Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

Published: September 9, 2012 doi: 10.3791/3822
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science, University of Ontario Institute of Technology, 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology, 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology

Summary

이 연구는 이전에보고되지 않은 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 FV 응고 활동을 측정하는 새로운 microplate 분석에 대해 설명합니다. 방법은 지속적으로 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 405nm에서 흡광도의 변화를 측정 할 수있는 운동 microplate 리더를 사용합니다.

Abstract

부상에 대응하여, 혈액 응고가 활성화하고 혈액 응고 단백 분해 효소, 트롬빈​​의 생성의 결과입니다. 섬유소로 트롬빈 cleaves의 피브리노겐 이는 출혈을 중지 불용성 응고를 형성한다. 의 활성 형태, FVa에서 요소 V (FV)는 prothrombinase 1, 2의 일부로 섬유소 응고 형성시 트롬빈 생성의 단백 분해 효소 FXa과 가속을위한 중요한 cofactor이다. 수동 FV의 assays는 3, 4 설명 된 있지만 시간이 소요 및 주관적입니다. 자동 FV의 assays는 5-7보고 있지만 분석기 및 시약 비싼 일반적으로는 응고 시간,하지 섬유소 형성의 속도와 범위를 제공합니다되었습니다. microplate 플랫폼 때문에 편리 효소 촉매 이벤트를 측정하는 것이 바람직하다, 시간, 비용, 작은 볼륨, 지속적인 모니터링, 9, 8 높은 처리량. Microplate의 assays는 응고의 용해 10, 혈소판 응집에 대해보고 된11 및 응고 요인 12,하지만 인간의 플라즈마에 FV 활동에 대한. 방법의 목적은 인간의 플라즈마에서 피브린 형성하는 동안 FV 활동을 측정 microplate 분석을 개발하는 것이 었습니다.

이 소설 microplate 방법은 인간의 플라즈마에 FV 활동의 간단 저렴하고 빠른 분석을 설명합니다. 검정은 인간의 플라즈마에서 피브린 형성 (그림 1) 13시 405nm에서 흡광도의 변화를 모니터링하는 운동 microplate 리더를 활용합니다. 검정 정확하게 시간, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 측정합니다. 그것은 플라즈마 만 μl 양을 필요로 6 분에 완료, 높은 처리량이, 24 80pM FV에 민감하며,의 양을 측정 실수로 활성화 (1 단계 활동)과 트롬빈 활성화 FV (2 단계 활동 1 단계 활동) -)의 총 기능 활동의 전체 평가 (2 단계 활동을 구하십시오.

전파 intravascular 응고 (DIC)가 가장 많이 기존의 감염을 14 일부터 개발 획득 coagulopathy입니다. DIC는 기존의 병리 15 위 가난한 예후 (豫后)와 증가 사망률과 연결되어 있습니다. 검정은 DIC, FV 1 단계, 2 단계 및 총 활동 9 환자 일반 풀링 된 인간에 비해 각각 54 %, 44%, 42 %의 평균에 감소 된 것을 보여주기 위해 사용되었다 참조 플라즈마 (NHP).

FV microplate 분석은 응고 인자의 활동을 측정 할 쉽게 적응합니다. 이 분석은 연구 및 임상 설정에서의 활동의보다 정확하고 완벽한 측정을 통해 FV 생화학 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다. 이 정보는 긍정적 이전에 진단 및 DIC와 같은 응고 장애에 대한 더 효과적인 치료법의 개발을 통해 의료 환경에 영향을 미칠 것입니다.

