Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Published: April 2, 2012 doi: 10.3791/3823
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1
1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Summary

Het protocol beschrijft een efficiënt en reproduceerbaar modelsysteem om te studeren herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latentie en reactivatie. De test maakt gebruik van homogene sympathiek neuron culturen en maakt het mogelijk om moleculaire dissectie van virus-neuron interacties met behulp van een scala aan hulpmiddelen met inbegrip van RNA-interferentie en expressie van recombinante eiwitten.

Abstract

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) wordt een leven lang latente infectie in de perifere neuronen. Dit latente reservoir is de bron van terugkerende reactivering gebeurtenissen te verzekeren dat de en bijdragen aan klinische ziekte. De huidige antivirale middelen hebben geen invloed op de latente reservoir en er zijn geen vaccins. Terwijl de moleculaire details van lytische replicatie zijn goed gekarakteriseerd, mechanismen die de latentie in neuronen blijven ongrijpbaar. Onze huidige kennis van latentie is afgeleid van in vivo studies met kleine diermodellen, die zijn onmisbaar voor het definiëren van virale gen-eisen en de rol van de immuunrespons. Het is echter niet te onderscheiden specifieke effecten op het virus neuron relatie van meer algemene gevolgen van infectie gemedieerd door immuun-of niet-neuronale ondersteuning cellen in levende dieren. Daarnaast dierproeven is kostbaar, tijdrovend, en beperkt in termen van beschikbare opties voor het manipuleren van gastheerprocessen. Om deze beperkingen te overwinnen, is een neuron-only systeem hard nodig dat reproduceert de in vivo eigenschappen van latentie en reactivatie, maar biedt de voordelen van weefselkweek op het gebied van homogeniteit en toegankelijkheid.

Hier presenteren we een in vitro model gebruik te maken van gekweekte primaire sympathische neuronen van de rat superieure cervicale ganglia (SCG) (figuur 1) tot HSV-1 latentie en reactivatie dat past studie zijn de meeste zo niet alle van de gewenste criteria. Na verwijderen van niet-neuronale cellen, nagenoeg homogene TrkA + neuron kweken geïnfecteerd met HSV-1 in aanwezigheid van acyclovir (ACV) tot lytische replicatie onderdrukken. Na ACV verwijdering, niet-productieve HSV-1 infecties die trouw vertonen aanvaarde kenmerken van latency op efficiënte wijze vastgesteld. Met name lytische mRNAs, eiwitten en infectieuze virus meer detecteerbaar, zelfs in de afwezigheid van selectie, maar latentie-geassocieerde transcript (LAT) expression blijft in neuronale kernen. Virale genomen worden gehandhaafd op gemiddeld aantal kopieën van 25 per neuron en kan worden geïnduceerd om productief te repliceren door te interfereren met PI3-kinase / Akt signalisatie of de eenvoudige intrekking van zenuwgroeifactor 1. Een recombinant HSV-1 codering EGFP gefuseerd met het virale eiwit US11 lytische zorgt voor een functionele, real-time marker voor replicatie voortvloeien uit de reactivering die gemakkelijk wordt gekwantificeerd. Naast chemische behandelingen kunnen genetische methoden zoals RNA-interferentie of genafgifte via lentivirale vectoren succes worden toegepast op het systeem waarmee mechanistische studies die zeer moeilijk, zo niet onmogelijk, bij dieren. Kortom, de SCG op basis van HSV-1 latency / reactivering systeem zorgt voor een krachtige, noodzakelijk instrument om de moleculaire mechanismen die HSV1 latentie en reactivatie in neuronen, van oudsher een puzzel in de virologie waarvan de oplossing kan nieuwe inzichten bieden in het ontwikkelen van nieuwe therapieën die te ontrafelen doelstelling thij latent herpesvirus reservoir.

Protocol

1. Isolatie en Cultuur van SCG Neuronen van Rat embryo's

Om een zinvolle context voor het begrijpen van dit protocol te bieden, en voor een uitgebreide bespreking van eerdere literatuur dat bestaande methoden voor SCG neuron cultuur, inclusief de basis voor het SCG in vitro cultuur, plaat-bekleden van substraten, en de componenten van serum-vrije media, de Verwezen wordt naar referenties 2-4.

  1. Het gebruik van ratten als bron voor SCG neuronen werd uitgevoerd in overeenstemming met de NIH richtlijnen kader van een actieve protocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC).
  2. Voor het begin van de dissectie, voor te bereiden collageen en laminine gecoate 96 well weefselkweek gerechten. Een multi-kanaal pipetteren inrichting vult alle 96 putjes met een oplossing die 0,66 mg / ml rattenstaart collageen. Verwijder onmiddellijk het collageen, dat kan worden teruggewonnen en gebruikt voor maximaal 8 dissecties. Na het verwijderen thij collageen, is het belangrijk de putten te laten drogen onder een laminaire stroming kap. De tijd die nodig drogen afhankelijk van het aantal putten in de schaal. Bijvoorbeeld duurt gewoonlijk ongeveer 5-10 minuten. voor putten in een 96 goed gerecht om te drogen, maar kan tot 30 - 40 min als er een groter formaat 24 goed gerecht wordt gebruikt. Het niet goed drogen de bronnen resulteert in een slechte SCG bijlage. Herhaal vervolgens de procedure met een oplossing van 2 ug / ml laminine. Incubeer de laminine oplossing van ten minste 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde CO 2 incubator totdat u klaar bent om uw plaat neuronen (stap 1.14).
  3. Commercieel verkregen zwangere vrouwelijke ratten worden gedood met behulp van CO 2. Na het spuiten de kadaver met 70% ethanol wordt een U-vormige insnijding gemaakt in de buik. Na het afpellen van de huid, een tweede U-vormige insnijding gemaakt door de buikspier wand. De baarmoeder is zichtbaar bij het optillen van de buikspier laag. Verwijder de baarmoeder en plaats in een 15cm schotel. Open voorzichtig de baarmoeder met behulp van een stompe schaar om beschadiging van de pups binnen. Iedere pup moet worden vrijgesteld van de embryonale weg, de navelstreng doorgesneden, en de pup schoon geveegd met 70% ethanol en Kimwipes.
  4. Werken bij een dissectie afzuigkap, offeren ongeboren E21 jonge ratten door knippen het hoofd van de romp. Doel van de schaar aan de basis van de hals, net boven de schouders. Om de ganglia bloot te leggen, vastpinnen het hoofd (nek-kant naar boven) met behulp van 23 G naalden op drie locaties: i) het ruggenmerg, ii) anterior huid omhoog getrokken over de neus en gespeld, en iii) de slokdarm / luchtpijp moet worden gespeld weg van de basis van de hals.
  5. Zie voor de twee SCG * aan weerszijden van de halsslagader splitsing (twee SCGs per embryo). Het SCG is gelegen net onder de tak. Scheid de SCG uit de bloedvaten door aan de bifurcatie elkaar. Plaats ganglia in 12 ml L15-media (aangevuld met 0,4% D (+)-glucose) in 15 ml conische buis op ijs.

* De SCG is doorschijnend en kleurloos in vergelijking met de ondoorzichtige, gele vetweefsel dat de splitsing omringt. Probeer zoveel mogelijk van de resterende vetweefsel en bloedvaten te verwijderen, voordat het verzamelen van de ganglia.

  1. Herhaal 1.4 en 1.5 totdat alle SCGs worden geoogst van de embryo's.
  2. Voorzichtig centrifugeer de kernen 1 min bij 600 rpm en zuig het medium.
  3. Resuspenderen de ganglia in 1 ml L15-media met trypsine (0,25%, zonder EDTA) en collagenase (1 mg / ml). Gedurende 30 minuten bij 37 ° C, elke 10 minuten roeren.
  4. 10 ml van C-media (1x MEM, 0,4% D (+)-glucose, 2 mM L-glutamine, 10% FBS) bij de trypsine en centrifugeer 1 min bij 600 rpm inactiveren.
  5. Verwijder zoveel mogelijk van de trypsine / collagenase media als mogelijk * en was de ganglia met 10 ml van de C-media. Centrifugeer 1 min bij 600 rpm. Een keer Herhaal deze stap.

* Resterende collagenase zal interferentiesopnieuw met het collageen ondergrond die nodig is voor celhechting op de cultuur plaat.

  1. Verwijder het wassen media en resuspendeer de ganglia in 1 ml C-media en fijnstampen met behulp van 21 G naald bevestigd aan een 5 ml spuit om grote massa's van cellen * distantiëren. Eindig tritureren met 23 G-naald tot de zichtbare klonten kunnen worden gescheiden.

* Zorg ervoor dat u over-Vermaal, omdat dit de cellen beschadigen. Als de trypsine en collagenase behandeling succesvol was, een maximum van vijftien op en neer fietsen met de 21 G-naald, en drie cycli met de 23 G-naald moet voldoende zijn.

  1. Filter de gedissocieerde neuronen door middel van een 70 pm nylon filter [BD Biosciences cel zeef] in een 50 ml conische buis om de resterende klonten te verwijderen.
  2. Trek 10 pi aliquot van de celsuspensie en meng met trypanblauw het aantal levende cellen te bepalen. Tel het aantal cellen dat actief exclude de kleurstof met een hemocytometer.
  3. Verwijder de laminine oplossing uit de 96 en gerechten te wachten in de 37 ° C incubator (zie stap 1.2). Niet de schotel drogen kan direct worden gebruikt voor plating cellen eenmaal de laminine verwijderd. Breng * 5,000-6,000 totale levende cellen (50 - 100 ul per putje) in het collageen en laminine vóórbekleed 96 en weefselkweek schotel. Inclusief 50 ng / ml zenuw groeifactor (NGF) in de C-media.

* Het is van cruciaal belang voor een goede steriele weefselkweek techniek in dienst, omdat antibiotica worden weggelaten uit de groei van media. Bovendien kunnen er aanzienlijke variatie tussen collageen afkomstig van verschillende aanbieders. We hebben consistente resultaten voor heel batches met rattenstaart collageen van Millipore.

  1. Bij DIV (dag in vitro) 1 vervangen C-media wordt gebruikt om de cellen plaat met 50 pi NBM (0,4% D (+) - glucose, 2 mM L-glutamine, B-27 supplement met 50 ng / ml NGF, 5uM aphidicolin en 20 uM 5-fluorouracil [5-fluor-2'-deoxyuridine]. Incubeer de culturen gedurende 5 dagen *. Op dit punt kan trypsinizing en het tellen van de cellen die nog in verschillende bronnen bepalen het aantal neuronen overleven van de anti-mitotische middel behandeling. Gewoonlijk ongeveer 1.000 neuronen blijven per putje in een 96 wells plaat.

* Problemen met schimmel of bacteriële besmetting zijn meestal binnen de eerste 24 uur van de cultuur. Goed te onderzoeken stuk voor stuk zijn voor microbiële groei zijn voor het vervangen van beplating media. Als slechts een beperkt aantal putten worden beïnvloed, kunnen worden behandeld met een verdunde bleekmiddel oplossing, gespoeld met PBS en gedroogd om te gaan met het experiment. Wij raden aan een herhaling van een experiment waar zelfs een beperkt aantal bronnen had microbiële besmetting. Als uitgebreide microbiële verontreiniging wordt waargenomen in de 96 goed gerecht, moet het experiment worden beëindigd.

2. Infectie van SCG Cultgelen met HSV-1 US11-EGFP en de vestiging van Latency

Voor nuttige achtergrondinformatie over virologische technieken, waaronder basic viruspropagatie, het bepalen van virus titer en multipliciteit van infectie (MOI), wordt verwezen naar 5 verwijzen. Voor een bespreking van herpesvirus biologie, wordt verwezen naar 6 verwijzen. Ten slotte wordt de lezer verwezen naar referenties 7-10 van voorafgaande voorbeelden, andere protocollen, en extra achtergrondinformatie met betrekking tot alpha-herpesvirus lytische infectie van SCG neuronen en voor vergelijking met aanpassingen ons protocol om latency en reactivering te bestuderen.

  1. Bij DIV 6 toe acyclovir (ACV) eindconcentratie 100 uM in de bestaande uit in elk putje *. Als bijvoorbeeld elk putje bevat 50 ul Voeg 25 ul van een 300 pM ACV voorraad. Gewoonlijk wordt toegevoegd ACV de nacht vóór infectie, maar kan ook worden toegevoegd 6-8 uur voor infectie.

* Het is exceedingly belangrijk om onnodige fysieke manipulatie van neuron allen tijde voorkomen. Gewoon verwijderen en vervangen van media of het infecteren met het virus voorraden moeten heel voorzichtig en langzaam gebeuren. Anders kan de resulterende mechanische stress een negatieve invloed op neuron levensvatbaarheid.

  1. Bij DIV 7, SCG culturen met HSV-1 US11-EGFP (beschreven in referentie 11) infecteren met een multipliciteit van infectie (MOI) 1 -2 (zie belangrijk reactie op het vaststellen van optimaal MOI) *. Voeg de verdunde virus rechtstreeks aan de bestaande uit de bron. Voeg een mock-geïnfecteerde controle en een lytische infectie positieve controle in de media ontbreekt ACV. Laat de infectie gedurende 2-3 uur verder bij 37 ° C.

* MOI wordt berekend virustiter bepaald door het uitvoeren van een plaque assay in Vero cellen 12 en het aantal plated levende cellen uitgezet per putje in stap 1.14. Deze berekening is alleen nuttig operationele zin,als het totale aantal cellen gezaaid bevat neuronen samen met vervuilende glia, en fibroblasten. Aangezien deze verontreinigende delende cellen gedood door behandeling met anti-mitotische middelen, de effectieve MOI de overlevende neuronen feite groter. Vanaf het eerste begin hoeveelheid van 5.000 - 6.000 levende cellen, ongeveer 1.000 neuronen blijven na de behandeling met anti-mitotische middelen (zoals vastgesteld door trypsinizing en directe cel tellen). De optimale MOI te gebruiken bij het infecteren van neuronale culturen kan enigszins variëren van een virus voorraad voorbereiding naar de volgende. Bij elke nieuwe opstelling van het virus, raden wij u aan een beperkt aantal van de verschillende MOI's van 1 naar 2. Het doel hier is het identificeren van degene die de minste effecten op neuron levensvatbaarheid en de resultaten in het grootste aantal induceerbare reactivering gebeurtenissen (gedefinieerd in punt 3) heeft. De US11-EGFP virus is vooral handig bij het snel optimaliseren van de omstandigheden, maar men kan ook gebruik maken van andere uitlezingen zoals plaque assay of kwantitatievevertegenwoordiger PCR. Het kan helpen om het virus gezuiverd door middel van een sucrose kussen om onzuiverheden die levensvatbaarheid van de cellen te verminderen te verwijderen, maar dit is niet essentieel en niet routinematig uitgevoerd te gebruiken.

  1. Voorzichtig de infectie media met verse NBM met 50 ng / ml NGF en 100 pM ACV *.

* Het is van cruciaal belang als uiterst voorzichtig bij het ​​veranderen van de infectie media. Doel van de punt van de pipet in de wand van de put dan de bodem van de put, en laat de media voorzichtig glijden op de cellen. Zelfs snelle uitwerpen van materiaal uit de pipet kan genereren voldoende kracht om de axons losmaken van het substraat, waardoor de cellen typisch beslag uit een vel cellen. Als slechts een beperkt aantal neuronen losmaken (20-30%), de gevolgen minimaal indien de cellen gezonde weergegeven. De vrijstaande neuronen zijn waarschijnlijk weer vast na verloop van tijd, maar de axonen niet langer mooi worden een uitgebreidd nieuwe axonen zal teruggroeien. Hoewel niet optimaal kan het experiment gaan indien slechts een beperkt aantal putten worden beïnvloed. Bij een ruim detachement van neuronen (70-80%), raden wij inbegrip van de desbetreffende goed (en) in het experiment. Als de meerderheid van putjes bevatten 70-80% vrijstaande neuronen, raden wij aan beëindiging van het experiment. Terwijl de neuronen nog kan weer vast, ze meestal zullen grote pollen vormen. Dit bemoeilijkt een goede beoordeling van de individuele neuronen geactiveerd. Wij raden aan een herhaling van een experiment waarbij putten met vrijstaande neuronen vastgesteld om ervoor te zorgen dat de reactivering tarieven niet werden beïnvloed door verschil in naleving van neuronen aan de putjes.

Daarnaast is het belangrijk altijd rekening houdt met de culturen zo voorzichtig als mogelijk. Mechanische belasting van onnodige, plotselinge bewegingen (waaronder herhaald openen en sluiten van een incubator kamer deur) of krachtige mediatoepassing cOuld compromis de culturen mogelijkheid om HSV-1 latency te ondersteunen, mogelijk resulterend in onaanvaardbaar hoge tarieven van de spontane reactivering in een bepaald experiment.

  1. Handhaving van de culturen voor 6 dagen gedurende welke tijd het virus stelt latency. Tijdens deze periode gebruik maken van een fluorescentiemicroscoop naar neuron gezondheid en US11-EGFP expressie te controleren als een indicator van lytische replicatie. US11-EGFP dient te worden vastgesteld ALLEEN in de controle putten ontbreekt ACV behandeling, wat aangeeft succesvolle primaire infectie en productieve lytische replicatie. Neuronen kunnen vertonen cytopathische effecten, zelfs in de afwezigheid van de productieve virale groei. De geïnfecteerde culturen moeten nauwgezet worden gevolgd en vergeleken met mock-geïnfecteerde neuronen.

3. Reactivering en beoordeling

  1. Bij DIV 14, zorgvuldig de plaats van de ACV-bevattende media met vers medium ontbreekt ACV. Indien van toepassing, onder andere farmacologische (of biologische) variabelen op dit moment. Be sure aan de voorzorgsmaatregelen vermeld in 2.3 volgen.
  2. Meer dan een 5 tot 6 dagen periode, toezicht houden op de levende culturen met behulp van een fluorescentiemicroscoop om neuronen die een reactivering te detecteren. Als alternatief wordt monsters voor andere analyses (eiwit, nucleïnezuur, plaque assay etc).
  3. Bereken de reactivering frequentie tellen van het aantal putjes die EGFP-positieve neuronen en uitdrukken in verhouding tot het totaal aantal monsters putten. Merk op dat EGFP expressie in een afzonderlijke en geen onderscheid tussen een primaire reactivering gebeurtenis na infectie door virusverspreiding. Infectieuze spreiding is opgenomen om een ​​cultuur goed worden een of meer EGFP-positieve neuronen in een goed operationeel gedefinieerd als een reactivering geval onder deze omstandigheden.

* Meerdere reactivering gebeurtenissen kunnen optreden in een cultuur, zoals beschreven in 1. Om een primaire reactivering gebeurtenis virusverspreiding gevolg van reac onderscheiden zendvermogen, kan de inkapseling remmer WEG-150138 worden toegevoegd. Door het blokkeren van inkapseling, besmettelijke virus wordt niet geproduceerd en verspreid als gevolg van reactivering is niet mogelijk. Zo is de EGFP signaal gedetecteerd in de aanwezigheid van WEG-150138 weerspiegelt het aantal onafhankelijke reactivering gebeurtenissen binnen een singe cultuur goed 1,13-15. Merk op dat WAY-150138 is alleen effectief tegen het HSV-1 Patton stam en niet commercieel beschikbaar. Als alternatief voor WAY-150.138, gebruik van de volgende: i) een mutant virus aangetast zijn vermogen te verspreiden naar naburige cellen kunnen worden gebruikt, ii) een reporter virus waarbij EGFP is van een IE promotor, uitgedrukt in de continue aanwezigheid van ACV, iii) een behandeling met PAA of ACV tot de late genexpressie (en besmettelijk virus productie), gevolgd door immunofluorescentie met behulp van antilichamen gericht tegen een IE-gen product te voorkomen.

4. Alternatieve Methoden om Reactivering het gebruik van de test beoordelen

NHOUD "> De resultaten van een individu, een experiment moet worden verkregen van een enkele voorbereiding van SCG. repliceren experimenten kunnen worden uitgevoerd met onafhankelijke SCG de voorbereidingen zo lang als elk replicatieonderzoek werd uitgevoerd met behulp een SCG partij.

  1. Beoordeling van de HSV-1 lytische transcripten. Verzamelen RNA gewenste tijdstippen na verwijdering ACV in de aanwezigheid of afwezigheid van verschillende experimentele inductoren van reactivering. Bij het ​​gebruik van 96 putjes, raden wij aan bundeling van minstens 20 bronnen samen voor elk monster (ongeveer 10 5 cellen per RNA monster). Als alternatief kan SCGs worden uitgeplaat in grotere putten (bijvoorbeeld voor een 24 wells plaat, 4-5 x10 4 cellen te gebruiken / well). Het is zeker mogelijk RNA detecteren van minder dan 20 putjes kleine hoeveelheden betrokken gevolg ongerechtvaardigde gemengd met monster variabiliteit.
  2. Detectie van HSV-1 lytische eiwitten. Verzamel lysaten op een gewenst tijdstip na inductie van reactivering. Voeg 7,5 ul lysisbuffer elk 10 wel in een 96 wei-plaat en analyseren door SDS-PAGE en immunoblotting. Als alternatief kunnen virale eiwitten worden gedetecteerd door indirecte immunofluorescentie microscopie. De eerste platen worden gedaan op een substraat monteerbaar voor beeldvorming, zoals een steriele glazen dekglaasje die vooraf bekleed is met poly-D-lysine (0,2 mg / ml, Sigma) vóór de toepassing van collageen en laminine (zie 1.10) .
  3. Detectie van infectieuze deeltjes. Verzamel kweeksupernatans op reactivering. Voer een plaque assay op monolagen van Vero cellen met seriële verdunningen van het supernatant. Bovendien kan plaque assays worden uitgevoerd met lysaten van culturen bevroren en ontdooid om cel-geassocieerde deeltjes omvatten met titer te bepalen.

5. Representatieve resultaten

Figuur 2A toont een voorbeeld waarbij een uM trichostatine A (TSA), een bekend inductor van reactivering 16-18, wordt toegevoerd aan SCG kweken latent geïnfecteerde met het wild-type HSV1 EGFP-US11 reporter stam. Met TSA, reactivering bereikt 50% van het maximum binnen twee dagen en met 5 dagen reactivering plateaus ongeveer 60% van de putten. Basislijn ('spontane') reactivering is ongeveer 10% in dit experiment en meestal varieert van 10-20% het gebruik van deze in vitro systeem. Maximale reactivering variëren afhankelijk van de reactivering inductor wordt gebruikt. Veel reactivering induceren kan worden toegepast voor de duur van het experiment, omdat zij niet interfereren met productieve virale replicatie, maar dit dient empirisch worden bepaald. Andere inductoren, met inbegrip van alle reagens die de levensvatbaarheid van de neuronen beïnvloedt of belemmert de voltooiing van de virale productieve levenscyclus, kan een tijdelijke impuls toepassing op reactivering uit te lokken.

Hoewel de accumulatie van EGFP-US11 in elke well van het experiment weergegeven in figuur 2A is indicatief reactivering van latentie, maakt geen onderscheid of deUS11-EGFP signaal in individuele neuronen is afgeleid van een onafhankelijke reactivering event of de verspreiding van een virus gereactiveerd door de cultuur. Om het aantal neuronen die een onafhankelijke reactivering gebeurtenissen in elk putje te evalueren, werden culturen voorbehandeld met WAY-150138, een stof die specifiek virale verspreiding blokkeert door het voorkomen van inkapseling van het virale DNA-genoom 13-15. Geïnfecteerde sympathieke neuron culturen werden behandeld met WAY-150138 en reactivering geïnduceerd met TSA. Grote aantallen EGFP-positieve neuronen alleen gevonden in TSA-behandelde putten, in vergelijking met DMSO behandelde controlekweken, waaruit blijkt dat een aantal onafhankelijke reactivering gebeurtenissen per individuele kweek (Figuur 2B).

In onze test wordt het US11-EGFP reporter uitgedrukt van de endogene promoter US11 11. Omdat US11 is een "true-late" of γ 2 viraal lytische gen, wordt virale DNA-replicatie nodig is voor robuuste expressiop. Dit wordt geïllustreerd in figuur 3, als EGFP-US11 accumulatie wordt belemmerd door de viraal DNA-polymerase inhibitor phosphonoacetic zuur (PAA) in culturen geïnduceerd om opnieuw de PI3-kinase remmer LY294002.

Figuur 1
Figuur 1. Schematisch illustreert een typische experimentele protocol volgens de gekweekte neuronen in vitro systeem HSV-1 latentie en reactivatie bestuderen. 1) Na ontleden superieure cervicale kernen (SCG) van E21 ratten worden gedissocieerd neuronen uitgeplaat in 96-well schotels en behandeld met anti-mitotische middelen voor niet-neuronale cellen te verwijderen. 2) Na 6 dagen in vitro (DIV) het kweken geïnfecteerd met recombinant HSV-1 die EGFP gefuseerd met het virus gecodeerd US11 late genen (EGFP-HSV-1) in aanwezigheid acyclovir (ACV) een antiviraal middel bevat dat blokken lytische replicatie. 3) op dag 14 (DIV 14), wordt de acyclovir verwijderd en EGFP-expressiewordt niet herkend. Cultures stabiel kan worden gehandhaafd op deze wijze gedurende 1 maand of meer of een test variabele kan worden toegevoegd aan de mogelijkheid om de reactivering uit te lokken van latentie evalueren. De variabele kan in de vorm van een kleine molecule inhibitor chemische een antilichaam tegen een oplosbare neurotrofine of celoppervlakte-eiwit of een lentivirus dat zich een genspecifieke shRNA of ectopisch tot expressie gebrachte eiwit. Reactivering wordt vervolgens gecontroleerd door het scoren van EGFP-positieve putten in real-time.

Figuur 2
Figuur 2. TSA activeert HSV-1 SCG culturen. SCG kweken werden latent geïnfecteerde zoals beschreven in figuur 1. Bij DIV 14 werd ACV verwijderd en vervangen door media die een uM trichostatine A (TSA). (A) De kweken werden gevisualiseerd en scoorde met behulp van fluorescentie microscopie elke dag na de behandeling met geneesmiddelen voor een periode van 5 dagen. Het percentage van putten ondergaan reactivation in de loop van het experiment wordt vergeleken met controle DMSO behandelde kweken. Percentage reactivering werd berekend door het aantal EGFP-positieve wells van de 20 putjes van een 96 petrischaal. Fout balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. (B) latent geïnfecteerde kweken werden behandeld met TSA en een remmer van virale DNA inkapseling, WAY-150138 (20 ug / ml). Het aantal EGFP + neuronen vergeleken 48 uur na behandeling met de middelen om de controle behandeld met DMSO en WAY-150138. Elk gegevenspunt geeft de verhouding weer van EGFP + neuronen van de 1.000 neuronen in een cultuur goed. Balk toont het gemiddelde percentage van EGFP + neuronen in een put.

Figuur 3
Figuur 3. EGFP detecion is afhankelijk virale replicatie. SCG kweken werden latent geïnfecteerde daarna behandeld met 10 uM LY29004 een bekende inducer van reactivering 1. Reactivering veroorzaakt door LY (blauw) was in vergelijking met degenen die behandeld werden met virale DNA-synthese remmer, phophonoacetic zuur, PAA (300μg/ml, rood) en de twee verbindingen samen (groen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze primaire neuron cultuur en infectie systeem biedt een eenvoudige en effectieve methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen HSV-1 latentie en reactivatie te verkennen. Het systeem trouw recapituleert de algemeen aanvaarde kenmerken van vertraging in de zin van zowel menselijke infecties en in live-diermodellen. Wanneer het virus latent aanwezig in de SCG culturen, kunnen besmettelijke deeltjes en virale lytische genproducten niet worden gedetecteerd. De enige virale genproduct gedetecteerd latent geïnfecteerde neuronen de niet-coderende transcriptie LAT, dat zich ophoopt in kernen. Reactivering samenvalt met expressie van virale genen lytische en mondt uit in de productie van infectieuze deeltjes. Bovendien is deze primaire neuron celkweek model is inspelen op de aanvaarde reactivering-inductoren zoals TSA, die in feite veroorzaakt lytische virale replicatie.

Verschillende chemische inductoren stimuleren reactivering in verschillende mate en met karakteristieke kinetiek. Bijvoorbeeld TSA induceert reproduceerbaar reactivering in 60-70% van de culturen over 5 d waarnemingsperiode. Vergelijkbare niveaus van TSA-geïnduceerde reactivatie zijn gemeld met behulp van latent-geïnfecteerde, gedifferentieerde ratten feochromocytoom PC12 cellen 17 of muizen trigeminus neuron culturen 18. De kinetiek van reactivering we nemen en het onvermogen van TSA 100% van de culturen opnieuw kan heterogeniteit van de capaciteit van de latente genomen worden derepressie geven. In overeenstemming met dit voorstel, de werkzaamheid van TSA-geïnduceerde reactivering neemt naar verluidt als een functie van de tijd in de cultuur 18. In tegenstelling tot de TSA, LY29004 induceert reactivering in 80-90% van de culturen binnen 2-3 d. Verschillen in tot oprichting van latency of MOI waarschijnlijk niet om te corrigeren voor verschillen in de induceerbare reactivering van TSA en LY29004, als onze voorwaarden voor de vaststelling latency reproduceerbaar resulteren in ongeveer 20% van neuronen die het virus gecodeerde latency kont te drukkenociated transcript LAT 1. We hebben echter niet gemeten fractie van virale genoom-positieve cellen, wat de mogelijkheid LY29004 reactivering induceert in een groter aantal neuronen TSA. Hoewel de redenen ten grondslag liggen aan het verschil in capaciteit van TSA en LY20004 om reactivering te induceren moeten nog worden vastgesteld, is het duidelijk anders inducerende middelen kan reactivering te bevorderen met karakteristieke efficiëntie en kinetiek.

Een krachtig aspect van het systeem is de mogelijkheid om wild-type virus of verslaggever stammen die zonder onderscheid zich van een wild-type virus te gebruiken. In tegenstelling tot eerdere celkweek systemen om HSV-1 latency, die zich op mutant HSV varianten die niet in staat waren om productief 16,18,19, beoordeeld in 20 repliceren te bestuderen, ons model systeem is uitgerust met een EGFP-reporter-stam die is niet te onderscheiden van wild-type virus in termen van lytische replicatie-efficiëntie in gekweekte cellen 11. Het gebruik van een EGFP reporter vIrus zorgt voor een gevoelige en duidelijke visuele beoordeling van de latentie en reactivatie. In tegenstelling tot andere verslaggevers, zoals β-galactosidase, die fixatie en lysis van cellen voor analyse vereist, EGFP kan de onderzoeker te zien op de virale staat gedurende het gehele verloop van een experiment, waardoor een eenvoudig, real-time beoordeling van de spontane en geïnduceerde reactivering. Andere methoden, zoals kwantitatieve PCR, kunnen ook worden gebruikt om te kijken naar virale genexpressie patronen EGFP-expressie voorafgaat, aangezien EGFP wordt uitgedrukt als een "echte-laat" gen of virus stammen die een reporter gen missen. Als alternatief kunnen andere reporter virussen waar EGFP is gefuseerd met immediate-early (IE) of vroeg (E) genen worden ontwikkeld. Een voordeel van het gebruik van de "ware-laat" beschreven EGFP-reporter is dat EGFP-expressie is strikt afhankelijk van de virale DNA-synthese, wat aangeeft dat het virus levenscyclus is overgegaan in de laatste fase van gen-expressie geassocieerd met lytische groei. Indeed, "true-laat" EGFP expressie tot een niveau detecteerbaar door visuele inspectie correleert goed met besmettelijke virus productie, een biologische indicator dat productieve reactivering heeft plaatsgevonden. Het blijft echter te bezien of elk neuron dat reactivering begint, zoals gemeten door de productieve cyclus (lytische) expressie van genen, in staat is om verder te komen in de volledige lytische programma aan besmettelijke virus te produceren. Misschien virussen hebben ruimschoots de gelegenheid om af te breken de lytische programma en herstellen latentie. Zo kan verslaggever virussen uiten EGFP gefuseerd met IE of E-eiwitten resulteren in minder betrouwbare reactivering uitlezingen. Vanuit dit oogpunt vergeleken de efficiëntie van reactivering gemeten met EGFP-reporters uitgedrukt van IE, E of late promoters of zelfs een gecombineerde reporter met verschillende fluorescentie reporter proteïnen gefuseerd aan een gen uit elk kinetische klasse (versus E vs laat) zou nuttig zijn. Bovendien kan onze neuronale celcultuur ook worden gebruikt met verschillende HSV-1 stregen, ongeacht hun neuroinvasive potentieel of het vermogen om de immuunrespons 21-24 te reguleren. Tenslotte kan de in vitro hier beschreven worden toegepast op andere neuronale celtypen en ex vivo perifere ganglia kweken verkregen hogere orde soorten, waaronder mensen 25-27.

Door het gebruik van een zuivere populatie van neuronen, gedetailleerde studies van de interacties tussen HSV1 en de neuronale gastheer op moleculair niveau zijn nu mogelijk. Belangrijk is dat dit model systeem vermijdt de vele complexe zaken die verband houden met het bestuderen van latentie en reactivatie bij immunocompetente dieren, waar een hogere mate van controle worden in lagen op de top van fundamentele virus-neuron interacties. Bovendien werk in dit systeem toont duidelijk aan dat er inderdaad een stabiele relatie tussen virus en gastheer neuron dat kan worden vastgesteld en onderhouden zonder hulp van een verworven immuunrespons. Terwijl de aangeboren en ADAPTIVe immuniteit duidelijk een belangrijke rol spelen in de biologie van latente HSV infecties, het virus heeft de intrinsieke capaciteit i) om een ​​niet-productieve infectie lijkt latentie in neuronen vast te stellen; en ii) naar een lytische, productieve replicatie-programma te schakelen in reactie op het milieu en neuronale signalen toegepast op neuronen alleen. Belangrijk is dat de moleculaire basis voor deze unieke relatie tussen HSV en het neuron nu worden ontleed met behulp van celbiologische, farmacologische, gene silencing, en gen delivery tools 1. Studies van deze soort die gericht zijn op het neuron en virus op zichzelf zijn niet mogelijk in diermodellen waar verschillende soorten cellen bezetten de ganglial compartiment. We hopen dat met behulp van dit model systeem, een beter begrip van het complexe moleculaire schakeling HSV-1 latentie in neuronen reguleren kan eindelijk worden bereikt. Indien mogelijk, kan principes afgeleid uit deze gekweekte neuron systeem vervolgens worden getest in vivo met behulp van gevestigde dier models, ter illustratie van het complementaire karakter van deze twee benaderingen van de totale studie van HSV-1 latentie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken de reviewers voor hun doordachte suggesties die heeft geholpen bij dit manuscript te verbeteren. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) en IM (AI073898, GM056927) van de NIH. MK werd mede ondersteund door een NIH-subsidie ​​training (5T32 AI007180).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
  2. Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).
  3. Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).
  4. Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).
  5. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).
  6. Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).
  7. Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
  8. Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
  9. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
  10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
  11. Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
  12. Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
  13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
  14. Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
  15. Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
  16. Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
  17. Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
  18. Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
  19. Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
  20. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
  21. Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
  22. Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
  23. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
  24. Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
  25. Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
  26. Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
  27. Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).

Tags

Immunologie neuron celkweek Herpes Simplex Virus (HSV) moleculaire biologie virologie
Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, … More

Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., Mohr, I. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter