Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest

Published: September 9, 2012 doi: 10.3791/3822
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science, University of Ontario Institute of Technology, 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology, 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology

Summary

Deze studie beschrijft een nieuwe microplaat test die FV stollingsactiviteit tijdens fibrine stolselvorming in menselijk plasma die niet eerder gerapporteerd. De methode gebruikt een kinetische microplaatlezer de verandering in absorptie bij 405 nm meet continu in fibrine stolselvorming in menselijk plasma.

Abstract

In reactie op letsel is bloedstolling geactiveerd en resulteert in het genereren van de stolling protease, trombine. Trombine splitst fibrinogeen in fibrine welke een bloedklonter die onoplosbaar bloeding stopt. Factor V (FV) in zijn geactiveerde vorm, FVa, een kritische co-factor voor de protease FXa en versneller van trombinevorming in fibrine stolselvorming als onderdeel van protrombinase 1, 2. Manual FV assays zijn beschreven 3, 4, maar ze zijn tijdrovend en subjectief. Geautomatiseerde FV assays gemeld 5-7, maar de analysator en reagentia duur en vaak enkel de stollingstijd, niet de snelheid en mate van fibrinevorming. De microplaat platform voorkeur voor het meten enzymgekatalyseerde events vanwege gemak, tijd, kosten, klein volume, continue monitoring en high-throughput 8, 9. Microplate assays zijn beschreven voor stolsellysis 10, bloedplaatjesaggregatie11 en stollingsfactoren 12, maar niet voor FV activiteit in menselijk plasma. Het doel van de werkwijze was een microplaat test die FV activiteit tijdens fibrinevorming in menselijk plasma te ontwikkelen.

Deze nieuwe microtiterplaat schetst een eenvoudige, goedkope en snelle analyse van FV activiteit in humaan plasma. De assay gebruikt een kinetische microplaatlezer de absorptieverandering bij 405 nm te volgen tijdens fibrinevorming in humaan plasma (Figuur 1) 13. De assay meet nauwkeurig de tijd initiële snelheid en omvang van fibrine stolselvorming. Het vereist slechts pl hoeveelheden plasma, volledig in 6 min, high-throughput, gevoelig voor 24 80pM FV, en meet de hoeveelheid onbedoeld geactiveerd (1-traps activiteit) en trombine-geactiveerde FV (2-traps activiteit 1-traps activiteit) -) om een ​​volledige beoordeling van de totale functionele activiteit (2-traps activiteit te verkrijgen.

Verspreid intravasCular coagulatie (DIC) is een verworven coagulopathie die het vaakst ontwikkelt van reeds bestaande infecties 14. DIC is geassocieerd met een slechte prognose en verhoogt mortaliteit boven de bestaande pathologie 15. De assay werd aangetoond dat 9 patiënten met DIC, de FV 1-traps, 2-traps, en totale activiteiten verminderd met gemiddeld 54%, 44% en 42% respectievelijk, vergeleken met normale gepoolde humane referentie-plasma (NHP).

De FV microplaat assay gemakkelijk op de activiteit van een stollingsfactor meten. Deze test zal een beter begrip van FV biochemie door een nauwkeurige en volledige meting van de activiteit in onderzoek en klinische instellingen. Deze informatie zal een positieve invloed hebben gezondheidszorg omgevingen door middel van vroegere diagnose en de ontwikkeling van meer effectieve behandelingen voor stollingsstoornissen, zoals DIC.

Protocol

1. Bereiding van FV-deficiënte Human Plasma

  1. Deze methode is een modificatie van de werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Bloom et al. 4.
  2. Zorg voor volledig menselijk bloed uit een toestemmende gezonde volwassen vrijwilligers (man of vrouw, leeftijd 18 - 50 jaar) die niet is het nemen van medicatie. Draag latex handschoenen en een labjas gedurende de gehele procedure.
  3. Bereid 100 ml van 3,2% (w / v) trinatriumcitraat in gedestilleerd water. Plaats 6,0 ml van deze oplossing in afzonderlijke 60 ml spuiten. Verwijder lucht door het indrukken van de plunjer voorzichtig naar de 6,0 ml markering op de spuit.
  4. Gebruik een alcoholdoekje om het gebied van de cubitaal ader tussen biceps en onderarm schoon te maken. Sluit 20 gauge vlinder inrichting voor een 3 ml spuit. Steek vlinder naald in cubitaal ader en trek voorzichtig aan zuiger tot bloed worden gevuld met de 3 ml streepje. Gooi spuit met bloed. Deze stap wordt uitgevoerd om een ​​tissue factor model van het beschadigde endothelium aan de naald te verwijderenletsel site die het stollingsproces kan activeren en interfereren met de voorbereiding van FV-deficiënt plasma.
  5. Sluit vlindernaald tot 60 ml spuit 'geladen' met 6,0 ml trinatriumcitraat en teken voorzichtig op de zuiger tot het bloed bereikt de 60 ml markering op de spuit. (Final citraatconcentratie 10.9mm).
  6. Verwijder de spuit uit vlindernaald en meng spuit terwijl een gehandschoende vinger of duim op de spuit stopcontact.
  7. Blijven er bloed in 60 ml spuiten elk gevuld met 6,0 ml 3,2% trinatriumcitraat zoals hierboven beschreven. Men moet anticiperen terugwinning van ongeveer 50% van de citraatbloed volume plasma na centrifugeren en 50 ul FV-deficiënt plasma nodig per monster in de microplaat assay. Ons laboratorium routinematig verwerkt 300-420 ml citraatbloed tegelijk met 5-7 x 60 ml spuitjes met elk 6,0 ml 3,2% trinatriumcitraat / spuit. Dit is voldoende FV-deficiënt plasma ongeveer 3000 microplaatanalyses (Zie hieronder).
  8. Verwijder de vlinder naald uit de arm vrijwilliger en druk op een steriel gaasje over site van de ader prikken voor 1,0 minuten. Cover site van ader punctie met een steriel verband.
  9. Centrifugeer bij 3300 citraatbloed xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Recover bovenste gele plasma laag om een ​​plastic beker met een roerstaaf met behulp van een plastic transferpipet zorg ervoor dat u de onderste rode en witte bloedcellen laag verstoren.
  10. Meet het volume van het plasma in ml en behouden 100 ul van plasma voor EDTA aanvulling op ijs voor toekomstige protrombinetijd stolsel tijd (PT) testen (zie hieronder).
  11. Voeg langzaam vaste EDTA aan gecitreerd plasma met voorzichtig roeren bij kamertemperatuur 5 mM bereiken (eindconcentratie). Zodra de EDTA is opgelost, de pH op 7,0 door druppelsgewijze toevoeging van 1,0 M NaOH met voorzichtig roeren.
  12. Dek bekerglas met Saran Wrap en incubeer gedurende 8-10 uur zonder roeren bij 37 ° C.
  13. Elke 2 uur, herstellen 100 ulde EDTA-plasma behandeld op ijs en bepalen de PT bij de incubatie met EDTA en vergelijken met de PT van plasma vóór toevoeging EDTA (zie hierboven).
  14. Voor de PT bepalingen, plaats verwijderbare 8 goed immunomodule strips in plastic mal houder en steek deze in microplaatlezer.
  15. Orient immunomodule strips in microplaatlezer als: leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Ook alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk 8 goed immunomodule strip aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder.
  16. De FV microplaat assay kan meten fibrine stolselvorming in ten minste 12 verschillende monsters tegelijkertijd (6 samples per immunomodule strip over 2 immunomodule strips).
  17. Met een meerkanaalspipet, voeg 50 ul HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) totelke microplate goed voor elk monster worden getest. Met een pipet 50 pl normaal menselijk plasma samengevoegd referentie (NHP) of plasma voor toevoeging van EDTA of verschillende incubatietijden na toevoeging van EDTA tot microplate putjes scheiden.
  18. Met behulp van een multi-channel pipet, voeg 50 ul tromboplastine (Zie hieronder voor bereidingswijze) om alle microplaat putten met een plasma te worden getest. Incubeer in microplaat reader bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie.
  19. Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma te schudden gedurende 5 seconden, en de absorptie afgelezen bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten.
  20. Met een meerkanaalspipet, voeg calciumchloride (50 pi 25 mM in gedestilleerd water; 2.1mm final concentratie) om alle van de microplaat putten, wacht 15 sec, en druk op de 'Start' icoon op de microplaat SoftMax Pro menu om de test te beginnen.
  21. Bepaal de PT van de absorptie vs Time profielen SoftMax Pro de tijd om de helft van de maximale toename in absorptie bij 405 nm (het middelpunt van de sigmoïdale absorptie versus tijd curve geproduceerd na tromboplastine en calciumchloride toevoeging. Zie bereiken, figuur 1).
  22. Bereken de FV 1-traps activiteit van de Log Clot Time (sec) tegen log FV Activiteit (eenheden / ml), zoals hieronder geïllustreerd in figuur 2A. Voor kwantificatie doeleinden wordt 1unit van FV activiteit gedefinieerd als de activiteit die aanwezig is in 1.0 ml NHP voor opzettelijke activering van trombine toegevoegd (zie hieronder, Analyseren humaan plasma met FV 1-fase en twee-fase coagulatietest microplaat).
  23. Bereid 4.0L 20 mM HEPES met 0,15 M NaCl in gedestilleerd water onder voorzichtig roeren. Breng de pH op 7,4 met langzame dropwise toevoeging van 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4).
  24. Zorg voor een voldoende lengte van de dialyse buizen en goed naspoelen met gedestilleerd water. Bind een knoop in het ene uiteinde van de slang. Transfer EDTA behandelde plasma dialyse buis met een plastic overdracht pipet, verwijder de lucht, en leg een knoop in het andere uiteinde van de slang.
  25. Voorzichtig hang de EDTA-behandelde plasma in de slang in de HBS met voorzichtig roeren. Bedek met Saran Wrap en dialyseer voor 14-16u onder zachtjes roeren bij 4 ° C.
  26. Verwijder voorzichtig de EDTA-treated/dialyzed plasma in 3,0 ml porties tot 15,0 ml schroef bedekte buizen en behouden 100 ul voor PT-test van 'final' FV-deficiënt plasma op ijs. Sla de FV-deficiënt plasma in bij -80 ° C tot gebruik. Onder de aangegeven omstandigheden de PTS stijging van 10-15 sec voordat EDTA aanvulling tot 90-100 sec 8-10 uur na toevoeging EDTA. De FV-deficiënt plasma bereid door deze methode bevat gewoonlijk minder dan 0,1% van de actieve FV in de startvers menselijk plasma.

2. Bereiding van Thromboplastin

  1. Dialyse is nodig om elke calcium uit het reagens om precies timing fibrine stolselvorming het tijdstip van calciumchloride Naast coagulatie gang kan.
  2. Bereid 100 ml en 20 mM HEPES 4.0L en 0,15 M NaCl in gedestilleerd water in een kunststof beker met voorzichtig roeren. Breng de pH op 7,4 met langzame druppelsgewijze toevoeging van 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4).
  3. Voeg 6,0 ml van HBS, pH 7,4 aan elk flesje van tromboplastinereagens, vervang het deksel, en schud voorzichtig om op te lossen. Incubeer reagens in capped buisjes gedurende 15 min bij kamertemperatuur gedroogd materiaal op te lossen. Schud zachtjes om volledig op te lossen.
  4. Snijd een voldoende lengte van de dialyse slangen, goed spoelen met gedestilleerd water, en af ​​te hechten het ene uiteinde van de slang met een knoop. Overdracht tromboplastine aan dialysebuis, verwijder de lucht, en af ​​te hechten andere uiteinde van de slang met een knoop.
  5. Carefully hangen dialyseslang in 4.0L van HBS, pH 7,4 en voorzichtig bedekt met Saran Wrap roeren bij 4 ° C 14-16 uur.
  6. Breng 3,0 ml van het gedialyseerde tromboplastine tot 15 ml schroef afgesloten buizen en bij -80 ° C tot gebruik.

3. Voorbereiding van FV 1-traps Microplate coagulatietest Activiteit Standard Curves

  1. Ontdooien FV-deficiënt plasma, NHP, en tromboplastine bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voorzichtig los te mengen FV-deficiënt plasma en tromboplastine, over te dragen aan plastic wassen trays te scheiden, en incubeer op ijs. Bewaar de NHP op het ijs na voorzichtig mengen. Store calciumchloride (25 mM in gedestilleerd water) in een aparte bak wassen bij kamertemperatuur.
  2. Bereid 200 ui elk 2-voudige seriële verdunningen van NHP van 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-voudig in HBS, pH 7,4 met 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Vortex putje en incubeer op ijs.
  3. Plaats verwijderbare 8 goed immunomodule strips in pLastic template houder en steek deze in microplaatlezer.
  4. Orient immunomodule strips in microplaatlezer als: leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Ook alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk 8 goed immunomodule strip aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder.
  5. De FV microplaat assay kan meten fibrine stolselvorming in ten minste 12 verschillende monsters tegelijkertijd (6 samples per immunomodule strip over 2 immunomodule strips).
  6. Zet microplaatlezer en toegang SoftMax Pro microplate toepassingssoftware.
  7. Met een meerkanaalspipet maken gelijktijdige toevoeging van FV-deficiënt plasma (50 pl) alle wells microplate monster. Gebruik een pipet 50 ul van de 10 seriële verdunningen van NHP hierboven wells microplate bereid scheiden.
  8. Met een meerkanaalspipet, voeg tromboplastine (50 pl) alle monsterholten. Incubeer in de microplaatlezer bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie.
  9. Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma voor de eerste 5 sec schudden na toevoeging calciumchloride en meet de absorptie bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten daarna. De 5 sec schudden interval wordt niet opgenomen in de berekende stolsel tijden (zie hieronder).
  10. Met behulp van een multi-channel pipet, calciumchloride (50 ul van 25 mM in gedestilleerd water; eindconcentratie 3,5 mm) toe te voegen aan alle monster microplaat putten, wacht 15 sec, drukt u op de 'Start' icoon in de microplaat toepassing in SoftMax Pro van de computer naar het begin assay.
  11. Thij stolsel tijden worden berekend als de tijd in seconden tot aan het midden tussen de minimale en maximale absorptie te bereiken bij 405 nm na tromboplastine en calciumchloride toevoeging.
  12. De beginsnelheid van stolselvorming worden berekend als het percentage toename in absorptie bij 405 nm (mUnits / min) dat de eerste 5 tijdstippen van stolselvorming omvatten in het lineaire deel van de absorptie tegen de tijd curve.
  13. De mate van stolselvorming werd berekend als het verschil tussen de maximale en minimale absorptie bij 405 nm (Eenheden) bereikt tijdens de stolselvorming event.

4. Analyseren humaan plasma met de FV 1-traps en 2-traps Microplate coagulatietest

  1. Ontdooien FV-deficiënt plasma, NHP, plasma monster, en tromboplastine bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voorzichtig los te mengen FV-deficiënt plasma en tromboplastine, over te dragen aan kunststof ELISA wassen trays te scheiden, en incubeer op ijs. Bewaar de NHP en proef plasma op ijsNa voorzichtig mengen. Store calciumchloride (25 mM in gedestilleerd water) in een afzonderlijke ELISA wassen tray bij kamertemperatuur.
  2. Bereid 200 ui elk van 40-voudige verdunningen van NHP en plasma monster in HBS, pH 7,4 met 1,5 ml microcentrifugebuizen. Vortex putje en incubeer op ijs.
  3. Plaats het verwisselbare 8 goed immunomodule strips in plastic mal houder en in te voegen in microplaatlezer.
  4. Alternatieve leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege immunomodule strips van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Gebruik alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk immunomodule strook aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder.
  5. Zet microplaatlezer en toegang SoftMax Pro microplate toepassingssoftware.
  6. Met een meerkanaalspipet, voeg FV-deficiënt plasma (50 pl) alle wells microplate monster. Met een single pipet, voeg 50 ul van 40-voudig verdunde NHP of monster plasma's boven bereid om microplate putten te scheiden.
  7. Met een meerkanaalspipet, voeg tromboplastine (50 pl) alle monsterholten. Incubeer in de microplaatlezer bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie.
  8. Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma voor de eerste 5 sec schudden na toevoeging calciumchloride en meet de absorptie bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten daarna. De 5 sec schudden interval wordt niet opgenomen in de berekende stolsel tijden (zie hieronder).
  9. Met een meerkanaalspipet, voeg calciumchloride (50 pi 25 mM in gedestilleerd water; eindconcentratie 6,25 mm) om alle wells microplate monster onmiddellijk press de 'Start' icoon in de microplaat toepassing in SoftMax Pro van de computer naar de test te beginnen.
  10. Aan het einde van de run, de tijd bepalen, initiële snelheid en omvang van stolselvorming voor 40-voudig verdunde monster NHP en plasma van de absorptie vs tijdprofielen in SoftMax Pro.
  11. Rekening houdend met de 40-voudige verdunning, met de stollingstijd voor elk monster de FV activiteit te berekenen in eenheden / ml van de 1-traps FV activiteit standaardcurve van Log stollingstijd tegen log FV activiteit (Figuur 2A). Dit komt overeen met de FV-1 fase activiteiten of die zonder 'opzettelijke' activering door trombine.
  12. Aangezien FV geactiveerd met trombine de actieve cofactor, FVa 1, een tweede analyse na toevoeging en incubatie met trombine is cruciaal voor nauwkeurige meting van het FV 2-traps activiteit van een plasmamonster (met 'intentionele' activering door trombine toegevoegd).
  13. Voor de FV 2-fase test, bereiden 200-300 pi gezuiverd trombine 18 at 100 nM in HBS, pH 7,4 en geïncubeerd op ijs. Plan 10 pl verdund trombine gebruiken voor elke plasma monster wordt bepaald met de FV twee-fase test.
  14. Verdun 120 pl van de bovenstaande NHP en plasma monster van 40-voudig tot 100 maal met 170 ul HBS, pH 7,4 die 2,8 mm calciumchloride. Voeg 10 ul trombine (10 nM eindconcentratie) aan elk monster. Vortex goed te mengen en bij 37 ° C geïncubeerd gedurende 1 min.
  15. Verdun NHP en plasma monster tot 500-voudig door het toevoegen van 400 ul HBS, pH 7,4, vortex goed en assay 50 pi van elk plasmamonster in de FV 1-traps microplaat test zoals hierboven beschreven.
  16. Bepaal het stolsel tijd voor NHP en elke plasma monster getest van de absorptie vs Time profielen in SoftMax Pro. Rekening houdend met de 500-voudige verdunning met de stollingstijd voor elk monster de FV 2-traps activiteit van het FV berekenen 1-traps standaardcurve van Log stollingstijd tegen log FV activiteit (Figuur 2A).
  17. De totale FV activiteitenty kan dan worden berekend als FV 2-traps activiteit - FV 1-traps activiteit.

Representative Results

Representatieve resultaten - Voorbereiding van FV 1-traps microplaat coagulatietest activiteit standaardcurven

Een representatief voorbeeld van fibrine stolselvorming in de FV assay tijd die door de microplaatlezer wordt geïllustreerd in figuur 1. De FV-test meet nauwkeurig de tijd, initiële snelheid en de omvang van fibrine stolselvorming. Inspectie van de putten na test voltooien bevestigd dat stolselvorming is opgetreden. Alle reacties bereikt ongeveer dezelfde mate van stolselvorming met een algemene verandering in absorptie bij 405 nm van 0,35 tot 0,45 eenheden tussen de start voor absorptie en de maximale absorptie na tromboplastine en calciumchloride toevoeging. Representatieve voorbeelden van FV 1-traps activiteit standaardcurven van Log Clot Tijd (in seconden) vs Inloggen FV Activiteit (Eenheden / ml) en Inloggen initiële snelheid van stolselvorming (in mUnits / min) versus Inloggen FV Activiteit (Eenheden / ml ) voor seriële verdunningen van NHP wordt in figuur 2B, respectievelijk. Montage van de log-log plot van Clot Tijd vs FV 1-activiteit bleek een sterke relatie tussen deze variabelen na lineaire regressie-analyse (Figuur 2A; R2 = 0.980). Montage van de log-log plot van de initiële snelheid van stolselvorming vs FV activiteit ook aangegeven een sterke relatie tussen deze variabelen na lineaire regressie-analyse (Figuur 2B; R2 = 0.983). De relatie van beide Log Clot Tijd en Aanmelden initiële snelheid van stolselvorming vs Inloggen FV activiteit bleef lineair voor NHP verdund tot 512-voudig. Sinds FV circuleert in NHP op ongeveer 12-40 nM 16, de microplaat test is gevoelig voor ca. 24-80pM FV in NHP. Aangezien de dissociatieconstante van de interactie van FVa-FXa-lipide in prothrombinase ongeveer 1 nM 17, FV microplaat test is volledig geschikt voor het meten van niveaus FV in de fysiologisch relevant nM bereik voor FVa functie in protrombinase.

Met behulp van de FV microplaat assay, werd ook vastgesteld dat het normale bereik van FV activiteit in de FV 1-traps activiteit test van 15 gezonde controlepersonen plasma's (Man en Vrouw, Leeftijd 18-20yrs) was (gemiddelde ± standaarddeviatie; Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Dit komt goed overeen met de normale gezonde FV activiteit en bereik (0.66-1.14U/ml) gerapporteerd door Cutler et al.. de FV 1-traps activiteit bepaald met een geautomatiseerde analysator 7. De intra-assay variatie van de tijd, de omvang en initiële snelheid van stolselvorming in de FV 1-fase test in 6 wells op 8 verschillende dagen was 3,4%, 4,4% en 3,1% voor. De inter-assay variatie van de tijd, de omvang en initiële snelheid van stolselvorming in de FV 1-fase test in 6 putjes van 8 verschillende experimenten op 8 verschillende dagen was 7,1%, 7,8% en 9,2% respectievelijk. Dus de intra-en inter-assay variatie van deze drie meetrode variabelen op een laag en aanvaardbaar niveau voor robuuste uitvoering van de assay binnen en tussen microplaat test van meerdere monsters tegelijk (maximaal 12).

Representatieve resultaten - Analyseren menselijk plasma monsters met de FV 1-traps en 2-traps microplaat coagulatietest

De standaardcurve van Log stollingstijd tegen log FV activiteit (Figuur 2A) werd gebruikt om de activiteit FV NHP en 9 DIC patiënt plasma die niet met opzet werden geactiveerd met trombine toegevoegd (FV 1-traps activiteit) of opzettelijk geactiveerd met meten toegevoegd trombine (FV 2-traps activiteit) en de resultaten worden getoond in Tabel 1. Alle 9 DIC patiënt plasma's tentoongesteld FV 1-traps activiteiten en de initiële snelheden van stolselvorming die werden afgenomen met gemiddeld 54% en 18% respectievelijk, van NHP. De mate van stolselvorming in de FV 1-fase test in de DIC patiënten waren niet sterk verschilden van NHP, en namen gemiddeld toe, met 13% van NHP.

Activering van NHP met trombine gegenereerd ongeveer 8-voudige toename in FV 2-traps activiteit boven de FV 1-traps (tabel 1). Dit geeft aan dat de FV in NHP was vooral aanwezig in zijn niet-geactiveerde vorm en is het eens met de eerder gerapporteerde resultaten met behulp van handmatige tilt-buis FV assays 3, 4 en geautomatiseerde FV assays 5-7. De FV 2-traps en totale activiteit werden ook afgenomen in de DIC patiënten gemiddeld met 44% en 42%, respectievelijk, van NHP. De beginsnelheid en mate van stolselvorming in de FV twee-fase test de DIC patiënten niet significant verschillend van NHP en varieerde gemiddeld ca. 9% en 4%, respectievelijk, van die gezien met NHP. Deze resultaten geven aan dat in vergelijking met de FV in NHP, de FV in de DIC patiënt plasma resulteerde in langere tijd en verminderde snelheid van fibrine stolselvorming en dat de patiënt FV was gemiddeld slechts 56% activeerbaar met trombine ook.

ENT "fo: keep-together.within-page =" always "> Figuur 1
Figuur 1. Stolselvorming in normale gepoolde humane referentie plasma gemeten met kinetische microplaat FV 1-fase coagulatietest. Fibrine stolselvorming in NHP werd continu gevolgd bij 405 nm met een kinetische microplaatlezer. De plot is de microplaatlezer uitgang van een 6 min reactie van 32-voudig verdunde NHP, FV-deficiënt plasma, tromboplastine en calciumchloride in een microplaat goed. De verticale as vertegenwoordigt de verandering in absorptie bij 405 nm die ontstaat als gevolg van fibrinevorming in plasma. De tijd van fibrinevorming werd gedefinieerd als de tijd om de helft van de maximale toename in absorptie of het midden van curve (36,40 sec) bereiken. De initiële snelheid van stolselvorming werd gedefinieerd als de verandering van de absorptie bij 405 nm voor de eerste 5 tijdstippen van de lineaire toename van de absorptie van de curve (611,88 mUnits / min). De extent van stolselvorming werd gedefinieerd als het verschil tussen de maximale en minimale absorptie bij 405 nm (0,35 eenheden).

Figuur 2
Figuur 2. Standaard curves van tijd en initiële snelheid van stolselvorming tegen Factor V activiteit in normale samengevoegd menselijk plasma met het referentie FV 1-traps microplaat assay. NHP werd serieel verdund (0 - tot 512-voudig in HBS) en getest met de FV 1-traps microplaat test zoals beschreven in het protocol. Log-log plots van de tijd en initiële snelheid van stolselvorming tegen FV activiteit in de FV 1-traps microplaat test getoond na lineaire regressiemodel van de data in panelen A en B, respectievelijk.

1-fase test Initial Rate (mUnits / min)
Monster 1-fase test Activiteit (Eenheden / ml) 1-fase test Omvang (Units) 2-fase test Activiteit (Eenheden / ml) 2-fase test Omvang (Units) 2-fase test Initial Rate (mUnits / min) Totale activiteit (Eenheden / ml)
NHP 1,02 0.363 744,96 7,93 0.433 375,84 6,91
Patiënt 1 0,36 0.404 583,80 3,84 0.432 249,96 3,48
Patiënt 2 0,67 0.416 704,04 5,28 0.469 323,16 4,61
0,31 0.435 562,08 3,92 0.453 294,96 3,61
Patiënt 4 0,39 0.435 617,04 4,14 0.462 372,60 3,75
Patiënt 5 0,73 0.401 641,40 5,91 0.433 354,24 5,18
Patiënt 6 0,45 0.403 600,72 4,16 0.445 393,96 3,71
Patiënt 7 0,49 0.395 575,40 4,89 0.449 357,48 4,40
Patiënt 8 0,19 0.448 489,00 2,89 0.450 330,48 2,70
Patiënt 9 0,64 0.423 699,48 5,11 0.455 417,24 4,47

Tabel 1 FV activiteit in NHP en in 9 patiënten dat gedissemineerde intravasculaire stolling (DIC). De FV 1-traps, 2-traps, en de totale activiteit in NHP en 9 DIC patiënt plasma werden bepaald uit de FV 1-traps microplaat test standaard tijd curve van stolselvorming tegen FV activiteit (Figuur 2A) en worden in eenheden / ml. De eerste prijs (Initiële verhoging van A405nm gedurende eerste vijf tijdstippen in mUnits / min) en mate (Maximum A405nm - Minimum A405 nm) van stolselvorming in de FV 1 - en 2-traps microplaat assay worden ook getoond.

Discussion

De kinetische microplaat assay methode wordt de ontwikkeling van een nieuwe, snelle, goedkope en geschikte techniek voor het meten van FV stollingsactiviteit in monsters van menselijk plasma die (FV 1-fase test) of met opzet zijn geactiveerd met trombine toegevoegd (FV 2-fase test). De assay gebruikt een kinetische microplaatlezer en materialen en reagentia nodig zijn commercieel verkrijgbaar of kunnen worden gemaakt in-huis. De test bewaakt de verandering in de lichtverstrooiing van plasma tijdens fibrine stolselvorming bij 405 nm. De microplaat test heeft het voordeel dat kleine volumes plasmamonster (ui) en vatbaar voor analyse van meerdere monsters tegelijk (tot 12). Deze assay eigenschappen zijn voordelig wanneer dure apparatuur en reagentia gebruikt (Automated analysatoren en Factor-deficiënt plasma) slechts kleine volumes monster beschikbaar (Patient plasma) of analyse van een groot aantal monsters (FV Tijdens zuivering from plasma).

De FV microplate assay heeft als bijkomend voordeel dat het handig, snel, en vereist geen isolatie en zuivering van de gewenste samenstellende componenten. Vergeleken met handmatige tilt-buis 3, 4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays die zijn gemeld, de FV microplaat test heeft vergelijkbare bruikbare gebied van stolsel keer (25-75 sec) en overeenkomstige FV niveaus in het monster (0.5-,005 Units / ml), en gevoeligheid / detectiegrenzen (20 80pM). Vergeleken met handmatige tilt-tube FV assays die lijden aan een subjectieve visuele beoordeling van stolselvorming 3, 4, de FV microplaat assay maakt objectieve en kwantitatieve meting van de stollingstijd, beginsnelheid en omvang van fibrine stolselvorming. In vergelijking met geautomatiseerde FV assays die kampen met de eis van dure analysers en reagentia 5-7, de FV microplaat assay reagentia en materialen zijn goedkoop en alle benodigde materialen kunnen beslissed commercieel of worden gedaan in-house. Handmatige tilt-buis 3, 4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays algemeen alleen de tijd op stolselvorming, niet de tijd initiële snelheid en omvang van fibrine stolselvorming die nauwkeurig alle spectrofotometrisch gemeten met de microplaat FV assay. Tenslotte handmatige tilt-buis 3,4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays lijden alleen de mogelijkheid om de FV te meten in plasma monsters een voor een, dat de FV microplaat assay vatbaar is voor high-throughput en 12 monsters kan gelijktijdig getest.

De microplaat assay werd aangetoond dat de FV in 9 DIC patiënt plasma was minder actief dan in NHP door een combinatie van een stolsel en lagere initiële snelheden van stolselvorming in de FV 1-fase test. De beginsnelheid van stolselvorming in de FV 2-fase test in het plasma DIC patiënt niet veranderd NHP. De mate van stolselvorming in de DIC patient plasma's werden ook niet veranderd van NHP in de FV 1-traps en 2-traps assays. Verminderde FV 1-traps, 2-traps, en de totale activiteiten kunnen te wijten zijn aan een verhoogde consumptie FV 19 en / of inactivatie 6 in overeenstemming met andere studies in de pathogenese van deze verworven bloedziekte. Gezien de omvang van stolselvorming in de DIC plasma was hetzelfde als waargenomen met NHP, deze variabele was waarschijnlijk een gevolg van de fibrinogeenconcentratie in de FV-deficiënt plasma en niet gerelateerd aan de kenmerken van de patiënt plasma.

De resultaten van de microplaat test aan dat meting van FV in de monsters van humaan plasma kan worden verkregen uit de tijd en initiële snelheid van stolselvorming de FV 1-fase test en de tijd van stolselvorming en totale activiteit van FV 2 - fase test. Het was niet mogelijk om kwantitatieve meting van FV activiteit te verkrijgen in een plasmamonster gebaseerd op de mate van stolselvorming in thij FV 1 - en 2-traps assays of de initiële snelheid van stolselvorming in de FV 2-fase test. Aangezien alle reacties bereikt ongeveer dezelfde mate van stolselvorming van 0,35 tot 0,45 eenheden tussen de initiële absorptie voor en de maximale absorptie na tromboplastine en calciumchloride Bovendien is het meten van de mate van stolselvorming geen kwantitatieve beoordeling van FV activiteit in een aangegeven plasma monster.

De nieuwe assay microplaat vindt gebruik in onderzoek en klinische settings voor het meten van FV in de monsters van humaan plasma en fracties tijdens de zuivering uit humane en dierlijke plasma. De microplaat test kan worden gebruikt om de tijd, beginsnelheid, en mate van stolselvorming meten; parameters niet tegelijkertijd gecontroleerd handmatige tilt tube-assays en geautomatiseerde coagulatie analyzers. Deze informatie geeft meer van een volledige kwantitatieve beoordeling van de betrokkenheid van FV tijdens de stolselvorming evenementin menselijk plasma dan eerder gerapporteerd 3-7. Deze informatie is met name belangrijk in onderzoek en klinische laboratoria bij het meten significante veranderingen in FV in de monsters van plasma of gezuiverd FV of FVa. De FV microplaat test kan ook worden gebruikt om karakteriseren en te meten verbindingen die kunnen activeren of deactiveren FV en FVa, meet de FV activiteit in patiënten met risico op veneuze trombose als gevolg van de FV Leiden mutatie 20, 21 en de activiteit van toezicht FV tijdens de zuivering uit plasma.

De FV microplaat assay gemakkelijk op de activiteit van een stollingsfactor meten in de extrinsieke, intrinsieke of gemeenschappelijke route met een geschikte factor-deficiënt plasma en initiëren reagentia voor fibrinevorming. De test zal een beter begrip van FV biochemie door een nauwkeurige en volledige meting van de activiteit in onderzoek en klinische laboratoria. Ultimately, zal deze informatie een positieve invloed hebben gezondheidszorg omgevingen door middel van vroegere diagnose en de ontwikkeling van meer effectieve behandelingen voor mensen die last hebben met stollingsstoornissen, zoals DIC.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Het onderzoek werd ondersteund met professionele ontwikkeling en onderzoek Startup fondsen van de Universiteit van Ontario Institute of Technology (UOIT) naar Dr John A. Samis en een Canadese Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award voor Irina Levit. De auteurs erkennen Shannon Everett (Teaching and Learning Centre, UOIT) voor haar hulp bij de voorbereiding van de video. De auteurs erkennen Dr Michael E. Nesheim (Vakgroep Biochemie, Queen's University, Kingston, ON) voor zijn mentorschap, inzicht en nuttige discussies. De auteurs erkennen ook Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl hemostase en trombose Centrum, Academisch ziekenhuis Royal Liverpool, Liverpool, UK) voor het verstrekken van de DIC patiënt plasma's gebruikt in de studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Tags

Immunologie Factor V Microplate coagulatietest menselijk plasma intravasculaire coagulatie (DIC) de bloedstolling
Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A.… More

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter