Summary
הפרוטוקול מתאר את מערכת מודל יעיל לשחזור ללמוד הרפס סימפלקס סוג הנגיף 1 (HSV-1) ההשהיה מחדש. Assay מעסיקה הומוגניות תרבויות נוירונים אוהדים ומאפשר לנתיחה מולקולרית של וירוסים נוירונים אינטראקציות באמצעות מגוון של כלים, כולל התערבות RNA וביטוי של חלבונים רקומביננטיים.
Abstract
הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) קובע דלקת כל החיים סמויה בנוירונים פריפריאליים. זה המאגר סמויה היא המקור של אירועים חוזרים מחדש כי להבטיח שידור ולתרום מחלה קלינית. אנטי הנוכחי אין השפעה על המאגר סמויה ויש חיסונים לא. בעוד את הפרטים המולקולריים של שכפול ממס הם מאופיינים היטב, מנגנוני השליטה חביון בנוירונים להישאר חמקמקה. ההבנה הנוכחית שלנו של חביון נגזר במחקרים vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים קטנים, אשר היו הכרחיים להגדרת דרישות גנים נגיפיים ואת התפקיד של המערכת החיסונית. עם זאת, אי אפשר להבחין בין השפעות ספציפיות על היחסים וירוסים נוירון מ השלכות כלליות יותר של זיהום בתיווכו של תאים חיסוניים תמיכה או לא העצבית בעלי חיים. בנוסף, ניסויים בבעלי חיים הוא יקר, זמן רב, ומוגבל מבחינת האפשרויות הזמינות עבור מניפולציה מארחתהליכים. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מערכת העצב בלבד יש צורך נואש זה מתרבה במאפייני vivo של חביון מחדש אבל מציע את היתרונות של התרבות רקמת מבחינת ההומוגניות ונגישות.
כאן אנו מציגים מודל במבחנה תוך שימוש בתרבית נוירונים אוהדים העיקרית מן הגרעינים עכבר מעולה צוואר הרחם (SCG) (איור 1) ללמוד HSV-1 חביון מחדש המתאימה ביותר, אם לא כל הקריטריונים הרצויים. לאחר ביטול שאינם עצביים תאים, כמעט הומוגנית TrkA + תרבויות נוירונים נגועים HSV-1 בנוכחות acyclovir (ACV) לדכא את שכפול ממס. הסרת הבאה ACV, לא פרודוקטיביים HSV-1 זיהומים בנאמנות התערוכה סימני ההיכר המקובלים חביון מבוססים ביעילות. יש לציין, mRNAs ממס, חלבונים, וירוס מדבק להיות בלתי ניתן לגילוי, גם בהיעדר בחירה, אבל ההשהיה הקשורים (LAT) תעתיק אקספרסיון מתעקש גרעינים העצבית. הגנום הנגיפי נשמרים במספר עותק ממוצע של 25 לכל תא עצב יכול להיגרם פרודוקטיבית לשכפל ידי הפרעה PI3-kinase / Akt איתות או נסיגה פשוטה של גורם הגדילה העצבי 1. רקומביננטי HSV-1 EGFP קידוד קיבע את החלבון הנגיפי Us11 ממס מספק פונקציונלי, בזמן אמת סמן שכפול כתוצאה מחדש כי הוא לכמת בקלות. בנוסף טיפולים כימיים, שיטות גנטיות כגון משלוח RNA-הפרעות או הגן באמצעות וקטורים lentiviral ניתן ליישם בהצלחה למערכת המתיר מחקרים מכניסטית שקשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי, אצל בעלי חיים. לסיכום, SCG מבוסס HSV-1 חביון / הפעלה מחדש המערכת מספקת כלי רב עוצמה, צריך לפענח את המנגנונים המולקולריים השולטים HSV1 חביון מחדש בנוירונים, פאזל ארוכת ב וירולוגיה שפתרונה עשוי להציע תובנות חדשות בפיתוח טיפולים חדשים המטרה לאהוא רדום מאגר ההרפס.
Protocol
1. בידוד והתרבות של הנוירונים SCG מעוברים עכברוש
כדי לספק הקשר שימושי להבנת בפרוטוקול זה, וגם לדיון מקיף בספרות קודם לכן בשיטות שנקבעו התרבות נוירון SCG, כולל בסיס SCG בתרבות חוץ גופית, צלחת ציפוי מצעים, ואת מרכיבי סרום ללא מדיה, הקורא נקרא הפניות 2-4.
- השימוש של חולדות כמקור נוירונים SCG נערך על פי הנחיות NIH תחת פרוטוקול שאושר על ידי טיפול פעיל בעלי חיים מוסדי & ועדת שימוש (IACUC).
- לפני תחילת לנתיחה, להכין קולגן laminin מצופה 96 גם תרבות מנות רקמות. באמצעות מכשיר רב ערוצי pipetting, למלא את כל 96 בארות עם פתרון המכיל 0.66 מ"ג / מ"ל עכברוש קולגן הזנב. מיד להסיר את הקולגן, אשר ניתן לשחזר ושימשו עד 8 והניתוחים. לאחר הסרת tהוא קולגן, חשוב מאוד לתת את בארות יבש מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. משך הזמן שנדרש כדי לייבש תלוי במספר בארות בצלחת. לדוגמה, בדרך כלל נדרשים כ 5-10 דקות. על בארות מנה 96 גם להתייבש, אבל עשוי להימשך עד 30-40 דק 'אם 24 גדול יותר המנה גם בפורמט משמש. אי כמו שצריך לייבש את התוצאות בארות מצורף SCG עניים. ואז לחזור על התהליך באמצעות פתרון של 2 מיקרוגרם / מ"ל laminin. דגירה פתרון laminin של שעה לפחות 2 ב 37 ° C ב-CO 2 humidified חממה עד שתהיה מוכן לצלחת הנוירונים שלך (שלב 1.14).
- שהתקבלו מסחרית חולדות נקבות הרות מורדמים באמצעות CO 2. לאחר ריסוס פגר עם אתנול 70%, חתך בצורת נעשה סביב הבטן. לאחר לקלף את העור, חתך 2 בצורת נעשה דרך קיר שרירי הבטן. הרחם גלוי על הרמת שכבת שרירי הבטן. להסיר את הרחם ואת מקום 15 ס"מ צלחת. בזהירות לפתוח את הרחם באמצעות מספריים בוטה כדי למנוע נזק לגורים מבפנים. כל גור חייב להשתחרר מן השק העוברי שלו, את חבל הטבור ניתק, ואת הגור נמחק עם אתנול Kimwipes 70%.
- עבודה על מכסה המנוע לנתיחה, להקריב שטרם נולדו גורי עכברים E21 ידי מריחה את הראש מן הגוף. לכוון את המספריים בבסיס הצוואר, מעל הכתפיים. לחשוף את הגרעינים, להצמיד את הראש (הצוואר כלפי מעלה) באמצעות מחטים 23-G בשלושה מקומות: א) חוט השדרה, ב) העור הקדמי עצר על האף והצמיד, ו-III) הושט / קנה הנשימה יש ניצח משם מבסיס הצוואר.
- חפשו * 2 SCG ממוקם משני צדי הסתעפות העורק הראשי (שני SCGs לכל העובר). SCG נמצא ממש מתחת לענף. הפרד SCG מן העורקים על ידי משיכת הסתעפות מזה. מניחים את הגרעינים לתוך 12 מ"ל של L15-Media (בתוספת 0.4% D (+), גלוקוז) בצינור 15 מ"ל חרוטי על הקרח.
ss = "jove_content"> * SCG הוא שקוף וחסר צבע בהשוואה לרקמות, אטום השומן הצהבהב המקיף את הסתעפות. נסה להסיר כמה רקמות של כלי דם שאריות השומן, לפני איסוף הגרעינים.
- חזור על 1.4 ו - 1.5 עד שכל SCGs נקצרים מן העובר.
- בעדינות בצנטריפוגה הגרעינים 1 דקות ב 600 סל"ד ו לשאוב התקשורת עודף.
- Resuspend הגרעינים ב 1 מ"ל של L15-מדיה המכילה טריפסין (0.25%, ללא EDTA) ו collagenase (1 מ"ג / מ"ל). דגירה למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להתסיס כל 10 דקות.
- הוסף 10 מ"ל של C-Media (1x ספורט, 0.4% D (+), גלוקוז, 2 מ"מ L-גלוטמין, FBS 10%) כדי להשבית טריפסין ו צנטריפוגות 1 דקות ב 600 סל"ד.
- להסיר כמה שיותר את טריפסין / collagenase מדיה כמו * ניתן לשטוף הגרעינים עם 10 מ"ל של C-Media. סרכזת 1 דקות ב -600 סל"ד. חזור על פעולה זו פעם אחת.
* Collagenase שיורי יהיה interfeמחדש עם מצע קולגן הנדרש מצורף התא על הצלחת התרבות.
- הסר את המדיה לשטוף מחדש להשעות את הגרעינים של 1 מ"ל של C-Media ו triturate באמצעות מחט 21 G מצורף מזרק 5 מ"ל לנתק גושים גדולים של תאים *. סיום triturating עם מחט 23 G עד גושים הנראים לעין הם ניתק.
* היזהרו שלא יתר triturate, כמו זה יהיה לגרום נזק לתאים. אם טריפסין וטיפול collagenase היה מוצלח, לכל היותר 15 למעלה ולמטה מחזורים עם מחט 21 G, ושלושה מחזורים עם מחט 23 G צריך להספיק.
- לסנן את הנוירונים הסתייגותם באמצעות ניילון 70 מיקרומטר מסנן [BD תא Biosciences מסננת] לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל כדי לבטל את כל גושי הנותרים.
- לסגת aliquot μl 10 ההשעיה התא מסוננים ומערבבים עם trypan כחול כדי לקבוע את מספר תאים חיים. ספור את מספר התאים באופן פעיל למעטאודה צבע באמצעות hemocytometer.
- הסר את הפתרון laminin מתוך 96 מנות גם ממתינים 37 ° C חממה (ראה שלב 1.2). לא לייבש את המנה, ניתן להשתמש בו באופן מיידי עבור תאים ציפוי פעם laminin מוסר. * Quick לוותר 5,000-6,000 תאים חיים בסך הכל (50-100 μl לכל גם) אל קולגן ו laminin מראש מצופה 96 מנה גם בתרבית רקמה. כוללים 50 ng / ml גורם הגדילה העצבי (NGF) ב C-Media.
* זה קריטי להעסיק תרבות טובה סטרילית טכניקת רקמות בגלל אנטיביוטיקה מושמטים מהתקשורת הצמיחה. בנוסף, לא יכולה להיות שונות משמעותית בין קולגן שמקורו מן ספקים שונים. היו לנו תוצאות עקביות על פני קבוצות באמצעות הזנב קולגן עכברוש מ Millipore.
- ב DIV (יום במבחנה) 1, להחליף את ה-C-Media פעם הצלחת התאים עם NBM 50 μl (0.4% D (+) - גלוקוז, 2 מ"מ L-גלוטמין, B-27 תוסף המכיל 50 ng / ml NGF, 5aphidicolin מיקרומטר ו 20 מיקרומטר 5-fluorouracil [5-Fluoro-2'-deoxyuridine]. דגירה התרבויות במשך 5 ימים *. בשלב זה, trypsinizing וספירת התאים שנותרו בארות כמה יכול לקבוע את מספר הנוירונים ששרדו טיפול אנטי mitotic הסוכן. בדרך כלל, כ -1,000 לכל הנוירונים להישאר גם בצלחת 96 באר.
* בעיות עם זיהום פטרייתי או חיידקי בדרך כלל לידי ביטוי ב -24 שעות הראשונות של התרבות. לבחון כל טוב בקפידה על התפתחותם של חיידקים לפני החלפת מדיה ציפוי. אם רק מספר מצומצם של בארות מושפעים, הם יכולים להיות מטופלים עם פתרון לדלל אקונומיקה, לשטוף עם PBS מיובשים כדי להמשיך עם הניסוי. מומלץ לחזור על כל ניסוי שבו גם מספר מצומצם של בארות היה זיהום מיקרוביאלי. אם זיהום מיקרוביאלי רב הוא ציין בצלחת 96 ובכן, הניסוי חייב להסתיים.
2. זיהום של SCG פולחןures עם HSV-1-Us11 EGFP והקמת המתנה
על רקע שימושי על טכניקות virological, כולל הפצת וירוס בסיסי, כייל הנגיף הקובע, ועל ריבוי של זיהום (משרד הפנים), הקורא נקרא הפניה 5. לדיון ביולוגיה ההרפס, הקורא נקרא הפניה 6. לבסוף, קורא מכונה הפניות 7-10 לדוגמאות הקודמות, פרוטוקולים אחרים, רקע נוסף על אלפא הרפס זיהום ממס של נוירונים SCG ועל השוואה עם עיבודים פרוטוקול שלנו ללמוד חביון מחדש.
- ב DIV 6, להוסיף acyclovir (ACV), 100 מיקרומטר הסופי ריכוז התקשורת הקיימים * כל טוב. לדוגמה, אם זה גם מכיל 50 μl, הוסף 25 μl של המניה 300 מיקרומטר ACV. בדרך כלל, ACV נוסף אמש זיהום, אך ניתן גם להוסיף 6-8 שעות לפני ההדבקה.
* זהו לשעברחשוב ceedingly לצמצם מניפולציה גופנית מיותרת של נוירון בכל עת. כל שעליך לעשות הוא להסיר והחלפת התקשורת או הדבקה עם מניות וירוס יש לעשות זאת בעדינות רבה ולאט. אחרת, לחץ מכני וכתוצאה מכך עשויה להשפיע לרעה על יכולת הקיום נוירון.
- ב DIV 7, להדביק את התרבויות SCG עם HSV-1-Us11 EGFP (המתואר נ"צ 11) על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) בין 1 ל -2 (ראה הערה חשובה למטה על קביעת משרד הפנים אופטימלי) *. הוסף את הנגיף מדולל ישירות התקשורת הקיימים היטב. כלול שליטה מדומה נגוע בקרת זיהום ממס חיובית בתקשורת חסרי ACV. אפשר זיהום להמשיך במשך שעות 2-3 ב 37 ° C.
* משרד הפנים מחושבת באמצעות כייל הנגיף נקבע על ידי ביצוע assay פלאק בתאי Vero 12 ומספר, מצופה בתאים חיים שנזרעו לכל גם בשלב 1.14. חישוב זה שימושי רק במובן המבצעי,ככל שמספר התאים הכולל seeded מכיל נוירונים יחד עם גליה מזהמים, fibroblasts. כל אלה התאים המתחלקים מזהמים נהרגים על ידי טיפול אנטי mitotic סוכנים, יעיל משרד הפנים על הנוירונים ששרדו הוא למעשה גדול יותר. מהכמות החל ראשונית של 5,000 - 6,000 תאים חיים, כ -1,000 נוירונים להישאר אחרי טיפול עם mitotic נגד סוכנים (כפי שנבחנו על ידי ספירת תאים trypsinizing וישיר). אופטימלית משרד הפנים להשתמש בעת הדבקה של תרבויות עצביים יכולים להשתנות במקצת הכנה 1 המניות וירוס למשנהו. בהכנת כל חדש של וירוס, מומלץ לבדוק מגוון מצומצם של משרד הפנים שונה של 1-2. המטרה כאן היא לזהות אחד שיש לו את ההשפעה הכי פחות כדאיות גבי תא עצב וכתוצאה מכך המספר הגדול ביותר של אירועים מושרה מחדש (כהגדרתו בסעיף 3). וירוס Us11-EGFP מועיל במיוחד במהירות אופטימיזציה התנאים אך ניתן גם להשתמש readouts אחרים כגון assay פלאק או quantitative PCR. זה עשוי לעזור להשתמש וירוס מטוהרים באמצעות כרית סוכרוז כדי להסיר זיהומים להפחית כדאיות התא, אם כי זה לא חיוני ולא ביצע באופן שגרתי.
- בזהירות להחליף את התקשורת זיהום NBM טרי המכיל 50 ng / ml NGF ו 100 מיקרומטר * ACV.
* חשוב ביותר להיות עדין מאוד בעת שינוי בתקשורת זיהום. לכוון את קצה פיפטה בקיר הבאר ולא בתחתית הבאר, ולאפשר התקשורת כדי להחליק בעדינות אל התאים. גם פליטה מהירה של מדיה מן פיפטה יכול לייצר מספיק כוח כדי לנתק את האקסונים מן המצע ולגרום לתאים להשיל מעליו בדרך כלל כסיד של תאים. אם רק מספר מוגבל של נוירונים לנתק (20-30%), התוצאות הן מינימליות בתנאי התאים נראים בריאים. הנוירונים מנותקים צפויים לצרף לאורך זמן, עם זאת, את האקסונים כבר לא יוארך יפהד אקסונים חדשים יהיה לגדל מחדש. אמנם לא אופטימלי, הניסוי יכול להמשיך אם רק מספר מצומצם של בארות מושפעות. אם יש ניתוק נרחב של נוירונים (70-80%), לא מומלץ כולל גם הנגוע (ים) בניסוי. אם רוב בארות מכילים נוירונים מנותקים 70-80%, אנו ממליצים לסיים את הניסוי. בעוד הנוירונים עדיין לצרף, הם בדרך כלל יהוו גושים גדולים. זה מסבך את הערכה נכונה של נוירונים בודדים מחדש. מומלץ לחזור על כל ניסוי שבו בארות עם הנוירונים מנותקים נצפו על מנת להבטיח כי שיעורי מחדש לא הושפעו דבקות ההפרש של נוירונים וולס.
בנוסף, חשוב תמיד להתמודד עם תרבויות בעדינות ככל כנראה. הלחץ המכני של תנועות מיותרות פתאומיים (כולל פתיחה וסגירה חוזרת של דלת תא חממה) או תקיפה התקשורת יישום גפשרה ולד היכולת תרבויות לתמוך HSV-1 חביון, אולי וכתוצאה מכך שיעור גבוה בלתי מתקבל על הדעת של הפעלה מחדש ספונטנית בניסוי נתון.
- לשמור על התרבויות למשך 6 ימים שבמהלכם וירוס יקבע חביון. במהלך תקופה זו, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לעקוב אחר נוירון בריאות Us11-EGFP ביטוי אינדיקטור שכפול ממס. Us11-EGFP יש לאתר רק את בארות בקרה חסרי טיפול ACV, המציין זיהום ראשוני מוצלח שכפול ממס פרודוקטיבי. נוירונים עשוי להראות תופעות cytopathic גם בהיעדר צמיחה ויראלית פרודוקטיבית. התרבויות נגועים יש לעקוב מקרוב לעומת מעושה נגועים נוירונים.
3. והערכה מחדש
- ב DIV 14, בזהירות להחליף את ACV המכילים התקשורת עם התקשורת טריים חסרי ACV. במידת הצורך, כולל תרופתי (או ביולוגי) משתנים בשלב זה. להיות שליור עקוב אחר אמצעי הזהירות האמורים 2.3.
- במשך 5-6 ימים, לפקח על תרבויות חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאתר נוירונים העוברים מחדש. לחלופין לאסוף דגימות עבור סוגים אחרים של ניתוחים (חלבונים, חומצות גרעין, assay וכו 'פלאק).
- חשב את התדר מחדש על ידי ספירת מספר בארות המכילים EGFP חיובי נוירונים ולהביע את זה כשיעור מכלל הבארות לדוגמה. שים לב כי הביטוי EGFP אצל אדם גם אינו מבחין בין אירוע מחדש העיקרי לזיהום לאחר מכן בשל התפשטות הנגיף. מאז התפשטות מדבקת הכלול לתרבות אחד טוב, אחד או יותר EGFP חיובי נוירונים גם מוגדר מבצעית בתנאים אלה כאירוע 1 מחדש.
* אירועים מחדש מרובות יכולות להתרחש בתרבות, כמתואר 1. כדי להבחין בין אירוע מחדש העיקרי של התפשטות ויראלית כתוצאה reac tivation, מעכב encapsidation WAY-150138 ניתן להוסיף. על ידי חסימת encapsidation, וירוס מדבק אינו מיוצר ולהתפשט כתוצאה מחדש אינו אפשרי. לפיכך, האות EGFP זוהה בנוכחות WAY-150138 משקף את מספר האירועים מחדש עצמאיים בתרבות לחרוך גם 1,13-15. הערה ככה-150138 הוא יעיל רק נגד זן HSV-1 פאטון ולא זמין מסחרית. כחלופה WAY-150138, שקול להשתמש בכל אחד מאלה: א) וירוס מוטנטי פגיעה ביכולתה להתפשט תאים שכנים יכול להיות מנוצל, ב) וירוס כתב שם EGFP בא לידי ביטוי מן האמרגן IE בנוכחות רציפה של ACV, טיפול iii) עם PAA או ACV למנוע ביטוי גנים המאוחרת (וייצור וירוס מדבק) ואחריו באמצעות נוגדנים המכוונים נגד immunofluorescence המוצר גן IE.
4. שיטות חלופיות כדי להעריך באמצעות הפעלה חוזרת Assay
"ontent> תוצאות הניסוי, אדם אחד יש לקבל הכנה אחת של SCG. ניסויים לשכפל ניתן לבצע עם ההכנות SCG עצמאיות, כל עוד כל אחד לשכפל נערך באמצעות אצווה SCG אחת.- הערכת HSV-1 תמלילי ממס. איסוף RNA בזמנים הרצויים לאחר הסרת ACV בנוכחות או העדר inducers ניסיוניים שונים של הפעלה מחדש. כאשר משתמשים 96 צלחות תרבות גם, מומלץ איגום לפחות 20 בארות יחד מדגם זה (בערך 10 5 תאים לדגימה RNA). לחלופין, ניתן SCGs מצופה בבארות גדולים יותר (למשל, על צלחת 24 ובכן, להשתמש 4-5 X10 4 תאים / טוב). אמנם זה בהחלט ניתן לזהות RNA פחות מ 20 ולס, בנפחים קטנים התוצאה מעורב שונות המדגם אל המדגם לא מוצדקת.
- זיהוי של HSV-1 חלבונים ממס. איסוף lysates בשעה שתקבע לאחר גיוס של הפעלה מחדש. הוספת 7.5 μl של חיץ תמוגה כל אחד 10 Wאמות בצלחת 96 גם ולנתח ידי SDS-PAGE ו immunoblotting. לחלופין, חלבונים נגיפיים ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence עקיפה. ציפוי ראשוני חייב להיעשות על מצע mountable הדמיה כגון coverslip כוס סטרילית, כי כבר מראש מצופה עם פולי-D-ליזין (0.2 מ"ג / מ"ל, Sigma) לפני היישום של קולגן laminin (ראה 1.10) .
- זיהוי של חלקיקים מזהמים. איסוף supernatant התרבות על הפעלה מחדש. בצע assay פלאק על monolayers של תאים Vero באמצעות סדרה של דילולים supernatant. בנוסף, מבחני פלאק יכול להתבצע באמצעות lysates של להקפיא להפשיר תרבויות לכלול תאים הקשורים חלקיקים כדי לקבוע titer.
5. נציג תוצאות
איור 2 א ממחיש דוגמה שבה trichostatin 1 מיקרומטר (TSA), inducer ידוע מחדש 16-18, מוחל על SCG תרבויות נגועים רדום עם wild-type HSV1 EGFP-Us11 כתב מתח. עם ה-TSA, הפעלה מחדש מגיע 50% לכל היותר בתוך 2 ימים, 5 ימים על ידי מישורים מחדש ב 60% בערך של וולס. קו הבסיס ('ספונטני') מחדש הוא כ 10% בניסוי זה בדרך כלל נע בין 10-20% שימוש במערכת במבחנה. רמות מחדש מקסימום להשתנות בהתאם inducer מחדש מנוצל. Inducers מחדש רבים ניתן ליישם למשך הניסוי כפי שהם אינם מפריעים שכפול נגיפי יעיל, אבל זה צריך להיקבע באופן אמפירי. Inducers אחרים, כולל מגיב כל כך משפיע על יכולת הקיום של הנוירונים או מעכבת את השלמת מחזור החיים של נגיפי יעיל, עשוי לדרוש יישום הדופק חולף לעורר מחדש.
למרות הצטברות של EGFP-Us11 היטב זה את הניסוי המתואר באיור 2 א מעיד על הפעלה מחדש של חביון, הוא אינו מבחין ביןUs11-EGFP האות נוירונים בודדים נגזר האירוע מחדש עצמאית, או את התפשטות הנגיף מחדש דרך התרבות. כדי להעריך את מספר הנוירונים שעברו אירועים עצמאיים מחדש גם כל התרבויות היו מראש שטופלו בדרך-150138, תרכובת ספציפית חוסם התפשטות ויראלית על ידי מניעת encapsidation של ה-DNA הנגיפי בגנום 13-15. נגועים תרבויות נוירונים אוהדים טופלו WAY-150138 ו מחדש המושרה עם ה-TSA. מספרים משמעותיים של EGFP חיובי נוירונים התגלו רק בארות TSA שטופלו לעומת DMSO שטופלו תרבויות שליטה, הוכחת כי מספר אירועים עצמאיים מחדש להתרחש בכל תרבות אדם (איור 2 ב).
ב assay שלנו, הכתב Us11-EGFP בא לידי ביטוי מן האמרגן Us11 אנדוגני 11. מאז Us11 הוא "נכון, בסוף" או γ 2 הגן ממס ויראלי, שכפול ה-DNA הנגיפי נדרש expressi חזקיםב. זו באה לידי ביטוי באיור 3, כמו EGFP-Us11 הצטברות נפגעת על ידי חומצה נגיפי DNA פולימרז מעכב phosphonoacetic (PAA) בתרבויות המושרה על מנת להפעיל מחדש עם LY294002 PI3-kinase מעכבי.
באיור 1. סכמטי הממחיש פרוטוקול הניסוי טיפוסי באמצעות נוירון תרבותי במערכת במבחנה ללמוד HSV-1 חביון מחדש. 1) לאחר לנתח הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) מ E21 חולדות, הנוירונים הם הסתייגותם מצופה ב 96 הכלים גם והתייחסו עם mitotic נגד סוכני להסיר תאים שאינם עצביים. 2) לאחר 6 ימים במבחנה (DIV) התרבויות נגועים רקומביננטי HSV-1 המכיל EGFP התמזגו לגן Us11 וירוס המקודד המאוחרת (EGFP-HSV-1) של התרופה acyclovir נוכחות (ACV), כי נגיפים אבני שכפול ממס. 3) ביום 14 (DIV 14), acyclovir יוסר EGFP ביטוילא זוהה. תרבויות יכול להישמר ביציבות במשך חודש 1 או יותר בצורה זו או משתנה הבדיקה ניתן להוסיף על מנת להעריך את יכולתו לעורר מחדש של חביון. המשתנה יכול להיות בצורה של מעכב כימית מולקולה קטנה, נוגדנים נגד neurotrophin מסיסים או משטח חלבון התא, או lentivirus להביע גם shRNA גן ספציפי או חלבון הביע ectopically. מחדש מנוטר אז הבקיע EGFP חיובי בארות בזמן אמת.
איור 2. TSA מקים HSV-1 בתרבויות SCG. תרבויות SCG נדבקו רדום כמתואר באיור 1. ב DIV 14, ACV הוסרה והוחלפה מדיה המכילה 1 trichostatin מיקרומטר (TSA). (א) התרבויות היו דמיינו והבקיע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בכל יום לאחר טיפול תרופתי לתקופה של 5 ימים. אחוז העוברים בארות reactivatיון במהלך הניסוי מוצג לעומת DMSO השליטה שטופלו תרבויות. אחוז מחדש חושב במספר EGFP חיובי בארות מתוך 20 בארות של צלחת 96 תרבות היטב. ברים שגיאה עולה סטיית התקן של הממוצע. (ב) תרבויות נגועים רדום בו טופלו TSA ו מעכב encapsidation של ה-DNA הנגיפי, בדרך, 150,138 (20 מיקרוגרם / מ"ל). מספר EGFP + נוירונים הושוותה 48 שעות לאחר הטיפול עם תרופות השולטות על מטופלים עם DMSO ו-WAY 150,138. כל נקודת נתונים מייצג את היחס בין EGFP + נוירונים מתוך 1,000 נוירונים התרבות באר. בר מראה את האחוז הממוצע של EGFP + נוירונים היטב.
איור 3. Detecion EGFP תלויה שכפול ה-DNA הנגיפי. תרבויות SCG נדבקו רדום בו מטופלים מכן עם 10 מיקרומטר של LY29004, inducer ידוע מחדש 1. המושרה על ידי הפעלה מחדש (כחול) LY WAזה בהשוואה לאלו שטופלו במעכבי סינתזת ה-DNA הנגיפי, חומצה phophonoacetic, PAA (300μg/ml, אדום) ואת שתי תרכובות יחד (ירוק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זו תרבות הנוירון הראשוני המערכת זיהום מספק שיטה פשוטה ויעילה לבדוק את המנגנונים המולקולריים שבבסיס HSV-1 חביון מחדש. המערכת בנאמנות משחזר את סימני ההיכר המקובלים חביון שהוגדרו הן זיהומים האדם והן לחיות מודלים של בעלי חיים. כאשר הנגיף רדום בתרבויות SCG, חלקיקים נגיפיים זיהומיות מוצרים גנים ממס לא ניתן לאתר. המוצר היחיד הגן זוהה הנגיף רדום בנוירונים נגועים הוא תמליל ללא קידוד LAT, אשר מצטבר בתוך הגרעינים. הפעלה מחדש עולה בקנה אחד עם הביטוי של גנים נגיפיים ממס לשיאו בייצור של חלקיקים מזהמים. יתר על כן, זה תא עצב לתא העיקרי מודל התרבות הוא מגיב inducers מחדש מקובלים כגון ה-TSA, אשר למעשה גורם השכפול הנגיפי ממס.
Inducers כימיים שונים לעורר מחדש את ובמידות שונות ועם קינטיקה מאפיין. לדוגמה, ה-TSA reproducibly גורם מחדש של 60-70% של התרבויות במשך 5 ד התצפית. רמות דומות של ה-TSA מחדש הנגרמת דווחו באמצעות רדום בו, נגוע, pheochromocytoma עכברוש הבדיל PC12 תאים 17 או Murine תרבויות נוירונים trigeminal 18. קינטיקה של הפעלה מחדש שאנו רואים לבין חוסר היכולת של ה-TSA להפעיל מחדש את 100% של תרבויות יכולים לשקף הטרוגניות ביכולת של הגנום סמויים להיות derepressed. בהתאם להצעה זו, את היעילות של ה-TSA מחדש הנגרמת על פי הדיווחים יורד כפונקציה של הזמן בתרבות 18. לעומת ה-TSA, LY29004 גורם מחדש של 80-90% של התרבויות בתוך ד 2-3. הבדלים הקמת חביון או משרד הפנים אינם צפויים להסביר את ההבדלים בין ה-TSA מחדש מושרה ו LY29004, כמו התנאים שלנו להקמת חביון reproducibly לגרום כ 20% של נוירונים המבטאים את התחת וירוס המקודד חביוןתמליל ociated LAT 1. עם זאת, לא מדדו עדיין את החלק היחסי של הגנום חיובי תאים ויראלי, מעלים את האפשרות כי גורם LY29004 מחדש במספר גדול יותר של נוירונים מאשר ה-TSA. בעוד הסיבות העומדות בבסיס יכולת ההפרש של ה-TSA ו LY20004 לעורר מחדש להישאר שייקבע, ברור סוכני התרמה שונים יכולים לקדם מחדש עם היעילות קינטיקה אופייניים.
היבט חזק של המערכת הוא היכולת להשתמש בר וירוס או סוג הכתב זנים מתנהגים שאין להבדיל בין השתיים מנגיף wild-type. שלא כמו מערכות קודמות התרבות תאים ללמוד HSV-1 חביון, אשר הסתמכה על וריאנטים מוטנטים HSV כי הצליחו לשחזר באופן פרודוקטיבי 16,18,19, נבדקה ב 20, מערכת המודל שלנו משלבת זן EGFP, כתב כי הוא נבדל wild-type וירוס במונחים של יעילות שכפול ממס בתאים בתרבית 11. השימוש כתב EGFP Vאירוס הארגמן מאפשר הערכה חזותית רגיש וישיר של חביון מחדש. בניגוד לעיתונאים אחרים כגון galactosidase-β, הדורש קיבוע ו תמוגה של תאים לניתוח, EGFP מאפשרת לחוקר לעקוב אחר מצב ויראלי במהלך הקורס כולו הניסוי, מתן קל, בזמן אמת הערכת ספונטנית המושרה הפעלה מחדש. שיטות אחרות, כמו ה-PCR כמותי, יכול גם להיות מנוצל כדי להסתכל על דפוסי ביטוי גנים נגיפיים שקדמו EGFP ביטוי, שכן EGFP מבוטא הגן "נכון, מאוחר", או זני וירוסים חסרי הגן הכתב. לחלופין, וירוסים הכתב אחרים שבהם EGFP מותך כדי המיידי המוקדמות (IE) או מוקדם (ה) גנים יכול להיות מפותח. היתרון של שימוש "נכון, בסוף" EGFP-הכתב תיאר היא EGFP ביטוי תלוי מקפידים על סינתזת ה-DNA הנגיפי, המציין כי מחזור החיים של הנגיף התקדם אל השלב הסופי ביטוי גנים הקשורים לצמיחה ממס. Indeed, "נכון, בסוף" הביטוי EGFP לרמות לזיהוי על ידי בדיקה ויזואלית וקושרת היטב עם ייצור הנגיף מדבק, מחוון ביולוגי מחדש פרודוקטיבי התרחשה. עם זאת, נותר לראות אם כל תא עצב זה מתחיל מחדש, כפי שנמדד על ידי מחזור פורה (ממס) ביטוי גנים, מסוגל להתקדם באמצעות תוכנית ממס מלא לייצר וירוס מדבק. אולי וירוסים יש מספיק הזדמנויות כדי להפיל את התוכנית ממס ו מחדש חביון. לכן, וירוסים הכתב להביע EGFP קיבע את IE או חלבונים E עשוי לגרום readouts מחדש אמינים פחות. מנקודת מבט זו, להשוות את היעילות של הפעלה מחדש נמדד באמצעות EGFP למוצרי הכתבים לידי ביטוי בין IE, E, או מקדמי המאוחרות, או אפילו כתב משולב עם חלבונים שונים הכתב ניאון התמזגו למוצר הגן מכל כתה קינטית (IE לעומת E לעומת ) בסוף יהיה שימושי. בנוסף, המערכת העצבית שלנו התרבות התא יכול לשמש גם עם רחוב HSV-1 שונהגשם, ללא קשר לפוטנציאל neuroinvasive או היכולת לווסת את התגובה החיסונית המארחת 21-24. בסופו של דבר, במערכת התרבות חוץ גופית המתואר כאן ניתן להחיל על אחרים סוגי תאים עצביים ועל היקפי לשעבר ב vivo תרבויות הגרעינים שהתקבלו מסדר גבוה מינים, כולל בני אדם 25-27.
באמצעות האוכלוסייה הטהורה של נוירונים, מחקרים מפורטים של יחסי הגומלין בין HSV1 ו מארח העצבית שלו ברמה המולקולרית כעת אפשרי. ראוי לציין, זו מערכת מודל ימנע את סוגיות מורכבות רבות הקשורות חביון לימוד מחדש בחיות immunocompetent, שם רמות שליטה נוספות בשכבות על גבי וירוסים נוירונים אינטראקציות היסוד. יתר על כן, העבודה במערכת זו מראה בבירור כי אכן מערכת יחסים יציבה בין וירוס נוירון המארח כי ניתן להקים ולתחזק ללא סיוע התגובה החיסונית הנרכשת. בזמן מולד adaptivחסינות דואר בבירור ממלאים תפקידים חשובים בביולוגיה של זיהומים סמויים HSV, וירוס יש את היכולת הפנימית א) להקים זיהום יציר דומה חביון בנוירונים, ו-II) כדי לעבור תוכנית, ממוסס שכפול יעיל בתגובה הסביבה ו רמזים עצביים להחיל נוירונים בלבד. חשוב לציין, הבסיס המולקולרי של הקשר הייחודי בין HSV ו נוירון כעת ניתן גזור באמצעות תא ביולוגי, גנטי תרופתי, השתקה, ואת אספקת כלים גנים 1. מחקרים מסוג זה כי הם התמקדו נוירון ווירוסים בבידוד אינם אפשריים במודלים של בעלי חיים בו מספר סוגי תאים לכבוש את תא ganglial. אנו מקווים כי באמצעות מערכת זו המודל, הבנה מקיפה של המעגלים מולקולרית מורכבת ויסות HSV-1 חביון בנוירונים יכול סוף סוף להיות מושגת. במידת האפשר, עקרונות שלוקטו מערכת זו נוירון תרבותי יכול להיבדק in vivo באמצעות בעלי חיים הוקמה מוdels, הממחישות את האופי המשלים של שתי גישות מחקר הכולל של חביון HSV-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים הסוקרים לקבלת הצעות חושבים שלהם זה עזר כדי לשפר את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) ו-IM (AI073898, GM056927) מ-NIH. ח"כ נתמך בחלקו על ידי מענק אימון NIH (5T32 AI007180).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
| 1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
| 96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
| Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
| Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
| Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
| Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma-Aldrich | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Rat-tail collagen | EMD Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
References
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).
- Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).
- Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).
- Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).
- Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
- Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
- Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
- Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
- Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
- Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
- Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
- Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
- Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
- Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
- Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
- Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
- Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
- Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
- Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
- Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
- Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
- Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
- Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
- Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
- Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).