Protocol

1. FV-부족한 인간 플라즈마의 작성

  1. 이 방법은 원래 블룸 외 4에 기술 된 절차의 수정입니다.
  2. 어떤 약을 복용하지 않습니다 - 동의 건강한 성인 자원 봉사자 (50 세 남성 또는 여성, 18 세)에서 전체 인간의 피를 구합니다. 라텍스 장갑과 절차를 통해 실험실 코트를 착용하십시오.
  3. 3.2 % (w / V) 증류수에 trisodium의 구연산의 100 ML을 준비합니다. 별도의 60 ML의 주사기에이 솔루션의 6.0 ML를로드합니다. 조심스럽게 주사기에 6.0 ML 마크에 대한 우울한 플런저에 의해 공기를 제거합니다.
  4. bicep와 팔 사이 cubital 정맥의 장소를 청소하기 위해 알코올 면봉을 사용합니다. 3 ML의 주사기 20 게이지 나비 장치를 연결합니다. cubital 정맥에 나비 바늘을 삽입하고 혈액은 3 ML 마크에 가득 할 때까지 플런저를 부드럽게립니다. 피를 주사기를 폐기하십시오. 이 단계는 바늘에 손상된 내피에서 출시 조직의 요소를 제거하는 수행됩니다응고 과정을 활성화하고 FV-결함 플라즈마의 준비를 방해 할 수 있습니다 부상 사이트입니다.
  5. 나비 바늘 60 ML의 주사기와 '로드'6.0 ML trisodium의 구연산으로 연결하고 피가 주사기에 60 ML에 도달 할 때까지 플런저를 부드럽게립니다. (최종 구연산 농도 10.9mM).
  6. 나비 바늘에서 주사기를 제거하고 주사기 콘센트에 장갑 낀 손가락 또는 엄지 손가락을 유지하면서 부드럽게 주사기를 섞는다.
  7. 60 ML 주사기 위에서 설명한대로 3.2 % trisodium의 구연산의 6.0 ML로 가득 각각에 혈액을 그리기 계속합니다. 하나는 원심 분리 후와 FV-결함 플라즈마의 50 μl가 microplate 분석에서 샘플 당되는 플라즈마로 citrated 혈액 양의 약 50 % 회복을 예상해야합니다. 저희 연구실은 정기적으로 3.2 % trisodium의 구연산 / 주사기의 6.0 ML로 5-7 X 60 ML의 주사기 각을 사용하여 한 번에 citrated 혈액 300-420 ML을 처리합니다. 이 약 3,000 마이크로에 대한 충분한 FV-결함 플라즈마입니다판 assays (아래 참조).
  8. 자원 봉사의 팔에서 나비 바늘을 제거하고 1.0 분 동안 정맥 주사의 사이트를 통해 멸균 거즈 패드를 누르십시오. 멸균 붕대로 정맥 주사의 사이트를 다룹니다.
  9. 실온에서 20 분에 3,300 XG에서 citrated 혈액을 원심 분리기. 하단 빨간색과 흰색 혈액 세포 레이어를 방해하지 돌봐 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 저어 바있는 플라스틱 비커에 상단 노란색 플라즈마 층을 복구 할 수 있습니다.
  10. 측정 ML의 플라즈마의 볼륨과 미래 프로트롬빈 응고 시간 (PT) 테스트 (아래 참조)를 얼음에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가하기 전에 플라즈마의 100 μl을 유지합니다.
  11. 천천히 5mM 달성하기 위해 실온에서 부드럽게 저어을 citrated 플라즈마에 고체 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 (최종 농도). EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)가 해산되면, 부드러운 감동과 1.0M NaOH의 dropwise 추가하여 7.0으로 산도를 조정합니다.
  12. 37 교반하지 않고 8-10 시간에 비닐 랩 및 배양과 비커를 커버 ° C.
  13. 모든 2 시간은 100 μl를 복구EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 취급 얼음에 플라즈마하고 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화시 태평양 표준시를 결정하는 사​​전 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 추가 (위 참조)에 플라즈마의 태평양 표준시에 비교합니다.
  14. 태평양 표준시의 결정에 대해, microplate 리더로 ​​플라스틱 템플릿 홀더와 인서트로 대신 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립.
  15. 등의 microplate 리더의 동양의 immunomodule 스트립 : 빈, 비어있는, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 샘플이 포함 된 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 빈, 그리고 왼쪽에서 템플릿 홀더의 오른쪽에있는 빈. 또한, 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 8 잘 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다.
  16. FV microplate 분석 동시에 12 개 이상의 서로 다른 샘플 (2 immunomodule 스트립 이상 immunomodule 스트립 당 6 샘플)에서 섬유소 응고 형성을 측정 할 수 있습니다.
  17. 멀티 채널 피펫 사용에 HBS의 50 μl를 (20mM HEPES, 150mM NaCl, 산도 7.4) 추가각 microplate 잘 샘플의 각 assayed되어 있어야합니다. 하나의 피펫 사용하여 microplate 우물을 분리 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 한 후 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또한 전이나 다양한 배양 시간에 정상적인 인간 풀링 참조 플라즈마 (NHP) 또는 플라즈마의 50 μl를 추가합니다.
  18. 멀티 채널 피펫 사용 assayed 할 플라즈마를 사용하는 모든 microplate 우물 50 μl thromboplastin을 (준비 방법은 아래를 참조)를 추가합니다. 1 분 및 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 수있는 프로그램 microplate 리더에 대해 25 ° C에서 microplate 리더에 품다.
  19. microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm에 파장, 키네틱, 온도 모드 25 ° C 및 프로그램 microplate 리더는 5 초에 흔들, 6 분 동안 매 5 초 405nm에서 흡광도를 읽어.에 독자를 설정
  20. 2.1mM 에서야, 멀티 채널 피펫 사용 (증류수에 25mM의 50 μl 염화칼슘을 추가난 농도)는 microplate 우물의 모든 15 초를 기다린 분석을 시작하기 위해 microplate SoftMax 프로 메뉴에서 '시작'아이콘을 누릅니다.
  21. 시간이 405nm에서 흡광도의 반 최대 증가 (thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 한 후에 생산 sigmoidal 흡광도 대 시간 곡선의 중간 지점. 아래를 참조를 도달하기로 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 포인트를 결정 그림 1).
  22. 그림 2A에 아래 그림과 같이 로그 응고 시간 (초) 대 로그 FV 활동 (단위 / ML)에서 FV 1 단계 활동을 계산할 수 있습니다. quantitation를 위해, FV 활동 1Unit는 사전 추가 트롬빈 (FV 1 단계 및 2 단계 microplate 응고 분석과 인간의 플라즈마 샘플을 시금 아래 참조) 의도적 활성화에 1.0 ML NHP의 활동 선물로 정의됩니다.
  23. 부드러운 저어와 증류수에 0.15M NaCl을 포함하는 20mM HEPES의 4.0l를 준비합니다. 속도가 느린 dropw과 7.4로 pH를 조정5.0M NaOH의 이세 추가 (HBS, 산도 7.4).
  24. 투석 튜브의 충분한 길이를 확보하고 증류수로 철저히 씻어. 튜브의 한쪽 끝에서 매듭을 묶게. 전송 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)는 플라스틱 전송 피펫으로 투석 튜브에 플라즈마를 처리, 공기를 제거하고 튜브의 다른 쪽 끝에서 매듭을 묶게.
  25. 조심스럽게 부드러운 저어와 HBS에 튜브에서 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 처리 플라즈마을 설치하면 되요. 비닐 랩으로 덮어, 4 ° C.에 부드럽게 저어와 14-16h에 대한 dialyze
  26. 주의 깊게 15.0 ML 나사 덮인 관에 3.0 ML의 aliquots에 EDTA-treated/dialyzed 플라즈마를 제거하고 얼음에서 '최종'FV-결함 플라즈마의 태평양 표준시 분석 100 μl을 유지합니다. -80 ° C에서 사용까지의 FV-결함 플라즈마를 저장합니다. 위에 설명 된 조건 하에서, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가 한 후 90-100 초 8-10 시간에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가하기 전에 10-15 초에서 포인트 증가. 이 방법으로 준비 FV-결함 플라즈마는 정기적으로 시작의 활성 FV 존재 미만 0.1 %를 포함신선한 인간의 플라즈마.

2. Thromboplastin의 작성

  1. 투석은 응고 과정을 시작하려면 칼슘 염화물 추가의 시간에서 정확하게 타이밍 섬유소 응고 형성을 허용하기 위해이 시약의 모든 칼슘을 제거해야합니다.
  2. 부드러운 저어와 플라스틱 비커에 증류수에 100 ML와 4.0l 20mM HEPES와 0.15M NaCl을 준비합니다. 5.0M NaOH (HBS, 산도 7.4)의 느린 dropwise 추가로 7.4로 산도를 조정합니다.
  3. thromboplastin 시약의 각 유리 병에 HBS, 산도 7.4의 6.0 ML를 추가 뚜껑을 교체하고, 분해하고 부드럽게 흔들. 말린 재료를 해산하기 위해 상온에서 15 분에 덮힌 시험관에 시약을 품다. 완전히 용해에 부드럽게 흔들어.
  4. , 투석 튜브의 충분한 길이를 잘라 증류수에 잘 헹구고, 매듭과 튜브의 한쪽 끝을 묶어. 투석 튜브에 thromboplastin을 전송, 공기를 제거하고 매듭과 튜브의 다른 쪽 끝을 묶을.
  5. 칼슘refully HBS, 산도 7.4의 4.0l에 투석 튜브를 다짐하고 부드럽게 14-16 시간에 대해 4 ° C에서 비닐 랩으로 덮여 젓는다.
  6. 사용 ° C까지 -80에서 15 ML 나사 덮인 튜브 및 저장소에 dialyzed thromboplastin의 3.0 ML의 aliquots를 전송합니다.

3. FV의 준비 1 단계 Microplate 응고 분석 활동 표준 곡선

  1. 10 분 동안 37 ° C에서 FV-결함 플라즈마, NHP, 그리고 thromboplastin을 해동. 부드럽게, 독립적 FV-결함 플라즈마 및 thromboplastin를 섞어 플라스틱 세탁기 트레이를 분리 전송하고 얼음에 품다. 부드럽게 혼합 한 후 얼음에 NHP를 저장합니다. 실온에서 별도의 세척 작업 표시 줄의 저장 염화칼슘 (증류수에 25mM).
  2. , 2 - - 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256-200 μl 0에서 NHP의 2 배 시리얼 dilutions의 각 준비, HBS의 512 배, 산도 7.4 1.5을 사용하여 ML의 microcentrifuge 튜브. 잘 와동과 얼음을 품다.
  3. P에 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립을 삽입합니다microplate 리더로 ​​lastic 템플릿 홀더와 삽입합니다.
  4. 등의 microplate 리더의 동양의 immunomodule 스트립 : 빈, 비어있는, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 샘플이 포함 된 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 빈, 그리고 왼쪽에서 템플릿 홀더의 오른쪽에있는 빈. 또한, 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 8 잘 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다.
  5. FV microplate 분석 동시에 12 개 이상의 서로 다른 샘플 (2 immunomodule 스트립 이상 immunomodule 스트립 당 6 샘플)에서 섬유소 응고 형성을 측정 할 수 있습니다.
  6. microplate 리더 및 액세스 SoftMax 프로 microplate 응용 프로그램 소프트웨어를 사용합니다.
  7. 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 microplate 우물에 FV-결함 플라즈마 (50 μl)의 동시 추가를합니다. microplate 우물을 분리하려면 위의 준비 NHP의 10 시리얼 dilutions의 50 μl를 추가 한 피펫을 사용합니다.
  8. 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 우물에 thromboplastin을 (50 μl)를 추가합니다. 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 1 분 및 프로그램 microplate 리더에 대한 25 microplate 리더 ° C에서 알을 품다.
  9. microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm로 파장, 키네틱, 25에 온도 ° 이후 6 분마다 5 초 405nm에서 C, 그리고 칼슘 염화물 추가 한 후 처음 5 초에 대항 할 프로그램 microplate 리더 및 측정 흡광도.에 모드로 독자를 설정 5 초 진동 간격은 (아래) 계산 된 응고 시간에 포함되지 않습니다.
  10. 채널 피펫을 사용하여 염화칼슘 (증류수에 25mM의 50 μl, 최종 농도 3.5mM)을 추가하는 샘플 microplate 우물까지를 시작하려면 컴퓨터에서 15 초, 보도 SoftMax Pro의 microplate 응용 프로그램에서 '시작'아이콘을 기다리 검정.
  11. 티그는 응고 시간은 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 한 후에 405nm에서 최소 및 최대 흡광도 사이의 중간 지점에 도달하는 시간 (초)의 시간으로 계산됩니다.
  12. 응고 형성의 초기 속도는 흡광도 대 시간 곡선의 선형 부분에 응고 형성의 첫 5 번 포인트를 포함 405nm에서 흡광도 증가의 속도 (mUnits / 분)로 계산됩니다.
  13. 응고 형성의 정도는 응고 형성 이벤트 기간 동안 달성 405nm (단위)에서 최대와 최소한의 흡광도의 차이로 계산되었다.

4. FV 1 단계 및 2 단계 Microplate 응고 분석과 인간 플라즈마 샘플을 시금

  1. 10 분 동안 37 ° C에서 FV-결함 플라즈마, NHP, 샘플 플라즈마 및 thromboplastin을 해동. 부드럽게, 독립적 FV-결함 플라즈마 및 thromboplastin를 섞어 플라스틱 엘리사 세척 트레이를 분리 전송하고 얼음에 품다. 얼음에 NHP 및 샘플 플라즈마를 저장부드럽게 혼합 후. 실온에서 별도의 엘리사 세척 작업 표시 줄에 저장 염화칼슘 (증류수에 25mM).
  2. 200 μl 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 사용하여 HBS, 산도 7.4의 NHP 및 샘플 플라즈마의 40 배 dilutions을 각각 준비합니다. 잘 와동과 얼음을 품다.
  3. 플라스틱 템플릿 홀더에 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립을 삽입하고 microplate 리더에 삽입합니다.
  4. 왼쪽에서 샘플 함유 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 수있는 템플릿 홀더의 오른쪽에 다른 빈, 빈, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 빈, 그리고 빈 immunomodule 스트립. 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다.
  5. microplate 리더 및 액세스 SoftMax 프로 microplate 응용 프로그램 소프트웨어를 사용합니다.
  6. 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 microplate 우물에 FV-결함 플라즈마 (50 μl)을 추가합니다. singl를 사용하여전자 피펫은 40 배 희석 NHP 또는 microplate 우물을 분리하려면 위의 준비 샘플 플라즈마의 50 μl를 추가합니다.
  7. 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 우물에 thromboplastin을 (50 μl)를 추가합니다. 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 1 분 및 프로그램 microplate 리더에 대한 25 microplate 리더 ° C에서 알을 품다.
  8. microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm로 파장, 키네틱, 25에 온도 ° 이후 6 분마다 5 초 405nm에서 C, 그리고 칼슘 염화물 추가 한 후 처음 5 초에 대항 할 프로그램 microplate 리더 및 측정 흡광도.에 모드로 독자를 설정 5 초 진동 간격은 (아래) 계산 된 응고 시간에 포함되지 않습니다.
  9. 모든 샘플 microplate 우물과 즉시 홍보, 다중 채널 피펫을 사용하여 염화칼슘을 (6.25mM 최종 농도가 증류수에 25mM의 50 μl)을 추가분석을 시작하기 위해 컴퓨터에서 SoftMax Pro의 microplate 응용 프로그램에서 '시작'아이콘을 ESS.
  10. 실행의 끝에서 시간, 초기 속도, 그리고 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 40 배 희석 NHP 및 샘플 플라즈마에 대한 응고 형성의 범위를 결정합니다.
  11. 계좌로 40 배 희석을 고려, 유닛에 / FV 로그 응고 시간 대 로그 FV 활동 (그림 2A)의 1 단계 활동을 표준 곡선으로부터 ML FV 활동을 계산하기 위해 각 샘플에 대한 응고 시간을 사용합니다. 이 트롬빈으로 '의도적'인증없이 FV-1 무대 활동 또는를 나타냅니다.
  12. FV는 활성 cofactor로 트롬빈으로 활성화되어 있기 때문에, FVa 1, 트롬빈과 더불어과 부화 후 두 번째 분석은 정확하게 플라즈마 샘플의 FV 2 단계 활동을 (추가 트롬빈에 의한 '의도적'활성으로)을 측정하는 것이 중요합니다.
  13. FV 2 단계 분석의 경우, 트롬빈 18을 정화의 200-300 μl를 준비t HBS, 산도 7.4의 100nM하고 얼음에 품다. FV 2 단계 분석과 assayed 할 각 플라즈마 샘플 희석 트롬빈의 10 μl를 사용 할 계획입니다.
  14. 2.8mM 염화칼슘을 포함하는 HBS, 산도 7.4의 170 μl 100 배 ~ 40 배에서 위의 NHP 및 샘플 플라즈마 120 μl를 희석. 각 샘플에 10 μl 트롬빈을 (10nM 최종 농도)를 추가합니다. 소용돌이 잘 1 분에 37 ° C에서 혼합 품다합니다.
  15. 위에서 설명한대로 1 단계 microplate 분석 FV 각 플라즈마 샘플의 50 μl를 HBS, 산도 7.4 400 μl를 추가, 소용돌이 잘하고, 분석하여 500 배에 NHP 및 샘플 플라즈마를 희석.
  16. NHP와 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 assayed 각 플라즈마 샘플의 응고 시간을 확인합니다. 계좌로 500 배 희석을 고려, FV FV에서 2 단계 활동을 계산하기 위해 각 샘플에 대한 응고 시간을 사용 로그 응고 시간 대 로그 FV 활동의 1 단계 표준 곡선 (그림 2A).
  17. 총 FV activiFV 1 단계 활동 - 티 그 다음 FV 2 단계 활동으로 계산 될 수있다.

Representative Results

대표 결과 - FV의 작성 1 단계 microplate 응고 분석 활동 표준 곡선

microplate 독자에 의해 생성 시간이 지남에 따라 FV 분석의 섬유소 응고 형성의 대표 예는 그림 1에 도시된다. FV 분석은 정확하게 시간, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 측정합니다. 분석이 완료되면 우물의 검사는 응고 형성이 발생 확인. 전에 시작 흡광도와 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 후 최대 흡광도 사이에 0.45 단위 - 모든 반응은 0.35의 405nm에서 흡광도의 일반적인 변화 응고 형성의 약 동일한 범위에 도달했습니다. FV 대표 예제는 1 단계 로그 응고 시간의 활동 표준 곡선 (초) 대 로그 FV 활동 (단위 / ML)와 응고 형성의 초기 속도를 기록 (mUnits / 분)을 대 로그 FV 활동 (단위 / ML NHP의 일련 dilutions 용)는에 표시됩니다 그림 2B. FV 대 응고 시간의 로그인 로그 음모를 맞는 1 활동 (, R 2 = 0.980 그림 2A) 선형 회귀 분석 한 후 이러한 변수 사이의 강한 관계를 지적했다. FV 활동 대 응고 형성의 초기 속도의 로그인 로그 음모를 맞는하면 (; R 2 = 0.983 그림 2B) 선형 회귀 분석 한 후 이러한 변수 사이의 강한 관계를 지적했다. NHP 512 배까지 희석을 위해 모두 로그 응고 시간의 관계와 응고 형성 대 로그 FV 활동의 초기 속도를 로그 선형 남아 있었다. FV는 12 40nM 약 16에서 NHP에서 순환하기 때문에, microplate 분석은 약 NHP의 24 80pM FV에 민감합니다. prothrombinase의 FVa - FXa - 지질의 상호 작용의 일정한 분리는 약 1nM 17 점을 감안할 때, FV microplate 분석은 생리 학적 relevan에 FV 수준의 측정을위한 완전히 적합합니다prothrombinase의 FVa 기능에 대한 t의 nm의 범위.

FV microplate 분석 사용, 또한 15 건강한 통제 플라즈마의 FV 1 단계 활동 분석 (남성과 여성, 나이 18 20yrs)에 FV 활동의 정상적인 범위 (± 표준 편차 평균, 범위)이라고 결정했습니다 : 0.96 ± 0.14U/ml, 0.68-1.11U/ml. 이 커틀러 외에 의해보고되는 일반적인 건강 FV 활동 및 범위 (0.66-1.14U/ml)과 잘 동의합니다. FV에 대해 1 단계 활동은 자동 분석기 7 결정. 간 검정 시간, 범위의 다양성, 그리고 8 개의 다른 일 6 우물에있는 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도는 각각 3.4 %, 4.4 %, 그리고 3.1 %였다. 간 검정 시간, 범위의 다양성, 그리고 8 개의 다른 일에 8 개의 다른 실험 6 우물에있는 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도는 각각 7.1 %, 7.8 %, 그리고 9.2 %였다. 따라서,이 세 measu의 내부 및 남북 검정 다양성빨간색 변수 (최대 12) 내에서 동시에 여러 샘플 microplate 분석 사이의 강력한 분석 성능을위한 낮은 허용 수준이었다.

대표 결과 - FV 1 단계 및 2 단계 microplate 응고 분석과 인간의 플라즈마 샘플을 시금

로그 응고 시간 대 로그 FV 활동의 표준 곡선 (그림 2A)은 의도적으로 추가 된 트롬빈 (FV 1 단계 활동)으로 활성화되지 않았거나 의도적으로 활성화 된 NHP, 9 DIC 환자 플라즈마의 FV 활동을 측정하는 데 사용 된 트롬빈 (FV 2 단계 활동)을 추가하고 그 결과는 표 1에 표시됩니다. 모든 9 DIC 환자 플라즈마은 1 단계 활동과 NHP에서 각각 54 %와 18 %, 평균 감소 된 응고 형성의 초기 속도 FV을 전시. DIC 환자의 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 범위는 NHP에서 크게 차이가 있었고, NHP에서 13 %로, 평균 증가했다.

트롬빈과 NHP의 활성화 FV에 대략 8 배 증가를 생성 FV 1 단계 활동 (표 1) 위의 2 단계 활동. 이 NHP의 FV는 unactivated 형태로 주로 존재 및 수동 경사 관 FV의 assays 3, 4 및 자동 FV의 assays 5-7를 사용하여 이전에보고 된 결과에 동의 함을 나타냅니다. FV 2 단계 및 전체 활동도 NHP에서 각각 44 %와 4​​2%하여 평균 DIC 환자에서 감소했다. FV DIC 환자의 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도와 extents는 NHP에서 크게 차이가 있었고, NHP와 관찰이에서 각각 약 9%, 4 %로, 평균 다양. 이러한 결과는 장기간 시간에 결과와 섬유소 응고 형성의 속도를 감소 DIC 환자 플라즈마의 NHP, FV에있는 FV과 비교하여 환자 FV는 평균 만 56%뿐만 아니라 트롬빈과 activatable로라고 지적했다.

다닐 "강한 : 유지 - together.within 페이지 ="항상 "> 그림 1
그림 1. 운동 microplate FV 1 단계 응고 분석과 측정 정상적인 풀링 된 인간의 참조 플라즈마에서 응고 형성. NHP의 섬유소 응고 형성은 지속적으로 운동 microplate 리더를 사용하여 405nm에서 모니터링되었다. 줄거리는 32 배 희석 NHP, FV-결함 플라즈마, thromboplastin, 잘 microplate에 염화칼슘의 6 분 반응의 microplate 리더 출력됩니다. 수직 축은 플라즈마의 섬유소 형성의 결과로 발생 405nm에서 흡광도의 변화를 나타냅니다. 섬유소 형성의 시간은 흡광도의 반 최대 증가 또는 곡선 (36.40 초)의 중간 지점에 도달하는 시간으로 정의되었다. 응고 형성의 초기 속도는 커브 (611.88 mUnits / 분)의 흡광도 부분의 선형 증가의 첫 번째 5 번 지점으로 405nm에서 흡광도의 변화의 속도로 정의되었다. 예응고 형성의 텐트는 405 nm의 (0.35 단위)에서 최대 및 최소 흡광도의 차이로 정의되었다.

그림 2
그림 2. 시간과 FV 1 단계 microplate 분석을 사용하여 일반 풀링 된 인간의 참조 플라즈마의 응고 형성 대 팩터 V 활동의 초기 속도의 표준 곡선. NHP는 순차적으로 희석 (0 - 512 배에 HBS)을했고 프로토콜에 설명 된대로 FV 1 단계 microplate 분석과 assayed. 시간과 FV의 응고 형성 대 FV 활동 1 단계 microplate 분석의 초기 속도의 로그인 로그 줄거리는 패널의 데이터와 B, 각각의 선형 회귀 모델링 한 후 표시됩니다.

1 단계 분석 초기 속도 (mUnits / 분)
견본 1 단계 분석 활동 (단위 / ML) 1 단계 검정 범위 (단위) 2 단계 분석 활동 (단위 / ML) 2 단계 검정 범위 (단위) 2 단계 분석 초기 속도 (mUnits / 분) 총 활동 (단위 / ML)
NHP 1.02 0.363 744.96 7.93 0.433 375.84 6.91
환자 1 0.36 0.404 583.80 3.84 0.432 249.96 3.48
환자 2 0.67 0.416 704.04 5.28 0.469 323.16 4.61
0.31 0.435 562.08 3.92 0.453 294.96 3.61
환자 네 0.39 0.435 617.04 4.14 0.462 372.60 3.75
환자 5 0.73 0.401 641.40 5.91 0.433 354.24 5.18
환자 6 0.45 0.403 600.72 4.16 0.445 393.96 3.71
환자 7 0.49 0.395 575.40 4.89 0.449 357.48 4.40
환자 8 0.19 0.448 489.00 2.89 0.450 330.48 2.70
환자 9 0.64 0.423 699.48 5.11 0.455 417.24 4.47

NHP와 혈관 응고 (DIC)를 분해 해 버렸 개발 아홉 환자의 표 1 FV 활동. FV 1 단계, 2 단계, 그리고 NHP 9 DIC 환자 플라즈마의 총 활동은 microplate 분석 표준 FV-1 단계에서 결정 FV 활동 (그림 2A) 대 응고 형성 시간 곡선과는 단위 / ML에 부여됩니다. 초기 속도 (mUnits / 분의 처음 다섯 시간 포인트 이상 A405nm 증가의 초기 속도)와 extents (최대 A405nm - 최소 A40FV 1 응고 형성 5nm) - 및 2 단계 microplate 분석도 표시됩니다.

Discussion

운동 microplate 분석 방법이 소설하지 않은 (FV 1 단계 분석) 또는 인간의 플라즈마의 샘플에서 FV 응고 활동의 측정을위한 신속한 저렴하고 편리한 기술의 발전을 설명하는 것은 의도적으로 추가 된 트롬빈 (FV로 활성화 된 2 단계 분석). 검정은 운동 microplate 리더를 활용하여 필요한 모든 자료와 시약은 상업적으로 사용할 수 있습니다 또는 집에​​서 만들어 질 수있다. 검정은 지속적으로 405nm에서 섬유소 응고 형성 동안 플라즈마의 빛 분산의 변화를 모니터링합니다. microplate 분석 작은 플라즈마 샘플 볼륨을 (μl)를 사용의 장점을 가지고 있으며 동시에 여러 샘플 (12)의 분석을위한 의무입니다. 고가의 장비와 시약은 (자동 분석기 및 팩터 - 결함 플라즈마)를 사용하는 경우이 검정 속성은 유리이다; 만 작은 샘플 볼륨을 사용할 수 있습니다 (환자 플라즈마) 또는 FV 정화 F에는 샘플의 큰 번호 (분석ROM 플라즈마).

FV microplate 분석은 빠르고 편리있는 추가 이점을 가지고 있으며, 필요한 구성 요소의 절연 및 정화를 필요로하지 않습니다. 수동 경사 관 3, 4,보고 된 자동 5-7 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석이 응고 시간 비교 유용한 범위 (25-75 초) 및 샘플에 해당 FV 수준 (0.5-0.005 단위가 / ML) 및 감도 / 검출 한계 (20 80pM). 응고 형성 3, 4의 주관적인 시각적 평가에서 고통을 수동 경사 관 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석은 응고 시간을 객관적이고 정량적 측정, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 할 수 있습니다. 5-7 고가의 분석기 및 시약의 요구로 고통 자동 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석의 시약 및 재료는 저렴하고 필요한 모든 자료는 purcha 수 있습니다상업적으로 SED 또는 집에​​서했다. 수동 경사 관 3, 4 및 자동화 5-7 FV의 assays는 일반적으로 만 응고 형성을위한 시간을 제공,하지 시간, 초기 속도, 그리고 정확하게 FV microplate 분석과 spectrophotometrically 측정 섬유소 응고 형성의 범위. 마지막으로, 3,4 경사 관 수동 및 자동 5-7 FV의 assays는 플라즈마 샘플을 한 번에 하나의 FV 활동을 측정 할 수없는 고통, FV microplate 분석은 높은 처리량 의무가 있으며, 12 샘플 수 있습니다 반면, 동시에 assayed.

microplate 분석은 9 DIC 환자 플라즈마의 FV 때문에 지연 응고 시간 및 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 낮은 초기 속도의 조합의 NHP에보다 적극적이라고 설명하는 데 사용되었습니다. DIC 환자 플라즈마의 FV 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 요금은 NHP에서 변경되지 않았습니다. DIC patien에서 응고 형성의 범위t 플라즈마는 FV 1 단계 및 2 단계 assays의 NHP에서 변경되지 않았습니다. FV 감소 1 단계, 2 단계 및 총 활동이 획득 혈액 장애의 pathogenesis 동안 다른 연구에 따라 증가 FV 소비 19 및 / 또는 불 활성화 여섯으로 인해 발생했을 수 있습니다. DIC 플라즈마에서 응고 형성의 정도는 같은 NHP와 함께 관찰 그대로였다 감안할 때,이 변수는 대부분의 FV-결함 플라즈마에서 피브리노겐 농도의 결과 가능성과 환자 플라즈마의 특성에 관한 아니 었습니다.

microplate 분석의 결과는 인간의 플라즈마의 샘플에서 FV 활동의 측정은 FV 1 단계 분석에서 응고 형성 시간과 초기 속도와 FV 2에서 응고 형성과 총 활동 시간에서 구할 수 있습니다 표시 - 단계 분석. 그것은 t의 응고 형성의 정도에 따라 플라즈마 샘플에 FV 활동의 양적 측정을 얻기 위해 불가능했다그는 FV 1 - 및 2 단계 assays 또는 FV 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도. 모든 반응은 약 0.35의 응고 형성의 동일한 범위에 도달 감안할 때 - 전에 초기 흡광도와 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 후 최대 흡광도 사이에 0.45 단위, 응고 형성의 범위 측정에 FV 활동의 양적 평가를 제공하지 않습니다 플라즈마 샘플을 제공.

소설 microplate 분석은 인간과 동물 플라즈마로부터 정화하는 동안 인간의 플라즈마와 분수의 샘플에서 FV 활동의 측정을위한 연구 및 임상 설정에서 사용을 찾을 수 있습니다. microplate 분석은 시간, 초기 속도, 그리고 응고 형성의 정도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다, 매개 변수는 일반적으로 수동 경사 관 assays 및 자동 응고 분석기로 동시에 모니터링 없습니다. 이 정보는 응고 형성 이벤트 기간 동안 FV의 참여의 전체 정량 평가의 자세한 내용을 제공합니다인간의 플라즈마에 이상이 이전에 3-7보고되었습니다. 플라즈마의 샘플에 FV 활동 또는 FV 또는 FVa을 정화로 큰 변화를 측정 할 때이 정보는 연구와 임상 실험실 모두에서 특히 중요합니다. FV microplate 분석도 특성화하고 측정 FV 및 FVa을 활성화하거나 비활성화 할 수 있습니다 화합물을 정맥 혈전증에 대한 위험에 환자의 FV 활동을 측정 FV 레이덴 돌연변이의 결과로 20, 21하고의 활동을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 플라즈마로부터 정화 기간 동안 FV.

FV microplate 분석은 해당 요소 - 결함 플라즈마를 사용하고 섬유소 형성을위한 시약을 시작 외부, 고유, 또는 일반적인 경로에서 모든 응고 인자의 활동을 측정 할 쉽게 적응합니다. 분석 연구 및 임상 실험실에서의 활동의보다 정확하고 완벽한 측정을 통해 FV 생화학 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다. 최고의지적인,이 정보는 긍정적 이전에 진단 및 DIC와 같은 응고 장애와 고통 사람들을위한 더 효과적인 치료법의 개발을 통해 의료 환경에 영향을 미칠 것입니다.

Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

연구는 전문 개발 및 연구 시작 자금 기술 온타리오 연구소 (UOIT)의 대학에서 박사 존 A. Samis와 이리나 레비 타스 라에 건강 연구 건강 전문 학생 연구 상 캐나다 연수를 지원했다. 저자는 동영상을 준비 그녀의 도움 섀넌 에버렛 (Everett)을 (교육 및 학습 센터, UOIT)을 인정합니다. 저자는 자신의 멘토링, 통찰력, 그리고 도움이 토론에 박사는 마이클 E. Nesheim을 (생화학 부, ON 여왕의 대학, 킹스턴)을 인정합니다. 저자는 또한 연구에 사용 된 DIC 환자 플라즈마를 제공하는 박사 쳉 호크 토를 (로알 드 달의 Haemostasis 및 혈전증 센터, 로얄 리버풀 대학 병원, 리버풀, 영국)을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Tags

면역학 문제 67 팩터 V Microplate 응고 분석 인간 플라즈마는 혈관 내 응고 (DIC) 응고 혈액을 분해 해 버렸
Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A.… More

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter