Summary
Bu çalışma daha önce bildirilmemiştir insan plazma fibrin pıhtı oluşumu sırasında FV koagülasyon aktivitesini ölçer bir roman mikroplate assay açıklanır. Yöntem sürekli olarak insan plazması içinde fibrin pıhtısı oluşumu sırasında 405nm de absorbans değişikliği ölçmek için bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanır.
Abstract
Hasarına yanıt olarak, kan pıhtılaşma aktive edilir ve pıhtılaşma proteaz, trombin oluşumu ile sonuçlanır edilir. Fibrinojenin Trombin parçalayarak fibrinojen hangi kanama durur çözülmeyen bir pıhtı oluşturur. Onun aktif formu, FVa, faktör V (FV) protrombinaz 1, 2 bir parçası olarak fibrin pıhtısı oluşumu sırasında Trombin üretiminin proteaz FXa ve hızlandırıcı için kritik bir kofaktörüdür. Manuel FV deneyleri 3, 4 tarif edilmiştir, ancak zaman alıcı ve subjektiftir. Otomatik FV deneyleri 5-7 bildirdi, ancak analiz ve reaktifler pahalı ve genellikle sadece pıhtı zamanı değil, fibrin oluşumunun hızı ve kapsamı sağlamak vardır oylandı. Mikroplak platformu nedeniyle kolaylık enzim-katalizli olayları ölçmek için tercih edilir, zaman, maliyet, küçük hacimli, sürekli izleme ve 9, 8 yüksek verimli. Mikroplaka deneyleri pıhtı lizis 10, trombosit agregasyon bildirilmiştir11, 12 ve pıhtılaşma faktörleri, fakat insan plazma FV faaliyeti için. Yöntemin amacı, insan plazma içinde fibrin oluşumu sırasında FV aktivitesini ölçer bir mikroplaka tahlil geliştirmektir.
Bu roman mikroplak yöntemi insan plazmasında FV faaliyet basit, ucuz ve hızlı bir tahlil özetliyor. Tahlil, insan plazması içinde fibrin formasyonu (Şekil 1) 13 boyunca 405nm de absorbans değişikliği izlemek için bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanmaktadır. Tahlil doğru zaman, ilk oran ve fibrin pıhtısı oluşumu ölçüde ölçer. Bu plazma sadece ul miktarda gerektirir 6 dakika içinde tamamlandıktan sonra, yüksek verimli olan, 24-80pM FV hassastır ve miktarını ölçer istem aktif (1-evre aktivite) ve trombin ile aktive FV (2-kademeli etkinlik 1-grup etkinliği) -), toplam işlevsel aktivitesini tam bir değerlendirmesi (2-kademeli etkinlik elde edilir.
Dissemine intravaskülerküler pıhtılaşma (DIC) genellikle önceden varolan enfeksiyonlar 14 gelişir bir kazanılmış koagülopati olup. DIC evvelce mevcut patolojinin 15 üzerinde bir kötü prognozu ve mortalitesi ile ilişkilidir. Tahlil DIC, FV 1-kademeli, 2-aşamalı ve toplam faaliyetleri ile 9 hastada normal toplanmış insan ile karşılaştırıldığında, sırasıyla,% 54,% 44 ve% 42, ortalama düşüş olduğunu göstermek için kullanılan Referans plazma (NSP).
FV mikroplate assay herhangi bir pıhtılaşma faktörü aktivitesini ölçmek için kolayca adapte edilebilir. Bu test, araştırma ve klinik ortamlarda faaliyetinin daha doğru ve tam bir ölçüm yoluyla FV biyokimya anlayışımızı artacaktır. Bu bilgiler pozitif erken tanı ve böyle DIC gibi pıhtılaşma bozuklukları, daha etkili tedavilerin geliştirilmesi yoluyla sağlık ortamları etkileyecektir.
Protocol
1. FV-eksik İnsan Plazma hazırlanması
- Bu yöntem, ilk olarak Bloom ve ark 4 tarafından anlatılan prosedür bir modifikasyonudur.
- Herhangi bir ilaç almayan - bir rıza sağlıklı erişkin gönüllü (50 yaş Bay veya Bayan, yaş 18) tam insan kanı edinin. Lateks eldiven ve işlem boyunca bir laboratuar ceket giyin.
- % 3.2 (w / v) distile su içinde trisodyum sitrat, 100 ml hazırlayın. Ayrı bir 60 ml şırıngalar içine Bu çözeltinin 6.0 ml yerleştirin. Dikkatle şırınga 6.0 ml işaretine karartıcı piston tarafından havaya çıkarın.
- Pazı ve önkol arasındaki kübital damarın alanını temizlemek için alkol bezi kullanın. 3 ml şırınga ile 20 gauge kelebek cihazları bağlayın. Kübital vene kelebek iğne takın ve kan 3 mL işaretine doldurana kadar pistonu hafifçe çizin. Kan şırınga atın. Bu adım iğnede hasarlı endotel salınan herhangi bir doku faktörü kaldırmak için yapılırpıhtılaşma sürecini etkinleştirmek ve FV-yoksun plazma hazırlanması uğratabilecek yaralanma sitesi.
- Kelebek iğne 60 ml şırınga ile 'yüklü' 6.0 ml trisodyum sitrat bağlanın ve kan şırınga 60 ml işaretine kadar pistonu hafifçe çizin. (Final sitrat konsantrasyonu 10.9mm).
- Kelebek iğne şırınga çıkarın ve şırınga çıkışında eldivenli parmak veya başparmak tutarken yavaşça şırınga karıştırın.
- 60 ml şırıngalar yukarıda tarif edildiği gibi% 3.2 trisodyum sitrat 6.0 ml ile doldurulmuş her biri içine kan çizim devam edin. Bir santrifüj sonrasında ve FV-eksik plazma 50 ul tahlil mikroplaka Her örnek için gerekli olan plazma gibi sitratlı kan hacminin yaklaşık olarak% 50 iyileşme tahmin etmek gerekir. Laboratuvarımız rutin% 3.2 trisodyum sitrat / şırınga 6.0 ml 5-7 x 60 ml şırınga kullanarak bir kerede sitratlı kan 300-420 ml işler. Bu yaklaşık 3,000 mikro için yeterli FV-yoksun plazma olduğunuplaka testler (aşağıya bakınız).
- Gönüllü kolundan kelebek iğne çıkarın ve 1.0 dakika ven ponksiyonu site üzerinde steril bir gazlı bezle basın. Steril bir bandaj ile ven ponksiyonu site kaplayın.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 3,300 x g sitratlı kan santrifüjleyin. Düşük kırmızı ve beyaz kan hücre tabakası rahatsız özen plastik transfer pipet kullanarak bir karıştırıcı ile plastik bir behere üst sarı plazma katmanı kurtarın.
- Tedbir ml plazma hacmi ve gelecekteki protrombin pıhtı zamanı (PT) testi (aşağıya bakınız) için buz üzerinde EDTA eklenmesinden önce plazma 100 ul saklayın.
- Yavaş yavaş 5mM elde etmek için, oda sıcaklığında nazik karıştırma ile sitratlı plazma için katı EDTA ilave edin (nihai konsantrasyon). EDTA çözündükten sonra, yumuşak bir karıştırma ile damla damla 1.0M NaOH çözeltisi ilave edilerek pH değeri 7.0 'a ayarlayın.
- 37 karıştırmadan 8-10 saat süreyle Saran Wrap ve inkübe ile kabı Kapak ° C
- Her 2 saat, 100 ul kurtarmakEDTA ile tedavi edilen buz üzerinde plazma ve EDTA ile kuluçka sırasında PT belirlenmesi ve önceden EDTA ilavesi (yukarıya bakınız) için plazma PT ile karşılaştırın.
- PT tespitler için mikroplak okuyucu içine plastik şablonu tutucu ve uç içine yer çıkarılabilir 8 de immunomodule şeritler.
- Olarak mikroplak okuyucu Orient immunomodule şeritler: boş, boş, örnek, boş, boş, örnek, numune içeren şeritler komşu ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için boş ve soldan şablon sahibinin sağ boş. Ayrıca, plastik şablon sahibinin kenarlarından ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için her 8 sıra immunomodule şeridi yukarıdan sadece kuyu 2-7 kullanın.
- FV mikroplate assay aynı anda en az 12 farklı örnekleri (2 immunomodule şeritlerinüzerindeki immunomodule şerit başına 6 adet) fibrin pıhtı oluşumu ölçme yeteneğine sahiptir.
- Çok kanallı bir pipet kullanılarak, için 50 ul HBS (20 mM HEPES, 150 mm NaCl, pH 7.4) eklemekHer mikroplak örneğin her test edilmesi için. Tek bir pipet kullanarak, mikroplak kuyu ayırmak için EDTA ekledikten sonra EDTA ilavesinden önce veya çeşitli inkübasyon zamanlarda normal insan toplanmış referans plazma (NSP) veya plazma 50 ul ekleyin.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, test edilecek plazma ile tüm mikroplak kuyularına 50 ul tromboplastin (hazırlama yöntemi için aşağıya bakın) ekleyin. 1 dakika ile 1 dakika inkübasyondan 15-25 saniye boyunca plaka sallamak için programı mikroplaka okuyucu için 25 ° C sıcaklıkta mikroplaka okuyucu içinde inkübe edin.
- Mikroplaka okuyucu, erişim SoftMax Pro yazılımı mikroplak uygulaması ile arabirim bilgisayar kullanma. Absorbans, 405nm dalga boyu için, Kinetik, sıcaklık moduna ila 25 ° C, ve program mikroplaka okuyucu 5 saniye için çalkalanır, ve 6 dakika boyunca her 5 saniyede 405nm de absorbans okumak için. Için okuyucu ayarlama
- 2.1mm fina; çok kanallı pipet kullanarak, (distile su 25mM 50 ul kalsiyum klorür ekleyinl konsantrasyon) mikroplak kuyu tümüne, 15 saniye bekleyin ve test başlamak için mikroplak SoftMax Pro menüsünden 'Başlat' simgesine basın.
- Zaman 405nm de absorbans yarısı maksimal artış (tromboplastin ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra üretilen Sigmoidal Absorbans vs Zaman eğrisinin orta noktası. Aşağıya bakınız, ulaşmak gibi SoftMax Pro Absorbans vs Zaman profillerden ÖLÇÜMÜ belirleyin Şekil 1).
- Şekil 2A, aşağıda gösterildiği gibi Günlükler Pıhtı Süresi (sn) vs Günlükler FV Aktivitesi (Units / ml) FV 1 aşamalı aktivite hesaplayın. Kantitatif amaçlar için, FV aktivite 1unit önce eklendi trombin (FV 1-grup ve 2 aşamalı mikrolevha pıhtılaşma deneyi ile insan plazma numuneleri test edilmesi, aşağıya bakınız) ile kasıtlı aktivasyonu için 1.0 ml NHP içinde bir etkinliğinin söz konusu olduğu gibi tanımlanır.
- Nazik karıştırma ile distile su 0.15m NaCl içeren 20 mM HEPES ve 4.0L hazırlayın. Yavaş dropw ile 7.4 pH ayarlama5.0M NaOH ilave ISE (HBS, pH 7.4).
- Diyaliz boruları yeterli uzunlukta elde edilir ve distile su ile iyice durulayın. Hortumun bir ucunu bir düğüm. Transferi EDTA plastik bir transfer pipet ile diyaliz tüp plazma tedavi, havayı çıkarmak ve boru diğer ucunu bir düğüm.
- Dikkatlice nazik karıştırma ile HBS içine tüp EDTA-tedavi plazma asın. Saran Wrap ile kaplayın ve 4 ° C'de hafif karıştırma ile 14-16h için dialyze
- Dikkatlice 15.0 ml vidalı kapaklı tüplere 3,0 ml alikotları EDTA-treated/dialyzed plazma çıkarın ve buz üzerinde 'final' FV-yoksun plazma PT testi için 100 ul saklayın. -80 ° C Kullanım kadar içeri FV-yoksun plazma saklayın. Yukarıda tarif edilen koşullar altında, EDTA ilave edildikten sonra 90-100 saniye 8-10 saat için EDTA ilave edilmeden önce 10-15 sn 'den ÖLÇÜMÜ artar. Bu metod ile hazırlanan FV-eksikliği olan plazma rutin olarak aktif başlangıç FV mevcut az% 0.1 'den içerirtaze insan plazma.
2. Tromboplastin hazırlanması
- Diyaliz pıhtılaşma sürecini başlatmak için kalsiyum klorür ilave bir zaman tam zamanlama fibrin pıhtısı oluşumu izin vermek için bu reaktif herhangi bir kalsiyum kaldırmak için gereklidir.
- Hafif karıştırarak, bir plastik beher içinde damıtılmış su içinde 100 ml ve 4.0L 20 mM HEPES ve 0.15m NaCl hazırlayın. 5.0M NaOH (HBS, pH 7.4) yavaş yavaş damla damla ilavesi ile pH 7.4 'e ayarlayın.
- Tromboplastin reaktifi her flakon HBS, pH 7.4, 6.0 ml ekleyin, kapağı değiştirin ve çözünmesi için yavaşça sallayın. Kuruyan malzeme çözünmesi için oda sıcaklığında 15 dakika için kapaklı şişe içinde reaktif inkübe edin. Tamamen çözünmesi için yavaşça sallayın.
- , Diyaliz tüp yeterli uzunlukta kesin distile su ile iyice durulayın ve bir düğümle Hortumun bir ucunu kapalı kravat. Diyaliz hortumuna tromboplastin aktarın, hava kaldırmak ve bir düğümle Hortumun diğer ucunu kapalı kravat.
- Carefully HBS, pH 7.4 4.0L diyaliz tüp takılmak ve yavaşça 14-16 saat süreyle 4 ° C'de Saran Wrap ile kaplı karıştırın.
- Kullanılan ° C kadar -80 15 ml vidalı kapaklı tüpler ve mağaza diyalizlenmiş tromboplastin 3.0 ml alikotları aktarın.
3. FV Hazırlık 1-aşamalı Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Aktivite Standart Eğriler
- 10 dk için 37 ° C 'de FV-eksik plazma, NHP, ve tromboplastin çözülme. Yavaşça, bağımsız FV-yoksun plazma ve tromboplastin karıştırın plastik çamaşır tepsiler ayırmak aktarmak ve buz üzerinde inkübe edin. Hafifçe karıştırıldıktan sonra buz üzerinde NSP saklayın. Oda sıcaklığında ayrı bir yıkama tepsi muhafaza kalsiyum klorür (distile su içinde 25mM).
- , - 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256-200 ul 0 ila NHP 2-kat seri seyreltiler, her bir hazırlama, HBS içinde 512-kat, pH 7.4 içinde 1.5 kullanarak ml mikrosantrifüj tüpleri. Iyi Vortex ve buz üzerinde inkübe edin.
- P içine çıkarılabilir 8 sıra immunomodule şeritler yerleştirinmikroplaka okuyucu Lastic şablonu tutucu ve uç.
- Olarak mikroplak okuyucu Orient immunomodule şeritler: boş, boş, örnek, boş, boş, örnek, numune içeren şeritler komşu ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için boş ve soldan şablon sahibinin sağ boş. Ayrıca, plastik şablon sahibinin kenarlarından ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için her 8 sıra immunomodule şeridi yukarıdan sadece kuyu 2-7 kullanın.
- FV mikroplate assay aynı anda en az 12 farklı örnekleri (2 immunomodule şeritlerinüzerindeki immunomodule şerit başına 6 adet) fibrin pıhtı oluşumu ölçme yeteneğine sahiptir.
- Mikroplaka okuyucu ve erişim SoftMax Pro mikroplak uygulama yazılımı açın.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm numune mikroplak kuyularına FV-yoksun plazma (50 ul) eşzamanlı ekleme yapmak. Mikroplaka kuyu ayırmak için yukarıda hazırlanan NSP'nin 10 seri dilüsyonları 50 ul ekle, tek bir pipet kullanın.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm numune kuyuları için tromboplastin (50 ul) ekleyin. 1 dakika inkübasyondan 15-25 saniye boyunca plaka sallamak için 1 dakika ve program mikroplaka okuyucu için 25 mikroplaka okuyucu ° C'de inkübe edin.
- Mikroplaka okuyucu, erişim SoftMax Pro yazılımı mikroplak uygulaması ile arabirim bilgisayar kullanma. Absorbans, 405nm için Dalgaboyu, Kinetik, 25 ° bundan sonra 6 dakika boyunca her 5 sn 405nm C ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra ilk 5 saniye boyunca sallamak programı mikroplak okuyucu ve önlem absorbans. Moduna okuyucu ayarlayın 5 sn sallayarak aralığı (bakınız aşağıda) hesaplanan pıhtı zamanlar dahil değildir.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, kalsiyum klorür (distile su 25mM 50 ul; final konsantrasyon 3.5mm) eklemek tüm numune mikroplak kuyularına, başlamak için bilgisayardan 15 saniye basın SoftMax Pro mikroplak uygulamasında 'Başlat' simgesini bekleyin tahlil.
- TO pıhtı kez tromboplastin ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra 405nm de minimum ve maksimum absorbans arasındaki orta ulaşmak için saniye zaman olarak hesaplanır.
- Pıhtı oluşumunun başlangıç oranları absorbans vs zaman eğrisinin doğrusal kısmı içinde pıhtı oluşumu ilk 5 zaman noktalarında kapsamaktadır 405nm absorbanstaki artış oranı (mUnits / dk) olarak hesaplanır.
- Pıhtı oluşumu ölçüde pıhtı oluşumu olay sırasında elde 405nm (Adet) de maksimal ve minimal absorbans arasındaki fark olarak hesaplanmıştır.
4. FV 1-evre ve 2 aşamalı Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz İnsan Plazma Örnekleri assaying
- 10 dk için 37 ° C 'de FV-eksik plazma, NHP, örnek plazmalar, ve tromboplastin çözülme. Yavaşça, bağımsız FV-yoksun plazma ve tromboplastin karıştırın plastik ELISA yıkama tepsiler ayırmak aktarmak ve buz üzerinde inkübe edin. Buz üzerinde NSP ve örnek plazmalar Mağazahafifçe karıştırıldıktan sonra. Oda sıcaklığında ayrı bir ELISA tepsisine yıkama muhafaza kalsiyum klorür (distile su içinde 25mM).
- 200 ul 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanarak HBS, pH 7.4 'te NSP ve örnek plazmasının 40 kat dilüsyonlarının her hazırlayın. Iyi Vortex ve buz üzerinde inkübe edin.
- Plastik şablonu yuvaya çıkarılabilir 8 sıra immunomodule şeritler yerleştirin ve mikroplaka okuyucu takın.
- Soldan örnek içeren şeritler komşu ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için şablon sahibinin sağ Alternatif boş, boş, örnek, boş, boş, örnek, boş ve boş immunomodule şeritler. Plastik şablon sahibinin kenarlarından ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için her immunomodule şeridi yukarıdan sadece kuyu 2-7 kullanın.
- Mikroplaka okuyucu ve erişim SoftMax Pro mikroplak uygulama yazılımı açın.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm numune mikroplak kuyularına FV-yoksun plazma (50 ul) ekleyin. Bir singl kullanmae pipetle, 40-kat seyreltilmiş NHP veya mikroplaka kuyu ayırmak için yukarıda belirtildiği gibi hazırlanan örnek plazmasının 50 ul ilave edin.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm numune kuyuları için tromboplastin (50 ul) ekleyin. 1 dakika inkübasyondan 15-25 saniye boyunca plaka sallamak için 1 dakika ve program mikroplaka okuyucu için 25 mikroplaka okuyucu ° C'de inkübe edin.
- Mikroplaka okuyucu, erişim SoftMax Pro yazılımı mikroplak uygulaması ile arabirim bilgisayar kullanma. Absorbans, 405nm için Dalgaboyu, Kinetik, 25 ° bundan sonra 6 dakika boyunca her 5 sn 405nm C ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra ilk 5 saniye boyunca sallamak programı mikroplak okuyucu ve önlem absorbans. Moduna okuyucu ayarlayın 5 sn sallayarak aralığı (bakınız aşağıda) hesaplanan pıhtı zamanlar dahil değildir.
- Tüm örnek mikroplak kuyularına ve hemen pr; çok kanallı pipet kullanarak, kalsiyum klorür (6.25mM nihai konsantrasyon distile su 25mM 50 ul) ekleyintahlil başlamak için bilgisayardan SoftMax Pro mikroplak uygulamasında 'Başlat' simgesi ess.
- Çalışma sonunda, zaman, ilk oran ve SoftMax Pro de absorbans-zaman profilleri ile 40-kat seyreltilmekte ve NHP örnek için plazma pıhtı oluşumu miktarını belirler.
- Hesaba 40 kat seyreltme alarak, Birimleri / FV Günlükler Pıhtı Zaman vs Günlükler FV Aktivitesi (Şekil 2A) 1-evre aktivitesi standart eğriden ml FV aktivite hesaplamak için her bir örnek için pıhtı zaman kullanabilirsiniz. Bu trombin tarafından 'kasten' aktivasyonsuz FV-1 aşama aktivite ya da temsil eder.
- FV aktif kofaktör ile trombin ile aktive olduğu için, FVa 1, trombin ile ilave edildi ve inkübasyon sonrasında ikinci bir tahlil doğru bir plazma numunesinin FV 2-kademeli aktivitesi (trombin ile katma "kasıtlı 'aktivasyon ile) ölçmek için çok önemlidir.
- FV 2-aşamalı yöntem için, trombin 18 saflaştırılmış 200-300 ul hazırlamakt HBS, pH 7.4 'te 100nM ve buz üzerinde inkübe edin. FV 2-aşamalı yöntem ile test edilecek her plazma örneği için seyreltilmiş trombin 10 ul kullanmayı planlayın.
- 2.8mm kalsiyum klorür içeren HBS, pH 7.4 içinde 170 ul ile 100-kat ila 40 kat dan yukarıda NHP ve örnek plazmasının 120 ul seyreltin. Her bir örnek için 10 ul trombin (10nm nihai konsantrasyon) ilave edilir. Girdap da 1 dakika için 37 ° C sıcaklıkta karıştırılır ve inkübe etmek.
- Yukarıda tarif edildiği gibi aşama 1-mikrolevha tahlil FV içinde her bir plazma örneği 50 ul HBS, pH 7.4, 400 ul ekleyerek, girdap de, ve tahlil ile 500-kat için NHP ve örnek plazma seyreltilir.
- NHP ve SoftMax Pro Absorbans vs Zaman profilleri tahlil her plazma numune için pıhtı zamanı belirleyin. Hesaba 500 kat seyreltme alarak, FV FV 2 aşamalı aktivite hesaplamak için her bir örnek için pıhtı zaman kullanabilirsiniz Günlükler Pıhtı Zaman vs Günlükler FV Faaliyet 1-kademeli standart eğrisi (Şekil 2A).
- Toplam FV aktivitelerFV 1 aşamalı aktivite - ty sonra FV 2 aşamalı faaliyet olarak hesaplanabilir.
Representative Results
Temsilcisi Sonuçlar - FV Hazırlık 1-aşamalı mikroplak koagülasyon testi etkinliği standart eğrileri
Mikroplaka okuyucu tarafından üretilen saat boyunca FV tahlil içinde fibrin pıhtısı oluşumu temsili bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. FV tahlil doğru zaman, ilk oran ve fibrin pıhtısı oluşumu ölçüde ölçer. Tahlil tamamlanması üzerine kuyuların Teftiş pıhtı oluşumu meydana geldiğini doğruladı. Daha önce başlangıç absorbans ve tromboplastin ve kalsiyum klorür ilave edildikten sonra, maksimum absorbans arasında 0.45 birimleri - Bütün reaksiyonlar 0.35 405nm de absorbans genel bir değişiklik ile pıhtı oluşumu yaklaşık olarak aynı ölçüde yükselmiştir. FV Temsilcisi örnekleri 1-aşamalı Günlükler Pıhtı Zaman aktivitesi standart eğrileri (saniye) vs Günlükler FV Aktivitesi (Units / ml) ve pıhtı oluşumu Başlangıç Hızı Girişi (mUnits / dak) vs Günlükler FV Aktivitesi (Adet / ml NSP'nin seri seyreltiler) gösterilir
FV mikroplate assay kullanarak, o da 15 sağlıklı kontrol plazmasının FV 1 aşamalı aktivite assay (Erkek ve Kadın, Yaş 18-20yrs) FV aktivitenin normal sınırlarda (± Standart sapma; Aralığı) olduğu tespit edilmiştir: 0.96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Bu Cutler ve ark tarafından bildirilen normal sağlıklı FV aktivitesi ve aralık (0.66-1.14U/ml) ile de aynı fikirde. FV 1-grup etkinliği bir otomatik analiz cihazı 7 ile tespit edilmiştir. Intra-analiz zaman, ne ölçüde değişkenlik ve 8 farklı günlerde 6 kuyuda FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu başlangıç hızı sırasıyla% 3.4,% 4.4 ve% 3.1 idi. Inter-assay zaman, ne ölçüde değişkenlik, ve 8 farklı günlerde 8 farklı deneyler 6 kuyuda FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu başlangıç hızı sırasıyla% 7.1,% 7.8 ve% 9.2 idi. Böylece, bu üç measu arasında intra ve inter-assay değişkenliğikırmızı değişkenler (Up to 12) içinde ve aynı anda birden fazla numune mikroplate assay arasında sağlam çalışma performans için düşük ve kabul edilebilir düzeyde idi.
Temsilcisi Sonuçlar - FV 1-evre ve 2 aşamalı mikroplak koagülasyon yöntemi ile insan plazma örnekleri assaying
Log Clot Zaman vs Günlükler FV Faaliyet standart eğri (Şekil 2A) kasıtlı katma trombin (FV 1-evre aktivitesi) ile devreye alınmadı veya kasıtlı aktive edilerek NHP ve 9 DIC hasta plazmalarda FV aktivitesini ölçmek için kullanılan trombin (FV 2-kademeli etkinlik) ilave edildi ve sonuçlar Tablo 1 'de gösterilmektedir. Tüm 9 DIC hasta plazmaları 1 aşamalı faaliyetleri ve NSP göre sırasıyla% 54 ve% 18, ortalama azaldı pıhtı oluşumunu başlangıç oranları FV sergiledi. DIC hastalarda FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu uzantılar NHP büyük ölçüde farklı değildi ve NSP dan% 13 oranında, ortalama artış göstermiştir.
Trombin ile NHP aktivasyonu, FV olarak yaklaşık 8 kat artış elde FV 1-grup etkinliği (Tablo 1) yukarıdaki aşama 2-aktivitesi. Bu NHP yılında FV onun devre dışı bırakın formunda ağırlıklı olarak bulunan ve manuel eğim-tüp FV deneyleri 3, 4 ve otomatik FV deneyleri 5-7 kullanarak önceden bildirilen sonuçlar ile uyumlu olduğunu gösterir. FV 2-aşamalı ve toplam aktivite de NSP göre sırasıyla% 44 ve% 42, ortalama DIC hastalarda azalmıştır. FV DIC hastalarda 2-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu başlangıç hızları ve kapsamlarını NSP anlamlı olarak farklı değildi ve NSP ile gözlenen sırasıyla yaklaşık% 9 ve% 4, tarafından, ortalama değişiyordu. Bu sonuçlar uzun bir zaman sonuçlandı ve fibrin pıhtı oluşumu oranı azalmıştır DIC hastanın plazmalarda NSP, FV yılında FV ile karşılaştırıldığında ve hasta FV ortalama sadece% 56 ve trombin ile aktive olarak olduğunu belirtti.
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 1. Kinetik mikroplate FV 1-evre koagülasyon yöntemi ile ölçülen normal bir havuzlanmış insan referans plazmasında pıhtı oluşumu. NHP fibrin pıhtısı oluşumu sürekli olarak bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanılarak 405nm de izlenmiştir. Arsa 32 kat seyreltilmiş, NHP, FV-eksik plazma, tromboplastin, ve iyi bir mikrolevhadaki kalsiyum klorit ihtiva eden bir 6 dk reaksiyon mikroplaka okuyucu çıkarılır. Dikey eksen plazma içinde fibrin oluşumunun bir sonucu olarak meydana gelen 405nm de absorbans değişikliği temsil eder. Fibrin oluşumunun zaman absorbans yarı maksimum artış ya da eğri (36.40 san) orta noktası ulaşmak için geçen süre olarak tanımlanmıştır. Pıhtı oluşumu başlangıç hızı eğrisi (611,88 mUnits / dak) absorbansı kısmının doğrusal artış ilk 5 kez puan üzerinden 405nm de absorbans değişim oranı olarak tanımlandı. Expıhtı oluşumu çadırı 405 nm (0.35 adet) maksimum ve minimum absorbans arasındaki fark olarak tanımlandı.
Şekil 2. Zaman ve FV 1 kademeli mikroplate assay kullanarak normal havuzlanmış insan referans plazmasında pıhtı oluşumu vs Faktör V faaliyetin başlangıç hızı standart eğrileri. NHP seri olarak seyreltildi (0-512 kat ile HBS içinde) ve protokolde tarif edildiği gibi FV 1-grup mikrolevha yöntemi ile ölçüldü. Zaman ve FV içinde pıhtı oluşumu vs FV etkinliği 1-evre mikroplaka testin başlangıç hızı Log-Log araziler panellerine veri A ve B, sırasıyla lineer regresyon modelleme sonra gösterilmektedir.
| Örnek | 1-aşamalı yöntem Aktivitesi (Units / ml) | 1-aşamalı yöntem Kapsamı (Adet) | 2-aşamalı yöntem Aktivitesi (Units / ml) | 2-aşamalı yöntem Kapsamı (Adet) | 2-aşamalı yöntem Başlangıç Hızı (mUnits / dak) | Toplam faaliyet (Adet / ml) | |
| NHP | 1.02 | 0.363 | 744.96 | 7.93 | 0.433 | 375.84 | 6.91 |
| Hasta 1 | 0.36 | 0.404 | 583.80 | 3.84 | 0.432 | 249.96 | 3.48 |
| Hasta 2 | 0.67 | 0.416 | 704.04 | 5.28 | 0.469 | 323.16 | 4.61 |
| 0.31 | 0.435 | 562.08 | 3.92 | 0.453 | 294.96 | 3.61 | |
| Hasta 4 | 0.39 | 0.435 | 617.04 | 4.14 | 0.462 | 372.60 | 3.75 |
| Hasta 5 | 0.73 | 0.401 | 641.40 | 5.91 | 0.433 | 354.24 | 5.18 |
| Hasta 6 | 0.45 | 0.403 | 600.72 | 4.16 | 0.445 | 393.96 | 3.71 |
| Hasta 7 | 0.49 | 0.395 | 575.40 | 4.89 | 0.449 | 357.48 | 4.40 |
| Hasta 8 | 0.19 | 0.448 | 489.00 | 2.89 | 0.450 | 330.48 | 2.70 |
| Hasta 9 | 0.64 | 0.423 | 699.48 | 5.11 | 0.455 | 417.24 | 4.47 |
NHP ve intravasküler koagülasyon (DIC) Dissemine geliştirilen 9 Hastalarda Tablo 1 FV Aktivitesi. FV 1-kademeli, 2-aşamalı ve NHP ve 9 DIC hasta plazmalarda toplam aktivite mikroplate assay standart FV-1. aşama belirlenmiştir FV etkinlik (Şekil 2A) vs pıhtı oluşumu zamanı eğrisi ve birim / ml 'de verilmiştir. Başlangıç hızları (mUnits / dak ilk beş kez puan üzerinden A405nm artış başlangıç hızı) ve kapsamlarını (Maksimum A405nm - Minimum A40FV 1 içinde pıhtı oluşumu 5nm) - ve 2-evre mikrolevha tahlil de gösterilmiştir.
Discussion
Kinetik mikroplate assay yöntemi bir roman, yok (FV 1-aşamalı yöntem) veya insan plazma örnekleri FV koagülasyon aktivitesi ölçümü için, hızlı, ucuz ve uygun tekniğin gelişimi özetliyor bilerek katma trombin (FV ile aktive edilmiştir 2-aşamalı yöntem). Tahlil, bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanır ve gerekli olan tüm malzemeleri ve reaktifler, ticari olarak temin edilebilir ya da in-house yapılabilir. Tahlil sürekli 405nm de fibrin pıhtı oluşumu sırasında plazma ışık saçma değişikliğini takip. Mikroplate assay küçük plazma numune hacimleri (ul) kullanmanın avantajı vardır ve aynı anda birden fazla örnekleri (12) analizi için müsait olduğunu. Pahalı ekipman ve reaktifler (Otomatik analizör ve Faktör-eksik plazmalar) kullanıldığında bu tahlil öznitelikler avantajlıdır; sadece küçük bir örnek hacimleri mevcuttur (Hasta plazmalar) veya FV arıtma f sırasında örnekleri çok sayıda (analizrom plazma).
FV mikroplaka tahlil, hızlı ve uygun olduğu ilave avantajlara sahiptir, ve gerekli kurucu bileşenlerin izolasyon ve saflaştırma gerekli değildir. Manuel eğim tüpü 3, 4 ve rapor edilmiştir otomatikleştirilmiş 5-7 FV testleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplate assay pıhtı kez karşılaştırılabilir yararlı aralığı (25-75 sn) ve örnek gelen FV düzeyleri (0,5-,005 Birimleri var / ml) ve duyarlılık / algılama sınırları (20-80pM). Pıhtı oluşumunu 3, 4 öznel bir görsel değerlendirme muzdarip manuel eğim-tüp FV deneyleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplate assay pıhtı zaman objektif ve kantitatif ölçümü, başlangıç hızı, ve fibrin pıhtı oluşumu ölçüde izin verir. 5-7 pahalı analizörleri ve reaktiflerin gereksinimi muzdarip otomatik FV testleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplak test reaktifleri ve malzeme ucuz ve gerekli tüm malzemeleri purcha olabilirticari sed veya evde yapılmış. Elle eğim tüpü 3, 4 ve otomatik 5-7 FV deneyler genellikle sadece pıhtı oluşumu için zaman sağlanır; değil süresi, başlangıç hızı, ve tüm doğru FV mikroplate assay ile spektrofotometrik olarak ölçülür fibrin pıhtısı oluşumu derecesi. Son olarak, 3,4 eğim tüpü manuel ve otomatik 5-7 FV deneyleri sadece plazma örnekleri bir defada biri FV aktivitesini ölçmek edememek muzdarip; FV mikroplate assay high-throughput mükellef olup 12 örnek olabilir oysa aynı anda test.
Mikroplaka tahlil 9 DIC hasta plazmalardaki FV çünkü gecikmeli pıhtı kez ve FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu daha düşük başlangıç oranları bir bileşimi NHP içinde daha az aktif olduğunu göstermek için kullanılmıştır. DIC hasta plazmalarda FV 2-aşamalı yöntem pıhtı oluşumunun başlangıç hızları NSP değişti değildi. DIC patien içinde pıhtı oluşumu uzantılart plazmalar da FV 1-evre ve 2 aşamalı deneylerde NSP değişti değildi. FV Azalmış 1-kademeli, 2-aşamalı ve toplam faaliyetleri bu kazanılmış kan bozukluğu patogenezinde sırasında diğer çalışmalara göre artan FV tüketimi 19 ve / veya inaktivasyonu 6 nedeniyle olmuş olabilir. DIC Plazma içinde pıhtı oluşumu dereceye kadar NHP ile gözlenen aynı olduğu göz önüne alındığında, bu değişken en FV-eksik plazma fibrinojen konsantrasyonu sonucunda muhtemel ve hastanın plazmasının özellikleri ile ilgili değildir.
Mikroplak tahlilinden gelen sonuçlar, insan plazma örnekleri içinde FV aktivite ölçümü FV 1-aşamalı yöntem gelen pıhtı oluşumu zamanı ve başlangıç hızı ve FV 2 pıhtı oluşumu ve toplam aktivite süresi elde edilebilir belirtilmedikçe - aşamalı yöntem. Bu t pıhtı oluşumu ölçüde dayalı bir plazma örneği FV aktivitesinin kantitatif ölçümü elde etmek mümkün değildio FV 1 - ve 2 aşamalı deneyleri ya da FV 2-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumunun başlangıç hızı. Tüm reaksiyonlar yaklaşık 0.35 pıhtı oluşumu aynı ölçüde ulaştı Verilen - öncesi başlangıç absorbansı ve tromboplastin ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra maksimal absorbans arasındaki 0.45 Üniteleri, pıhtı oluşumu ölçüde ölçümü FV aktivitesinin kantitatif değerlendirmesini sağlamaz plazma örneği verilmiştir.
Roman mikroplate assay insan ve hayvan plazma kendi arıtma sırasında insan plazma ve kesirler örnekleri FV aktivitesi ölçümü için araştırma ve klinik ortamlarda kullanımı bulacaksınız. Mikroplate assay zaman, ilk oran ve pıhtı oluşumunu ölçmek için kullanılmaktadır edilebilir; parametreler, genellikle manuel eğim tüpü deneyleri ve otomatik analiz eş zamanlı olarak pıhtılaşma denetlenmemektedir. Bu bilgiler, pıhtı oluşumu olay sırasında FV tutulumu tam bir nicel değerlendirmenin fazlasını sağlarinsan plazması içinde daha önceden 3-7 rapor edilmiştir. Plazma örneklerinde FV aktivite veya FV veya FVa saflaştırılmış ile önemli değişiklik ölçerken Bu bilgiler araştırma ve klinik laboratuvarlarda hem de özellikle önemlidir. FV mikroplate assay da belirlerler ve ölçmek FV ve FVa etkinleştirmek veya inaktive olabilir bileşikler, venöz tromboz riski olan hastalarda FV aktivitesini ölçmek mutasyonun bir sonucu olarak 20, 21 ve etkinliğini izlemek için kullanılan olabilir plazmadan kendi arıtma sırasında FV.
FV mikroplate assay uygun etken eksikliği olan plazma kullanılarak ve fibrin oluşumunun başlatılması için reaktifler dış, içsel, ya da ortak bir yoldan herhangi bir pıhtılaşma faktörü etkinliği ölçmek için kolaylıkla uyarlanabilir. Tahlil araştırma ve klinik laboratuvarlar faaliyetinin daha doğru ve eksiksiz bir ölçüm yoluyla FV biyokimya anlayışımızı artacaktır. Nihaily, bu bilgiler pozitif erken tanı ve böyle DIC gibi koagülasyon bozuklukları ile tutulmuş bireyler için daha etkili tedavilerin geliştirilmesi yoluyla sağlık ortamları etkileyecektir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Araştırma Mesleki Gelişim ve Araştırma Başlatma Fonları Teknoloji Ontario Enstitüsü (UOIT) arasında Üniversitesi'nden Dr John A. Samis ve Irina Levit için Sağlık Araştırması Sağlık Profesyonel Öğrenci Araştırma Ödülü Kanadalı Enstitüleri ile desteklenmiştir. Yazarlar videoyu hazırlarken ona yardım için Shannon Everett (Öğretme ve Öğrenme Merkezi, UOIT) kabul etmektesiniz. Yazarlar kendi rehberlik, içgörü ve yararlı tartışmalar için Dr Michael E. Nesheim (Biyokimya Anabilim Dalı, ON Queen Üniversitesi, Kingston) kabul etmektesiniz. Yazarlar ayrıca çalışmada kullanılan DIC hasta plazmaları sağlamak için Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hemostaz ve Tromboz Merkezi, Royal Liverpool Üniversite Hastanesi, Liverpool, İngiltere) kabul etmektesiniz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
| Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
| Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
| EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
| FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
| 3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
| Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
| HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
| Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
| Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
| Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
| Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
| ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
| 1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
| Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |
References
- Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
- Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
- Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
- Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
- Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
- Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
- Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
- Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
- Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
- Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
- Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
- Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
- Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
- Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
- Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
- Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
- Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
- Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
- Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
- Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
- Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).
