - 50 år), der ikke tager nogen medicin. Bær latex-handsker og en laboratoriekittel hele proceduren.
  3. Fremstilling af 100 ml 3,2% (vægt / volumen) trinatriumcitrat i destilleret vand. Indlæse 6,0 ml af denne opløsning i separate 60 ml sprøjter. Fjerne luft ved at trykke stemplet forsigtigt til 6,0 ml mærket på sprøjten.
  4. Brug en spritserviet til at rense området for kubiske vene mellem bicep og underarm. Tilslut 20 gauge butterfly apparat til en 3 ml sprøjte. Indsæt butterfly nål i kubiske vene og trække forsigtigt på stemplet indtil blod fylder til 3 ml mærket. Sprøjten med blod. Dette trin udføres for at fjerne vævsfaktor frigivet fra beskadigede endotel på nålensskadested, som kan aktivere koagulationsprocessen og interferere med fremstillingen af ​​FV-deficient plasma.
  5. Slut butterfly nål til 60 ml sprøjte 'læsset' med 6,0 ​​ml trinatriumcitrat og trække forsigtigt på stemplet, indtil blodet når 60 ml-mærket på sprøjten. (Final citratkoncentrationen 10.9mm).
  6. Fjern sprøjten fra sommerfugl kanyle og forsigtigt blande sprøjten samtidig holde en behandsket finger eller tommelfinger på sprøjten stikkontakt.
  7. Fortsæt udtagning af blod i 60 ml sprøjter hver fyldt med 6,0 ​​ml 3,2% trinatriumcitrat som beskrevet ovenfor. Man bør foregribe genvinding af ca 50% af citratblod volumen plasma efter centrifugering, og at 50 pi FV-deficient plasma kræves per prøve i mikroplade-assay. Vores laboratorium rutinemæssigt behandler 300-420 ml citratblod ad gangen med 5-7 x 60 ml sprøjter hver med 6,0 ​​ml 3,2% trinatriumcitrat / sprøjte. Dette er tilstrækkeligt FV-deficient plasma til cirka 3.000 mikropladeassays (se nedenfor).
  8. Fjern butterfly nål fra frivilliges arm og trykke på en steril gaze pad over stedet for venepunktur i 1,0 min. Omfatte stedet for venepunktur med en steril forbinding.
  9. Centrifuger citratbehandlet blod ved 3300 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Recover øvre gul plasma lag til et plastbæger med en omrører med en plastik overførselspipetten pas på ikke at forstyrre den nederste røde og hvide blodlegemer lag.
  10. Foranstaltning mængde plasma i ml og fastholde 100 ul plasma før EDTA tilsætning på is til senere prothrombin clottid (PT) test (se nedenfor).
  11. Tilsæt langsomt solid EDTA til citratbehandlet plasma med forsigtig omrøring ved stuetemperatur for at opnå 5 mM (slutkoncentration). Når EDTA er opløst, pH indstilles til 7,0 ved dråbevis tilsætning af 1,0 M NaOH under forsigtig omrøring.
  12. Dæk bægerglasset med Saran Wrap og inkuberes i 8-10 timer uden omrøring ved 37 ° C.
  13. Hver 2 timer, inddrive 100 ulDen EDTA-behandlede plasma på is og bestemme PT ved inkubering med EDTA og sammenligne til PT for plasma før EDTA tilsætning (se ovenfor).
  14. Til PT bestemmelser. Sted aftagelige 8 brønde immunomodule strimlerne i plastik skabelon holder og indsætte i mikropladeaflæser
  15. Orient immunomodule strimler i mikropladelæser som: tom, tom, prøve, tom, tom, prøve, tomme, og tomme fra venstre mod højre i skabelonen indehaveren ret til at minimere lysspredning indblanding fra nabolandet prøve-holdige strimler. Brug også kun brønde 2-7 fra top til bund i hver 8 godt immunomodule strimmel for at minimere lysspredning interferens fra kanterne af plast skabelon holder.
  16. FV mikroplade-assay kan måle fibrinkoagel dannelse i mindst 12 forskellige prøver samtidig (6 prøver pr immunomodule strimmel over 2 immunomodule strimler).
  17. Hjælp af en multikanalpipette, 50 ul HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) tilsættes tilhver mikropladebrønd for hver prøve, der skal analyseres. Brug af en enkelt pipette, 50 ul normalt humant poolet henvisning plasma (NHP) eller plasma tilsættes før tilsætning af EDTA eller ved forskellige inkubationstider efter tilsætning af EDTA til at adskille mikropladebrønde.
  18. Hjælp af en multikanalpipette, 50 pi thromboplastin (Se nedenfor for fremstillingsmetode) tilsættes til alle mikropladebrønde med plasma, der skal analyseres. Inkuber i mikropladelæser ved 25 ° C i 1 min og programmere mikropladelæser at ryste pladen i 15-25 sekunder i 1 min inkubering.
  19. Brug af computeren forbindes med mikropladelæser, adgang Softmax Pro software mikroplade applikation. Sæt læseren til Absorbans, Bølgelængde til 405nm, mode til Kinetic, temperatur til 25 ° C, og programmere mikropladelæseren at ryste i 5 sekunder, og læs absorbansen ved 405 nm for hver 5 sek 6 min.
  20. Hjælp af en multikanalpipette, calciumchlorid tilsættes (50 ul 25 mM i destilleret vand, 2,1 mm Final koncentration) til alle de mikropladebrøndene, vent 15 sek, og tryk på 'Start' ikonet på mikropladen Softmax Pro menuen for at begynde analysen.
  21. Bestem PTS fra absorbansen mod tiden profiler i Softmax Pro som tiden til at nå halvmaksimal stigning i absorbans ved 405 nm (Midtpunktet af den sigmoidal absorbansen mod tiden afbildningen efter thromboplastin og calciumchlorid tilsætning. Se nedenfor, figur 1).
  22. Beregne FV 1-fase aktivitet fra log Clot Time (sec) mod log FV aktivitet (enheder / ml) som vist nedenfor i figur 2A. Til kvantificering formål er 1Unit af FV-aktivitet defineres som den aktivitet, der findes i 1,0 ml NHP før tilsigtet aktivering med tilsat thrombin (Se nedenfor, Undersøqelse humane plasmaprøver med FV 1-fase og 2-trins mikroplade koagulationsassay).
  23. Forberede 4.0L af 20 mM HEPES indeholdende 0,15 M NaCI i destilleret vand under forsigtig omrøring. Indstil pH til 7,4 med langsom dropwise tilsætning af 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4).
  24. Anskaf en tilstrækkelig længde af dialyse slangen og skylles grundigt med destilleret vand. Binde en knude i den ene ende af røret. Transfer EDTA behandlede plasma til dialyserør med en plastik transfer pipette til at fjerne luft, og bind en knude i den anden ende af røret.
  25. Omhyggeligt hænge EDTA-behandlede plasma i slangen i HBS under forsigtig omrøring. Dæk med Saran Wrap og dialyseres for 14-16 timer under forsigtig omrøring ved 4 ° C.
  26. Fjern forsigtigt EDTA-treated/dialyzed plasma i 3,0 ml portioner til 15,0 ml med skruelåg rør og fastholde 100 gl for PT assay af 'endelig' FV-deficient plasma på is. Gemme FV-deficient plasma i ved -80 ° C indtil anvendelse. Under de ovenfor beskrevne forudsætninger. PTS stigning fra 10 til 15 sek før EDTA Ud til 90-100 sek 8-10 timer efter EDTA tilsætning FV-deficient plasma fremstillet ved denne fremgangsmåde rutinemæssigt indeholder mindre end 0,1% af den aktive FV stede i udgangsmaterialetfrisk humant plasma.

2. Fremstilling af Thromboplastin

  1. Dialyse er nødvendigt at fjerne calcium fra dette reagens for at tillade præcis timing fibrin koageldannelsen fra tidspunktet for calciumchlorid over initiere koagulationsprocessen.
  2. Fremstilling af 100 ml og 4.0L af 20 mM HEPES og 0,15 M NaCI i destilleret vand i et plastbæger under forsigtig omrøring. Indstil pH til 7,4 med langsom dråbevis tilsætning af 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4).
  3. Tilføj 6,0 ml HBS, pH 7,4 til hvert hætteglas med thromboplastinreagens, erstatter låg, og ryst forsigtigt for at opløse. Inkuber reagens i hætteglas i 15 minutter ved stuetemperatur for at opløse tørret materiale. Ryst forsigtigt for at opløse.
  4. Skær en tilstrækkelig lang dialyserør, skylles godt med destilleret vand, og hæft den ene ende af slangen med en knude. Overførsel thromboplastin til dialyserør, fjerne luft, og hæft anden ende af slangen med en knude.
  5. Carefully hænge dialyserør i 4.0L i HBS, pH 7,4 og blidt omrøres dækket med Saran Wrap ved 4 ° C i 14-16 timer.
  6. Overfør 3,0 ml alikvoter af den dialyserede thromboplastin til 15 ml skruelåg rør og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse.

3. Forberedelse af FV 1-trins Mikropladekrav koagulationsassay Aktivitet standardkurver

  1. Tø FV-deficient plasma, NHP, og thromboplastin ved 37 ° C i 10 min. Bland forsigtigt FV-deficient plasma og thromboplastin uafhængigt overføre at adskille plast vask bakker, og inkuberes på is. Gemme NHP på is efter forsigtig blanding. Store calciumchlorid (25 mM i destilleret vand) i en separat vask bakke ved stuetemperatur.
  2. Forbered 200 pi hver af 2-gange serielle fortyndinger af NHP fra 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-fold i HBS, pH 7,4 ved anvendelse af 1,5 ml mikrocentrifugerør. Vortex brønd og inkuber på is.
  3. Anbring aftagelige 8 brønde immunomodule strimlerne til plastic skabelon holder og indsætte i mikropladelæser.
  4. Orient immunomodule strimler i mikropladelæser som: tom, tom, prøve, tom, tom, prøve, tomme, og tomme fra venstre mod højre i skabelonen indehaveren ret til at minimere lysspredning indblanding fra nabolandet prøve-holdige strimler. Brug også kun brønde 2-7 fra top til bund i hver 8 godt immunomodule strimmel for at minimere lysspredning interferens fra kanterne af plast skabelon holder.
  5. FV mikroplade-assay kan måle fibrinkoagel dannelse i mindst 12 forskellige prøver samtidig (6 prøver pr immunomodule strimmel over 2 immunomodule strimler).
  6. Tænd mikropladelæser og adgang Softmax Pro mikroplade applikationssoftware.
  7. Hjælp af en multikanalpipette, samtidige tilsætninger af FV-deficient plasma (50 ul) gør alle prøve mikropladebrønde. Bruge en enkelt pipette, tilsættes 50 pi af de 10 seriefortyndinger af NHP fremstillet ovenfor til at adskille mikropladebrønde.
  8. Ved hjælp af en multikanalpipette, thromboplastin (50 pl) tilføje til alle prøvebrønde. Inkuber i mikropladelæser ved 25 ° C i 1 min og programmere mikropladelæser at ryste pladen i 15-25 sekunder i 1 min inkubering.
  9. Brug af computeren forbindes med mikropladelæser, adgang Softmax Pro software mikroplade applikation. Indstil læseren til Absorbans, Bølgelængde til 405 nm, tilstand til Kinetic, temperaturen til 25 ° C, og programmere mikropladelæser at ryste for de første 5 sek efter calciumchlorid tilsætning og mål absorbansen ved 405 nm hvert 5. sekund i 6 minutter derefter. The 5 sek omrystning interval er ikke indeholdt i de beregnede koagulere gange (se nedenfor).
  10. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilsæt calciumchlorid (50 ul 25 mM i destilleret vand, slutkoncentration 3,5 mm) til alle prøve mikropladebrønde, vent 15 sek, skal du trykke på 'Start' ikonet i mikroplade ansøgning i Softmax Pro fra computer for at begynde assay.
  11. THan koagulere gange beregnes som den tid i sekunder, når midtvejs mellem den mindste og største absorbans ved 405 nm efter thromboplastin og calciumchlorid tilsætning.
  12. De initielle hastigheder for koageldannelse beregnes som stigningen i absorbans ved 405 nm (munits / min), der omfatter de første 5 tidspunkter af koageldannelse i den lineære del af absorbansen mod tiden kurve.
  13. Omfanget af koageldannelse blev beregnet som forskellen mellem den maksimale og minimal absorbans ved 405 nm (enheder) opnået i løbet af koageldannelse begivenhed.

4. Undersøqelse humane plasmaprøver med FV 1-trins og 2-trins Microplate koagulationsassay

  1. Tø FV-deficient plasma, NHP, prøve plasmaer, og thromboplastin ved 37 ° C i 10 min. Bland forsigtigt FV-deficient plasma og thromboplastin uafhængigt overføre at adskille plast ELISA vaske bakker, og inkuberes på is. Opbevar den nationale sundhedspolitik og prøve plasmaer på isEfter forsigtig blanding. Store calciumchlorid (25 mM i destilleret vand) i en særskilt ELISA-vask bakken ved stuetemperatur.
  2. Forbered 200 pi hver af 40-folds fortyndinger af NHP og prøve plasmaer i HBS, pH 7,4 under anvendelse af 1,5 ml mikrocentrifugerør. Vortex brønd og inkuber på is.
  3. Indsæt det flytbare 8 brønde immunomodule strips i plastik skabelon holder og indsætte i mikropladelæser.
  4. Alternativ tom, tom, prøve, tom, tom, prøve, tomme, og tom immunomodule strips fra venstre mod højre i skabelonen indehaveren ret til at minimere lysspredning indblanding fra nabolandet prøve-holdige strimler. Brug kun brønde 2-7 fra top til bund i hver immunomodule strimmel for at minimere lysspredning interferens fra kanterne af plast template holder.
  5. Tænd mikropladelæser og adgang Softmax Pro mikroplade applikationssoftware.
  6. Hjælp af en multikanalpipette, FV-deficient plasma (50 ul) tilsættes til alle prøve mikropladebrønde. Under anvendelse af en single pipette tilsættes 50 ul 40 gange fortyndet NHP eller prøve plasmaer fremstillet ovenfor til at adskille mikropladebrønde.
  7. Ved hjælp af en multikanalpipette, thromboplastin (50 pl) tilføje til alle prøvebrønde. Inkuber i mikropladelæser ved 25 ° C i 1 min og programmere mikropladelæser at ryste pladen i 15-25 sekunder i 1 min inkubering.
  8. Brug af computeren forbindes med mikropladelæser, adgang Softmax Pro software mikroplade applikation. Indstil læseren til Absorbans, Bølgelængde til 405 nm, tilstand til Kinetic, temperaturen til 25 ° C, og programmere mikropladelæser at ryste for de første 5 sek efter calciumchlorid tilsætning og mål absorbansen ved 405 nm hvert 5. sekund i 6 minutter derefter. The 5 sek omrystning interval er ikke indeholdt i de beregnede koagulere gange (se nedenfor).
  9. Hjælp af en multikanalpipette, tilsættes calciumchlorid (50 ul 25 mM i destilleret vand, 6.25mM slutkoncentration) til alle prøve mikropladebrønde og straks prESS 'Start' ikonet i mikroplade ansøgning i Softmax Pro fra computer for at begynde analysen.
  10. Ved afslutningen af ​​kørslen bestemme tid, begyndelseshastighed, og omfanget af koageldannelse i 40 gange fortyndet NHP og prøve plasmaer fra absorbansen mod tiden profiler i Softmax Pro.
  11. Under hensyntagen til 40-gange fortynding, så brug clottid for hver prøve for at beregne FV aktivitet i enheder / ml fra FV 1-fase-aktivitet standardkurve for Log Clot Time vs Log FV aktivitet (figur 2A). Dette repræsenterer FV-1 trin aktivitet eller at uden »frivillig« aktivering af thrombin.
  12. Da FV aktiveres med thrombin til den aktive cofaktor, FVA 1, et andet assay efter tilsætning og inkubering med thrombin er kritisk for nøjagtig måling af FV 2-trins aktivitet af en plasmaprøve (Med "tilsigtet" aktivering ved tilsat thrombin).
  13. For FV 2-trins assay, forberede 200-300 ul renset thrombin 18 at 100 nM i HBS, pH 7,4 og inkuberes på is. Planlægger at bruge 10 ul fortyndet thrombin for hver plasmaprøve, der skal analyseres med FV 2-trins assay.
  14. Fortynd 120 pi af ovenstående NHP og prøve plasmaer fra 40 gange til 100 gange med 170 ul HBS, pH 7,4 indeholdende 2,8 mm calciumchlorid. Der tilsættes 10 ul thrombin (10 nM slutkoncentration) til hver prøve. Vortex godt at blande og inkubere ved 37 ° C i 1 min.
  15. Fortynd NHP og prøve plasmaer til 500 gange ved tilsætning af 400 pi HBS, pH 7,4, vortex godt, og assay 50 ul af hver plasmaprøve i FV 1-fase mikroplade-assay som beskrevet ovenfor.
  16. Bestem den clottid for NHP og hver plasmaprøve analyseret fra absorbansen mod tiden profiler i Softmax Pro. Under hensyntagen til 500 ganges fortynding, så brug clottid for hver prøve for at beregne FV 2-trins-aktivitet fra FV 1-fase standardkurve for Log Clot Time vs Log FV aktivitet (figur 2A).
  17. Den samlede FV aktivity kan derefter beregnes som FV 2-trins-aktivitet - FV 1-fase-aktivitet.

Representative Results

Repræsentative resultater - Forberedelse af FV 1-trins mikroplade koagulationsassay aktivitet standardkurver

Et repræsentativt eksempel på fibrinkoagel dannelse i FV assayet over tid genereres af mikropladelæser er illustreret i figur 1.. FV assay nøjagtigt måler den tid, begyndelseshastighed, og omfanget af fibrin koageldannelsen. Inspektion af brøndene ved assay afsluttet bekræftede, at koagulatdannelse forekom. Alle reaktioner nåede omtrent samme grad af koageldannelse med en generel ændring i absorbans ved 405 nm af fra 0,35 til 0,45 enheder mellem udgangsmaterialet absorbansen før og maksimal absorbans efter thromboplastin og calciumchlorid tilsætning. Repræsentative eksempler på FV 1-trins aktivitet standardkurver af Log Clot tid (i sekunder) vs Log FV Aktivitet (enheder / ml) og log oprindelige sats på blodpropper (i munits / min) vs Log FV Aktivitet (enheder / ml ) for seriefortyndinger af NHP vist i figur 2B. Montering af log-log plot af Clot Time vs FV 1-aktivitet indikerede en stærk sammenhæng mellem disse variabler efter lineær regressionsanalyse (figur 2A; R 2 = 0,980). Montering af log-log plot af den oprindelige sats af koageldannelse vs FV Activity også indikeret en stærk sammenhæng mellem disse variabler efter lineær regressionsanalyse (figur 2B, R 2 = 0,983). Forholdet mellem begge Log Clot Tid og Log oprindelige sats på koageldannelse vs Log FV aktivitet forblev lineær for NHP fortyndet op til 512-fold. Siden FV cirkulerer i NHP på ca 12-40nm 16, mikroplade analysen er følsom til ca 24-80pM FV i NHP. Da dissociationskonstanten af interaktionen af FVA-FXa-lipid i prothrombinase er ca 1 nM 17, FV mikroplade-assay er helt velegnet til måling af FV niveauer i fysiologisk relevant nM interval for FVA funktion i prothrombinase.

Brug af FV mikroplade assay, blev det også bestemt, at det normale spektrum af FV aktivitet i FV 1-trins aktivitet assay på 15 raske kontrolpersoner plasmaer (Mand og Kvinde, Age 18-20yrs) var (gennemsnit ± standardafvigelse, Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Dette stemmer godt overens med normal, sund FV aktivitet og rækkevidde (0.66-1.14U/ml) rapporteret af Cutler et al. for FV 1-fase aktivitet bestemmes med en automatisk analysator 7. The intra-assay variationen af ​​den tid, omfang og indledende hastighed af koageldannelse i FV 1-fase assay på 6 brønde på 8 forskellige dage var 3,4%, 4,4% og 3,1% henholdsvis. The inter-assay variation af tiden, omfang og indledende hastighed af koageldannelse i FV 1-fase-assay i 6 brønde i 8 forskellige eksperimenter på 8 forskellige dage var 7,1%, 7,8% og 9,2% henholdsvis. Således den intra-og inter-assay variationen af ​​disse tre measurøde variabler var på et lavt og acceptabelt niveau for robust analysens ydeevne inden for og mellem mikroplade assay af flere prøver samtidig (op til 12).

Repræsentative resultater - Undersøqelse humane plasmaprøver med FV 1-trins og 2-trins mikroplade koagulationsassay

Standardkurven for Log Clot Time vs Log FV aktivitet (figur 2A) blev anvendt til at måle FV aktivitet i NHP og 9 DIC patientplasmaer der blev ikke bevidst aktiveret med tilsat thrombin (FV 1-fase-aktivitet) eller var forsætligt aktiveret med tilsat thrombin (FV 2-trins-aktivitet), og resultaterne er vist i tabel 1.. Alle 9 DIC patientplasmaer udviste FV 1-trins aktiviteter og indledende satser for koageldannelse der blev faldt i gennemsnit med 54% og 18%, henholdsvis fra NHP. De omfang af koageldannelse i FV 1-trins assay i de DIC patienter var ikke i vid udstrækning afviger fra NHP, og steg i gennemsnit med 13% fra NHP.

Aktivering af NHP med thrombin genereret en omtrentlig 8 gange stigning i FV 2-trins-aktivitet over FV 1-fase (tabel 1). Dette indikerer, at FV i NHP hovedsagelig var til stede i sin ikke-aktiverede form, og er enig med de tidligere rapporterede resultater ved hjælp af manuelle tilt-rør FV assays 3, 4 og automatiserede FV assays 5-7. FV 2-trins og samlede aktivitet faldt ligeledes i de DIC patienter i gennemsnit, henholdsvis 44% og 42%, henholdsvis fra NHP. De initielle hastigheder og omfang af koageldannelse i FV 2-trins-assay i DIC patienter var ikke signifikant forskellige fra NHP, og varierede i gennemsnit med ca 9% og 4%, henholdsvis fra der blev observeret med NHP. Disse resultater viste, at sammenlignet med FV i NHP, FV i DIC patientplasmaer resulterede i en længere tid og faldt hastigheden af ​​fibrinkoagel dannelse og at patienten FV var i gennemsnit kun 56% aktiverbare med thrombin også.

ent "fo: keep-together.within-page =" altid "> Figur 1
Figur 1. Koagulatdannelse i normalt poolet humant henvisning plasma målt med den kinetiske mikroplade FV 1-trins koagulationsassay. Fibrinkoagel dannelse i NHP blev overvåget kontinuert ved 405 nm under anvendelse af en kinetisk mikropladelæser. Plottet er mikropladelæser produktionen af ​​en 6 min omsætning af 32-gange fortyndet NHP, FV-deficient plasma, tromboplastin, og calciumchlorid i en mikropladebrønd. Den lodrette akse repræsenterer ændringen i absorbans ved 405 nm, der opstod som følge af fibrindannelse i plasma. Tidspunktet for fibrindannelse blev defineret som tiden til at nå halvmaksimal stigning i absorbans eller midtpunktet af kurven (36,40 sek). Den indledende hastighed for koageldannelse blev defineret som graden af ​​ændring i absorbans ved 405 nm i løbet af de første 5 tidspunkter af den lineære stigning i absorbansen del af kurven (611,88 munits / min). The extelt af koageldannelse blev defineret som forskellen mellem den største og mindste absorbans ved 405 nm (0,35 enheder).

Figur 2
Figur 2. Standardkurver af tid og indledende hastighed af koageldannelse vs faktor V-aktivitet i normalt poolet humant henvisning plasma ved hjælp af FV 1-fase mikroplade assay. NHP blev seriefortyndet (0 - til 512-fold i HBS) og analyseret med FV 1-fase mikroplade-assay som beskrevet i protokollen. Log-log plots af den tid og den indledende hastighed af koageldannelse vs FV aktivitet i FV 1-fase mikroplade-assay er vist efter lineær regression modellering af dataene i panel A og B, hhv.

1-fase assay Initial Rate (munits / min)
Prøve 1-fase assay aktivitet (enheder / ml) 1-trins assay Omfang (Units) 2-trins-assay aktivitet (enheder / ml) 2-trins-assay Omfang (Units) 2-trins assay Initial Rate (munits / min) Samlede aktivitet (enheder / ml)
NHP 1,02 0,363 744,96 7,93 0,433 375,84 6,91
Patient 1 0,36 0,404 583,80 3,84 0,432 249,96 3,48
Patient 2 0,67 0,416 704,04 5,28 0,469 323,16 4,61
0,31 0,435 562,08 3,92 0,453 294,96 3,61
Patient 4 0,39 0,435 617,04 4,14 0,462 372,60 3,75
Patient 5 0,73 0,401 641,40 5,91 0,433 354,24 5,18
Patient 6 0,45 0,403 600,72 4,16 0,445 393,96 3,71
Patient 7 0,49 0,395 575,40 4,89 0,449 357,48 4,40
Patient 8 0,19 0,448 489,00 2,89 0,450 330,48 2,70
Patient 9 0,64 0,423 699,48 5,11 0,455 417,24 4,47

Tabel 1 FV aktivitet i NHP og 9 patienter, der udviklede dissemineret intravaskulær koagulation (DIC). FV 1-fase 2-trins, og total aktivitet i NHP og 9 DIC patientplasmaer blev bestemt ud fra FV 1-fase mikroplade-assay standard kurve over tid af koageldannelse vs FV-aktivitet (figur 2A) og er angivet i enheder / ml. De indledende satser (Initial stigningstakt i A405nm forhold fem første tidspunkter i munits / min) og omfang (Maximum A405nm - Minimum A405 nm) af koageldannelse i FV 1 - og 2-trins mikroplade-assay er også vist.

Discussion

Den kinetiske mikroplade assayfremgangsmåde beskriver udviklingen af ​​en hidtil ukendt, hurtig, billig og bekvem teknik til måling af FV koagulationsaktivitet i prøver af humant plasma, der ikke (FV 1-trins-assay) eller forsætligt er aktiveret med tilsat thrombin (FV 2-trins-assay). Assayet udnytter en kinetisk mikropladelæser, og alle materialer og reagenser, der er nødvendige er kommercielt tilgængelige eller kan fremstilles in-house. Assayet overvåger ændringen i lysspredning af plasma under fibrinkoagel dannelse ved 405 nm. Mikroplade assay har fordelen ved at bruge små plasma prøvevolumener (pi), og er anvendelig til analyse af multiple prøver samtidigt (op til 12). Disse assay-egenskaber er fordelagtige, når dyrt udstyr og reagenser anvendes (automatiske analyseindretninger og faktor-deficiente plasmaer) kun små prøvevolumener er tilgængelige (patientplasmaer) eller analyse af et stort antal prøver (I FV oprensning from plasma).

FV mikroplade-assay har den yderligere fordel, at den er bekvem, hurtig og kræver ikke isolering og oprensning af de krævede indgående komponenter. Sammenlignet med manuel tilt-rør 3, 4 og automatiserede 5-7 FV assays der er blevet rapporteret, har FV mikroplade assay sammenlignelig række nyttige blodprop gange (25-75 sek) og tilsvarende FV niveauer i stikprøven (0,5-0,005 enheder / ml) og følsomhed / detektionsgrænser (20-80pM). Sammenlignet med manuelle tilt-rør FV assays, der lider af en subjektiv visuel bedømmelse af koageldannelse 3, 4, tillader FV mikroplade-assay objektiv og kvantitativ måling af clottid, begyndelseshastighed, og omfanget af fibrin koageldannelsen. Sammenlignet med automatiserede FV assays, der lider af kravet om dyre analysatorer og reagenser 5-7, Fv mikroplatte assayreagenser og materialer er billige og alle de nødvendige materialer kan være opkøberesed kommercielt eller fremstillet in-house. Manuel tilt-rør 3, 4 og automatiserede 5-7 FV assays generelt kun give tid til koageldannelse, ikke tid, begyndelseshastighed, og omfanget af fibrin koageldannelse, som alle er nøjagtigt målt spektrofotometrisk med FV mikroplade-assay. Endelig manuelle tilt-rør 3,4 og automatiseret 5-7 FV assays lider kun at kunne måle FV-aktivitet i plasmaprøver en ad gangen, mens FV mikroplade-assay kan underkastes high-throughput og 12 prøver kan være analyseres samtidigt.

Mikroplade-assay blev anvendt til at påvise, at FV i 9 DIC patientplasmaer var mindre aktiv end i NHP på grund af en kombination af forsinkede koagulere tider og lavere indledende rater af koageldannelse i FV 1-trins assay. De initielle hastigheder af koageldannelse i FV 2-trins-assay i DIC patientplasmaer ikke blev ændret fra NHP. De omfang af koageldannelse i DIC patient plasma blev heller ikke ændret fra NHP i FV 1-trins og 2-trins-analyser. Nedsat FV 1-fase, 2-trins, og samlede aktiviteter kan have været på grund af øget FV forbrug 19 og / eller inaktivering 6 i overensstemmelse med andre undersøgelser i løbet af patogenesen af denne erhvervede blodsygdom. Betragtning af omfanget af koageldannelse i DIC plasmaer var det samme som iagttaget med NHP, var denne variabel mest sandsynligt et resultat af fibrinogenkoncentration i FV-deficient plasma og ikke relateret til karakteristika for de patientplasmaer.

Resultaterne fra mikroplade-assay indikerede, at målingen af ​​FV-aktivitet i prøver af humant plasma kan opnås fra den tid og den indledende hastighed af koageldannelse fra FV 1-fase-assay og tiden for koageldannelse og total aktivitet fra FV 2 - fase assay. Det var ikke muligt at opnå kvantitativ måling af FV aktivitet i en plasmaprøve baseret på omfanget af dannelse af koagulat hos tHan FV 1 - og 2-trins-assays eller den indledende grad af koageldannelse i FV 2-trins assay. Tillægges alle reaktioner nåede omtrent samme omfang af koageldannelse på fra 0,35 til 0,45 enheder mellem den oprindelige absorbans før og maksimal absorbans efter thromboplastin og calciumchlorid kommer, at måling af omfanget af koageldannelse ikke tilvejebringe en kvantitativ vurdering af FV aktivitet i en given plasmaprøve.

Den hidtil ukendte mikroplade-assay vil finde anvendelse inden for forskning og kliniske omgivelser til måling af FV-aktivitet i prøver af humant plasma og fraktioner under dets oprensning fra menneskers og dyrs plasma. Mikroplade assay kan anvendes til at måle den tid, begyndelseshastighed, og omfanget af koageldannelse; parametre generelt ikke overvåges samtidig i manuelle tilt-tube assays og automatiske koagulation analysatorer. Denne information giver mere af en fuldstændig kvantitativ vurdering af inddragelse af FV under koageldannelse begivenhedi humant plasma end tidligere rapporteret 3-7. Denne information er især vigtigt inden for både forskning og kliniske laboratorier ved måling af væsentlige ændringer i FV-aktivitet i prøver af plasma eller med renset FV eller FVA. FV mikroplade-assay kan også anvendes til at karakterisere og måle forbindelser, som kan aktivere eller inaktivere FV og FVA, måle FV-aktivitet hos patienter med risiko for venøs thrombose som følge af FV Leiden mutation 20, 21 og til at overvåge aktiviteten af FV under dets oprensning fra plasma.

FV mikroplade-assay kan let tilpasses til måling af aktiviteten af ​​en koagulationsfaktor i den ydre, indre eller fælles pathway anvendelse af det passende faktor-deficient plasma og initiere reagenser til fibrindannelse. Analysen vil øge vores forståelse af FV biokemi gennem en mere nøjagtig og fuldstændig måling af dets aktivitet inden for forskning og kliniske laboratorier. Ultimately, vil disse oplysninger positiv indflydelse hospitalsmiljøer gennem tidligere diagnose og udvikling af mere effektive behandlinger for personer ramt af koagulationsforstyrrelser, såsom DIC.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forskningen blev støttet med faglig udvikling og forskning Startup fondene fra The University of Ontario Institute of Technology (UOIT) til Dr. John A. Samis og en canadisk Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award til Irina Levit. Forfatterne anerkender Shannon Everett (Undervisning og Learning Centre, UOIT) for hendes assistance forberede videoen. Forfatterne erkender Dr. Michael E. Nesheim (Institut for Biokemi, Dronningens University, Kingston, ON) for hans mentorskab, indsigt og personer diskussioner. Forfatterne også erkende Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hæmostase og Trombose Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK) for at tilvejebringe de DIC patientplasmaer anvendt i undersøgelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Tags

Immunology faktor V Microplate koagulationsassay Human plasma dissemineret intravaskulær koagulation (DIC) blodpropper
Måling af faktor V aktivitet i humant plasma ved hjælp af en Microplate koagulationsassay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A.… More

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter