Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Published: April 2, 2012 doi: 10.3791/3823

Summary

Protokollen beskriver en effektiv og reproduserbar modellsystem for å studere herpes simplex virus type 1 (HSV-1) ventetid og reaktivering. Analysen benytter homogene sympatiske nevroner kulturer og åpner for molekylær disseksjon av virus-Nevron interaksjoner med en rekke verktøy, inkludert RNA interferens og uttrykk av rekombinante proteiner.

Abstract

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) etablerer en livslang latent infeksjon i perifere nevroner. Dette latent reservoaret er kilden til tilbakevendende reaktivering hendelser som sikrer overføring og bidra til klinisk sykdom. Gjeldende antivirale ikke påvirke latente reservoaret og det er ingen vaksiner. Mens de molekylære detaljene i lytisk replikasjon er godt karakterisert, mekanismer som kontrollerer ventetid i nerveceller forblir unnvikende. Vår nåværende forståelse av ventetid er avledet fra in vivo studier med små dyremodeller, som er blitt uunnværlige for å definere virale genet krav og rollen immunreaksjoner. Imidlertid er det umulig å skille spesifikke effekter på virus-nervecellen forholdet fra mer generelle konsekvenser av infeksjon mediert av immun eller ikke-nevronale støtte celler i levende dyr. I tillegg er dyreforsøk kostbart, tidkrevende, og begrenset i forhold til tilgjengelige alternativer for å manipulere vertenprosesser. For å overvinne disse begrensningene, er et nevron-eneste systemet desperat behov som gjengir in vivo egenskaper ventetid og reaktivering, men tilbyr fordelene med vevskultur i form av homogenitet og tilgjengelighet.

Her presenterer vi en in vitro modell utnytte dyrkede primære sympatiske nerveceller fra rotte overlegen cervical ganglier (SCG) (figur 1) for å studere HSV-1 latens og reaktivering som passer de fleste om ikke alle de ønskede kriterier. Etter å eliminere ikke-nevronale celler, blir nær-homogene TrkA + Nevron kulturer infisert med HSV-1 i nærvær av acyclovir (ACV) å undertrykke lytisk replikasjon. Etter ACV fjerning, ikke-produktive HSV-1 infeksjoner som trofast stiller akseptert kjennetegner latency er effektivt etablert. Spesielt, lytiske mRNAs, proteiner og smittsomme virus blir umulig å oppdage, selv i fravær av utvalget, men latency-assosiert karakterutskrift (LAT) Expression vedvarer i nevronale kjerner. Viral genomer opprettholdes på et gjennomsnittlig eksemplar antall 25 per nevroner og kan bli overtalt til produktivt replikere ved å forstyrre PI3-Kinase / Akt signal eller den enkle uttak av nerve growth factor 1. En rekombinant HSV-1 koding EGFP smeltet til viral lytisk protein Us11 gir en funksjonell, real-time markør for replikering følge av reaktivering som er lett tallfestes. I tillegg til kjemiske behandlinger, kan genetiske metoder som RNA-interferens eller genet levering via lentiviral vektorer være vellykket brukes på systemet tillater mekanistiske studier som er svært vanskelig, om ikke umulig, i dyr. Oppsummert gir SCG-baserte HSV-1 latency / reaktivering system en kraftig, nødvendig verktøy for å avdekke molekylære mekanismer som styrer HSV1 ventetid og reaktivering i nevroner, et langvarig puslespill i virologi hvis løsning kan tilby ny innsikt i å utvikle nye behandlingsformer som mål than latent herpesvirus reservoaret.

Protocol

1. Isolering og kultur SCG Nerveceller fra Rat Embryoer

Å gi en nyttig kontekst for å forstå denne protokollen, og for en omfattende drøfting av tidligere litteratur som etablerte metoder for SCG neuron kultur, herunder grunnlaget for SCG in vitro kultur, plate-belegg underlag, og komponentene i serum-frie medier, Leseren blir referert til referanser 2-4.

  1. Bruken av rotter som en kilde for SCG nevroner ble gjennomført i samsvar med NIH retningslinjer under en aktiv protokoll godkjent av Institutional Animal Care & Bruk Committee (IACUC).
  2. Før påbegynnes disseksjon, forberede kollagen og laminin belagt med 96 brønner vevskulturstudier retter. Ved hjelp av en multi-kanal pipettering enhet, fylle alle 96 brønner med en løsning som inneholder 0,66 mg / ml rotte hale kollagen. Umiddelbart fjerne kollagen, som kan gjenvinnes og brukes i opptil 8 disseksjoner. Etter fjerning than kollagen, er det svært viktig å la de brønnene tørre under en laminær hette. Tiden det tar å tørke avhenger av antall brønner i fatet. For eksempel tar det vanligvis ca 5-10 min. for brønner i en 96 vel rett til å tørke, men kan ta opp til 30 - 40 min hvis en større format 24 godt parabolen blir brukt. Unnlatelse av å tørke brønnene resulterer i dårlig SCG vedlegg. Deretter gjenta prosedyren med en løsning av to mikrogram / ml laminin. Inkuber laminin løsning på minst 2 timer ved 37 ° C i en fuktet CO 2 inkubator før du er klar til tallerkenen din nevroner (trinn 1,14).
  3. Kommersielt utvunnet gravide hunnrotter avlives ved hjelp av CO 2. Etter sprøyting kadaveret med 70% etanol, er en U-formet snitt laget rundt magen. Etter peeling tilbake huden, en andre u-formet snitt gjort gjennom abdominal muskel veggen. Livmoren er synlig ved å løfte opp magen muskel laget. Fjerne livmoren og plass i en 15cm parabolen. Åpne forsiktig livmoren ved hjelp av en sløv saks å unngå å skade valpene innenfor. Hver valp må bli løslatt fra sin embryonale sac, navlestrengen kuttet, og at valpen tørkes av med 70% etanol og Kimwipes.
  4. Arbeid i en disseksjon hette, ofre ufødte E21 rotteunger ved klipping hodet fra kroppen. Sikt saksen på undersiden av halsen, like over skuldrene. For å utsette ganglier, pin ned hodet (halsen-siden opp) med 23 g nåler i tre steder: i) ryggmarg, ii) anterior huden trekkes opp over nesen og festet, og iii) spiserøret / luftrøret må festet bort fra bunnen av nakken.
  5. Se etter de to SCG * plassert på hver side av halspulsåren bifurkasjon (to SCGs per embryo). Den SCG ligger rett under grenen. Skill SCG fra blodårene ved å trekke den bifurkasjon hverandre. Plasser ganglier i 12 ml av L15-media (supplert med 0,4% D (+)-glukose) i 15 ml konisk rør på is.

* The SCG er gjennomskinnelig og fargeløs sammenlignet med ugjennomsiktig, gulaktig fettvev som omgir bifurkasjon. Prøv å fjerne så mye av de gjenværende fettvev og blodkar, før samle ganglier.

  1. Gjenta 1.4 og 1.5 til alle SCGs er høstet fra befruktede egg.
  2. Forsiktig Sentrifuger ganglier i 1 min ved 600 rpm og aspirer det overskytende media.
  3. Resuspender det ganglier i 1 ml av L15-medier som inneholder trypsin (0,25%, uten EDTA) og collagenase (1 mg / ml). Inkuber i 30 min ved 37 ° C, agitere hvert 10 min.
  4. Tilsett 10 ml av C-media (1x MEM, 0,4% D (+)-glukose, 2 mm L-glutamin, 10% FBS) til inaktivere trypsin og sentrifuger i 1 min ved 600 rpm.
  5. Fjern så mye av trypsin / collagenase media som mulig * og vask ganglier med 10ml av C-media. Sentrifuger i 1 min ved 600 rpm. Gjenta dette trinnet en gang.

* Residual collagenase vil interfere med kollagen underlaget kreves for celle feste på kultur plate.

  1. Fjern vask media og re-suspendere ganglier i 1 ml av C-media og triturate bruker 21 G nål festet til en 5 ml sprøyte for å distansere store klumper av celler *. Avslutt triturating med 23 G nål til de synlige klumper er dissosiert.

* Vær forsiktig så du ikke over-triturate, da dette vil skade cellene. Hvis trypsin og collagenase behandling var vellykket, maksimalt femten opp og ned sykluser med 21 G nål, og tre sykluser med 23 G nål bør være tilstrekkelig.

  1. Filtrer dissosiert nevroner gjennom en 70 mikrometer nylon filter [BD Biosciences celle sil] til en 50 ml konisk rør for å forkaste eventuelle gjenværende klumper.
  2. Trekk en 10 mL delmengde av det filtrerte cellesuspensjon og bland med trypan blå å bestemme antall levende celler. Tell antall celler som aktivt eksklUde fargestoff med en hemocytometer.
  3. Fjern laminin løsningen fra de 96 vel oppvasken som venter i 37 ° C inkubator (se STEP 1.2). Ikke tørk fatet, kan den brukes umiddelbart for plating celler når laminin er fjernet. Tilsett * Er 5,000-6,000 innlegg levende celler (50-100 mL per brønn) i kollagen og laminin forbelagte 96 godt vevskultur parabolen. Inkluder 50 ng / ml nerve vekstfaktor (NGF) i C-media.

* Det er viktig å ansette god steril vevskultur teknikk fordi antibiotika er utelatt fra vekstmedier. I tillegg kan det være betydelig variasjon blant kollagen hentet fra ulike leverandører. Vi har hatt konsistente resultater på tvers av partier med rotte halen kollagen fra Millipore.

  1. På DIV (dag in vitro) en, erstatte C-mediet som brukes til plate cellene med 50 mL NBM (0,4% D (+) - glukose, 2 mm L-glutamin, B-27 supplement inneholder 50 ng / ml NGF, 5mM aphidicolin og 20 mM 5-fluorouracil [5-fluoro-2'-deoxyuridine]. Inkuber kulturer for 5 dager *. På dette punktet kan trypsinizing og telle cellene som er igjen i flere brønner bestemme antall nevroner som overlever anti-mitotisk middel behandling. Vanligvis ca 1000 nerveceller forblir per brønn i en plate med 96 brønner.

* Er Problemer med sopp eller bakteriell forurensning er vanligvis tydelig i løpet av de første 24 timer med kultur. Undersøk hver brønn grundig for mikrobiell vekst før erstatte plating media. Hvis bare et begrenset antall brønner er berørt, kan de bli behandlet med en fortynnet blekemiddel løsning, skylles med PBS og tørkes for å fortsette med forsøket. Vi anbefaler å gjenta noe eksperiment der selv et begrenset antall brønner hadde mikrobiell forurensning. Hvis omfattende mikrobiell forurensning er observert i 96 brønner fatet, må forsøket avsluttes.

2. Infeksjon av SCG Culttiltak med HSV-1 Us11-EGFP og etablering av ventetid

For nyttig bakgrunnsinformasjon om virologiske teknikker, inkludert grunnleggende virus forplantning, bestemme virus titer, og mangfoldet av infeksjon (MOI), blir leseren henvist til referere fem. For en diskusjon av herpesvirus biologi, blir leseren henvist til referere seks. Endelig er leseren henvises til referanser 7-10 for tidligere eksempler, andre protokoller, og ytterligere bakgrunnsinformasjon om alfa-herpesvirus lytisk infeksjon av SCG nevroner og for sammenligning med vår protokollens tilpasninger for å studere ventetid og reaktivering.

  1. På DIV 6, legg acyclovir (ACV), endelig konsentrasjon 100 mikrometer til de eksisterende mediene i hver brønn *. For eksempel, hvis hver brønn inneholder 50 mL, tilsett 25 mL av en 300 mM ACV lager. Vanligvis er ACV lagt kvelden før infeksjonen, men kan også legges 6-8 hr før infeksjon.

* Det er exceedingly viktig å minimere unødvendig fysisk manipulering av nervecellen til enhver tid. Bare å fjerne og erstatte media eller infisere med virus aksjer må gjøres veldig forsiktig og sakte. Ellers kan den resulterende mekanisk stress negativ innvirkning på neuron levedyktighet.

  1. På DIV 7, infisere SCG kulturer med HSV-1 Us11-EGFP (beskrevet i ref 11) på et mangfold av infeksjon (MOI) mellom 1 -2 (se viktig kommentar under på å bestemme optimal MOI) *. Legg til utvannet viruset direkte til de eksisterende mediene i brønnen. Inkluder en mock-infisert kontroll og en lytisk infeksjon positiv kontroll i media mangler ACV. La infeksjon for å fortsette i 2-3 timer ved 37 ° C.

* MOI beregnes ved hjelp av virus titer bestemmes ved å utføre en plakett analysen i Vero celler 12 og antall belagt, levende celler seeded per brønn i trinn 1.14. Denne beregningen er nyttig bare i en operasjonell forstand,som det totale celle nummer seeded inneholder nerveceller sammen med forurensende gliaceller, og fibroblaster. Ettersom disse forurensende delende celler blir drept av behandling med anti-mitotiske midler, er den effektive MOI for de overlevende nevronene faktisk større. Fra den første starter mengde på 5.000 - 6.000 levende celler, ca 1000 nerveceller igjen etter behandling med anti-mitotiske midler (som vurderes av trypsinizing og direkte celle telling). Den optimale MOI å bruke når infisere nevrale kulturer kan variere noe fra virus lager forberedelse til neste. Med hver ny forberedelse av virus, anbefaler vi at du tester et begrenset utvalg av forskjellig MOI sin 1-2. Målet her er å identifisere den som har færrest effekter på nevroner levedyktighet og resultater i størst antall induserbar reaktivering hendelser (definert i § 3). Den Us11-EGFP viruset er spesielt nyttig i raskt å optimalisere forholdene, men man kan også bruke andre avlesninger som plakk assay eller mengtative PCR. Det kan hjelpe å bruke virus renset gjennom en sukrose pute for å fjerne urenheter som reduserer celleviabilitet, men dette er ikke avgjørende, og ikke rutinemessig utført.

  1. Nøye erstatte infeksjon media med frisk NBM inneholder 50 ng / ml NGF og 100 mikrometer ACV *.

* Det er kritisk viktig å være EKSTREMT forsiktig når du endrer infeksjon media. Rett tuppen av pipetten på veggen av brønnen heller enn på bunnen av brønnen, og la media til forsiktig gli ned på cellene. Selv rask utstøting av media fra pipetten kan generere tilstrekkelig kraft til å løsne axoner fra underlaget og føre cellene til Slough off vanligvis som en ark av celler. Hvis bare et begrenset antall nevroner løsne (20-30%), konsekvensene er minimal, forutsatt at cellene vises sunn. De utskilte nevroner er sannsynlig å feste over tid, men vil axons ikke lenger pent forlenges end nye aksoner vil vokse. Selv om ikke optimal, kan forsøket fortsette hvis bare et begrenset antall brønner er berørt. Hvis det er utstrakt avløsning av nevroner (70-80%), anbefaler vi ikke inkludert berørte brønnen (e) i forsøket. Dersom flertallet av brønnene inneholder 70-80% frittliggende nevroner, anbefaler vi avslutte eksperimentet. Mens nervecellene kan fortsatt feste, de vanligvis vil danne store klumper. Dette kompliserer korrekt vurdering av individuelle reaktiviserte nerveceller. Vi anbefaler å gjenta noen forsøk der brønner med frittliggende nevronene ble observert å sikre at reaktivering prisene ikke ble påvirket av differensial etterlevelse av nerveceller til brønnene.

I tillegg er det avgjørende å alltid behandle de kulturer så skånsomt som mulig. Mekanisk stress fra unødvendige, plutselige bevegelser (inkludert gjentatt åpning og lukking av en inkubator kammer dør) eller kraftig medieprogram cOuld kompromiss kulturer muligheten til å støtte HSV-1 ventetid, eventuelt resultere i uakseptabelt høy forekomst av spontan reaktivering i et gitt eksperiment.

  1. Opprettholde kulturene i 6 dager i løpet av denne tiden viruset vil etablere latency. I denne perioden bruke et fluorescerende mikroskop for å overvåke neuron helse og Us11-EGFP uttrykk som en indikator på lytisk replikasjon. Us11-EGFP skal påvises KUN i kontrollgruppene brønnene mangler ACV behandling, indikerer vellykket primær infeksjon og produktiv lytisk replikasjon. Nerveceller kan vise cytopathic effekter selv i fravær av produktive viral vekst. De infiserte kulturer bør overvåkes nøye og sammenlignet med mock-infiserte nevroner.

3. Reaktivering and Assessment

  1. På DIV 14, nøye erstatte de ACV-holdige media med friske media mangler ACV. Hvis nødvendig omfatte farmakologiske (eller biologisk) variabler på dette tidspunktet. Vær sure å følge forholdsreglene angitt i 2.3.
  2. Over en 5-6 dagers periode, overvåke levende kulturer med et fluorescerende mikroskop for å oppdage nevroner som gjennomgår reaktivering. Alternativt samle inn prøver for andre typer analyser (protein, nukleinsyre, plakk analysen etc).
  3. Beregn reaktivering frekvensen ved å telle antall brønner som inneholder EGFP-positive nevroner og uttrykke dette som en andel av det totale antall prøver brønner. Merk at EGFP uttrykk i en enkelt brønn skiller ikke mellom en primær reaktivering hendelse og påfølgende infeksjon som skyldes viral spredning. Siden infeksiøs spredning finnes til en enkelt kultur Vel, en eller flere EGFP-positive nevroner i en godt operasjonelt definert som en reaktivering hendelse under disse forholdene.

* Flere reaktivering hendelser kan oppstå i en kultur, som beskrevet i en. Å skille mellom en primær reaktivering hendelse fra viral spredning som følge av reaksjon tivation kan encapsidation inhibitor WAY-150138 legges. Ved å blokkere encapsidation, er smittsomme virus ikke er produsert og spredt følge av reaktivering er ikke mulig. Dermed gjenspeiler EGFP signal oppdaget i nærvær av WAY-150138 antallet uavhengige reaktivering hendelser innenfor et svi kultur godt 1,13-15. Merk at WAY-150138 er bare effektivt mot HSV-1 Patton belastning og ikke kommersielt tilgjengelig. Som et alternativ til WAY-150138, vurdere å bruke noe av det følgende: i) en mutant virus svekket i sin evne til å spre seg til nabocellene kan utnyttes, ii) en reporter virus der EGFP er uttrykt fra en IE promoter i kontinuerlig tilstedeværelse av ACV, iii) behandling med PAA eller ACV å hindre sent genuttrykk (og smittsomme virus produksjon) etterfulgt av immunfluorescens bruker antistoffer rettet mot en IE genproduktet.

4. Alternative metoder for å vurdere Reaktivering bruke Assay

ontent "> Resultater fra en enkeltperson, enkelt eksperiment kan skaffes fra en enkelt forberedelse av SCG. Repliker eksperimenter kan utføres med uavhengige SCG preparater så lenge hver kopi ble utført med en enkelt SCG batch.

  1. Vurdering av HSV-1 lytiske transkripsjoner. Samle RNA ved ønskede tider etter ACV fjernet i nærvær eller fravær av ulike eksperimentelle indusere av reaktivering. Ved bruk av 96 og kultur plater, anbefaler vi pooling minst 20 brønner sammen for hver prøve (om lag 10 5 celler per RNA prøve). Alternativt kan SCGs bli belagt i større brønner (f.eks for en 24 brønn plate, bruker 4-5 x10 4 celler / brønn). Mens det er absolutt mulig å oppdage RNA fra mindre enn 20 brønner, de små volumene er involvert fører til uberettiget sample-til-prøve variabilitet.
  2. Påvisning av HSV-1 lytiske proteiner. Samle lysates på ønsket tidspunkt etter induksjon av reaktivering. Legg 7,5 mL av lysis buffer til hver av 10 walen i en plate med 96 brønner og analysere ved SDS-PAGE og immunoblotting. Alternativt kan virale proteiner påvises ved indirekte immunfluorescens mikroskopi. Den innledende plating må gjøres på en monterbar substrat for bildebehandling som for eksempel en steril glass dekkglass som har vært pre-belagt med poly-D-lysin (0,2 mg / ml, Sigma) før påføring av kollagen og laminin (se 1.10) .
  3. Påvisning av infeksiøse partikler. Samle kultur supernatanten ved reaktivering. Utfør en plakett analyse på monolayers av Vero celler ved hjelp av serielle fortynninger av supernatanten. I tillegg kan plakk analysene utføres ved hjelp lysates av fryse og tines kulturer å inkludere celle-tilknyttede partikler å bestemme titer.

5. Representative Resultater

Figur 2a illustrerer et eksempel der en mM trichostatin A (TSA), en kjent induser av reaktivering 16-18, brukes til SCG kulturer latent infisert med vill-type HSV1 EGFP-Us11 reporter belastning. Med TSA, når reaktivering 50% av det maksimale innen 2 dager, og ved 5 dager reaktivering platåer på rundt 60% av brønnene. Base linje ('spontan') reaktivering er ca 10% i dette eksperimentet, og vanligvis varierer fra 10-20% bruker dette in vitro system. Maksimalt reaktivering varierer avhengig av hvilken reaktivering induser benyttes. Mange reaktivering indusere kan søkes om varigheten av forsøket som de ikke forstyrrer produktiv virusreplikasjon, men dette må bestemmes empirisk. Andre indusere, inkludert eventuelle reagens som påvirker levedyktigheten til nervecellene eller hindrer gjennomføring av viral produktive livssyklus, kan kreve en forbigående puls program for å provosere reaktivering.

Mens opphopning av EGFP-Us11 i hver brønn av eksperimentet avbildet i figur 2A er et tegn på reaktivering fra ventetid, betyr det ikke skille om detUs11-EGFP signal i enkelte nevroner er avledet fra en uavhengig reaktivering hendelse, eller spredningen av en reaktivert virus gjennom kulturen. For å vurdere antall nerveceller som gjennomgår uavhengige reaktivering hendelser i hver brønn, ble kulturer forbehandlet med WAY-150138, et stoff som spesifikt blokkerer viral spredning ved å hindre encapsidation av viral DNA genom 13-15. Infiserte sympatiske nevroner kulturer ble behandlet med WAY-150138 og reaktivering indusert med TSA. Betydelige mengder EGFP-positive nevronene ble bare påvist i TSA-behandlede brønner, sammenlignet med DMSO-behandlede kontroll kulturer, viser at en rekke uavhengige reaktivering hendelser oppstår per person kultur (figur 2B).

I analysen vår er Us11-EGFP reporter uttrykte fra den endogene Us11 promoter 11. Siden Us11 er en "true-sen" eller γ 2 viral lytisk genet, er viral DNA replikasjon som kreves for robust expressipå. Dette er illustrert i figur 3, som EGFP-Us11 akkumulering er svekket av viral DNA polymerase hemmer phosphonoacetic syre (PAA) i kulturer overtalt til å reaktivere med PI3-kinase inhibitor LY294002.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk illustrerer en typisk forsøksprotokoll bruke den kultiverte nervecellen in vitro system for å studere HSV-1 ventetid og reaktivering. 1) Etter dissekere overlegen cervical ganglier (SCG) fra E21 rotter, er dissosiert nevroner belagt i 96 vel retter og behandlet med anti-mitotisk agenter for å fjerne ikke-nevronale celler. 2) Etter 6 dager i vitro (DIV) kulturer er smittet med rekombinant HSV-1 som inneholder EGFP smeltet til virus-kodede Us11 sent genet (EGFP-HSV-1) i nærvær acyclovir (ACV), et antiviralt medikament som blokker lytisk replikasjon. 3) Ved dag 14 (DIV 14), er acyclovir fjernes og EGFP-uttrykkoppdages ikke. Kulturer kan stabilt opprettholdes på denne måten for en måned eller mer, eller en test variabel kan legges til vurdere sin evne til å provosere reaktivering fra latency. Den variable kan være i form av et lite molekyl kjemisk hemmer, et antistoff mot et løselig neurotrophin eller celleoverflaten protein, eller en lentivirus uttrykker enten en gen-spesifikk shRNA eller en ectopically uttrykt protein. Reaktivering blir deretter overvåket ved scoring EGFP-positive brønner i sanntid.

Figur 2
Figur 2. TSA reaktiverer HSV-1 i SCG kulturer. SCG kulturer latent infisert som beskrevet i figur 1. På DIV 14, ble ACV fjernet og erstattet med media som inneholder en mM trichostatin A (TSA). (A) De kulturene ble visualisert og scoret ved hjelp av fluorescens mikroskopi hver dag etter behandling for en periode på 5 dager. Andelen av brønner gjennomgår reactivation i løpet av forsøket er vist i forhold til DMSO kontroll-behandlede kulturer. Andel reaktivering ble beregnet med antall EGFP-positive brønner av 20 brønner på en 96 vel kultur plate. Feilfelt indikere standard feil av gjennomsnittet. (B) latent infiserte kulturer ble behandlet med TSA og en hemmer av viral DNA encapsidation, WAY-150138 (20 mikrogram / ml). Antallet EGFP + nevroner ble sammenlignet 48 timer etter behandling med legemidler til kontroll behandlet med DMSO og WAY-150138. Hvert datapunkt representerer forholdet mellom EGFP + nevroner av 1000 nevroner i en kultur godt. Bar viser gjennomsnittlig andel av EGFP + nevroner i en brønn.

Figur 3
Figur 3. EGFP detecion er avhengig viral DNA replikasjon. SCG kulturer latent infisert deretter behandlet med 10 mm i LY29004, en kjent induser av reaktivering en. Reaktivering indusert av LY (blå) WAs sammenlignet med de som ble behandlet med viral DNA-syntese hemmer, phophonoacetic syre, PAA (300μg/ml, rød) og de to forbindelsene sammen (grønn).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette primære neuron kultur og infeksjon systemet gir en enkel og effektiv metode for å utforske de molekylære mekanismene bak HSV-1 ventetid og reaktivering. Systemet trofast sammenfatter de aksepterte kjennetegner ventetid definert i både menneskelige infeksjoner og i live-dyremodeller. Når viruset er latent i SCG kulturer, kan smittsomme partikler og virale lytiske genprodukter ikke bli oppdaget. Den eneste viral genproduktet oppdaget i latent-infiserte nevroner er den ikke-kodende LAT avskrift, som akkumulerer innenfor atomkjerner. Reaktivering faller sammen med uttrykk av virale lytiske gener og kulminerer i produksjon av smittsomme partikler. Dessuten er dette primære neuron cellekultur modell lydhør til aksepterte reaktivering indusere som TSA, som effektivt induserer lytisk virusreplikasjon.

Ulike kjemiske indusere stimulere reaktivering i varierende grad og med karakteristiske kinetikk. For eksempel, induserer TSA reproduserbart reaktivering i 60-70% av de kulturene over en 5 d observasjonsperioden. Tilsvarende nivåer av TSA-indusert aktivering har blitt rapportert å bruke latent-smittet, differensiert rotte feokromocytom PC12 celler 17 eller murine trigeminal Nevron kulturer 18. Kinetikken om reaktivering vi observere og manglende evne til TSA å reaktivere 100% av de kulturene kunne reflektere heterogenitet i egenskap av den latente genomet som skal derepressed. I samsvar med dette forslaget, reduserer effekten av TSA-indusert aktivering angivelig som en funksjon av tid i kultur 18. I motsetning til TSA, induserer LY29004 reaktivering i 80-90% av de kulturene innen 2-3 d. Forskjeller i etablering latency eller MOI er ikke sannsynlig å ta hensyn til forskjeller i induserbar reaktivering mellom TSA og LY29004, som våre vilkår for etablering av latens reproduserbart resultere i ca 20% av nevroner som uttrykker virus-kodede latency associated karakterutskrift LAT en. Vi har imidlertid ennå ikke målt brøkdel av viral genom-positive celler, øke muligheten for at LY29004 induserer reaktivering i et større antall nevroner enn TSA. Mens årsakene som ligger bak differensial kapasitet på TSA og LY20004 å indusere reaktivering gjenstår å bli bestemt, er det klart forskjellige induserende midler kan fremme reaktivering med karakteristiske effektivitet og kinetikk.

En kraftig aspekt av systemet er evnen til å bruke villtype virus eller reporter stammer som oppfører indistinguishably fra en vill-type virus. I motsetning til tidligere cellekultur-systemer for å studere HSV-1 latency, som støttet seg på muterte HSV varianter som ikke var i stand til å gjenskape 16,18,19 produktivt, anmeldt i 20, inneholder vår modell system en EGFP-reporter belastning som ikke kan skilles fra vill-type virus i form av lytisk replikasjon effektivitet i dyrkede celler 11. Bruken av en EGFP reporter virus gir en følsom og grei visuell vurdering av ventetid og reaktivering. I motsetning til andre journalister som β-galaktosidase, som krever fiksering og lysis av celler for analyse, gjør EGFP forskeren å overvåke viral tilstand gjennom hele løpet av et eksperiment, som gir en enkel, real-time vurdering av spontan og indusert reaktivering. Andre metoder, som kvantitativ PCR, kan også benyttes til å se på viral gene expression mønstre som foran EGFP-uttrykk, ettersom EGFP uttrykkes som en "sann-sen" genet, eller for virusstammer som mangler en reporter gen. Alternativt kan andre reporter virus der EGFP er smeltet til umiddelbar tidlige (IE) eller tidlig (E) gener bli utviklet. En fordel med å bruke den "ekte-sen" EGFP-reporter som beskrives er at EGFP-uttrykket er strengt avhengig viral DNA-syntese, som indikerer at viruset livssyklusen har gått inn i den endelige genuttrykk fase forbundet med lytisk vekst. Indeed, «sann-sen" EGFP uttrykk for nivåer påvises ved visuell inspeksjon korrelerer godt med smittende virus produksjon, en biologisk indikator som produktiv reaktivering har oppstått. Men gjenstår det å se om hver nervecellen som starter reaktivering, målt ved produktiv syklus (lytisk) genekspresjon, er i stand til framdrift gjennom hele lytisk program for å produsere smittsomme virus. Kanskje virus har rikelig anledning til å avbryte lytisk programmet og gjenopprette ventetid. Dermed kan reporter virus uttrykker EGFP smeltet til IE eller E proteiner resultere i mindre pålitelige reaktivering lettleselig. Fra dette perspektivet, sammenligne effektiviteten for reaktivering målt ved hjelp EGFP-reportere uttrykt fra IE, E, eller sent promotører, eller en kombinert reporter med ulike fluorescerende reporter proteiner smeltet sammen til et gen produkt fra hver kinetisk klasse (IE vs E vs sent) vil være nyttig. I tillegg kan vår nevronale cellekulturer systemet også brukes med forskjellige HSV-1 stregner, uavhengig av deres neuroinvasive potensial eller evne til å regulere vertens immunrespons 21-24. Endelig kan in vitro kultur systemet som beskrives her brukes til andre nevronale celletyper og ex vivo perifere ganglia kulturer hentet fra høyere orden arter, inkludert mennesker 25-27.

Ved å bruke en ren populasjon av nevroner, detaljerte studier av samspillet mellom HSV1 og dens neuronal vert på molekylært nivå er nå mulig. Betydelig, unngår denne modellen systemet de mange komplekse problemstillinger knyttet til å studere ventetid og reaktivering i immunkompetente dyr, der flere nivåer av kontroll legges på toppen av grunnleggende virus-Nevron interaksjoner. Videre viser arbeidet i dette systemet klart at det er faktisk et stabilt forhold mellom virus og vert nervecellen som kan etableres og vedlikeholdes uten hjelp fra en ervervet immunrespons. Mens medfødt og adaptive immunitet klart spille viktige roller i biologi latente HSV infeksjoner, har viruset den iboende kapasiteten i) å etablere en ikke-produktiv infeksjon ligner latens i nevroner, og ii) å bytte til en lytisk, produktiv replikering program som svar på miljø og nevrale signaler brukes til nerveceller alene. Viktigere, kan det molekylære grunnlaget for dette unike forholdet mellom HSV og nervecellen nå dissekert hjelp celle biologiske, farmakologiske, genet stanse, og genet levering verktøy en. Studier av denne typen som er fokusert på den nervecellen og virus isolert er ikke mulig i dyremodeller hvor flere celletyper opptar ganglial kupé. Vi håper at ved å bruke denne modellen systemet, en helhetlig forståelse av intrikate molekylære kretsene regulere HSV-1 latens i nevroner kan endelig oppnås. Når det er mulig, kan prinsipper hentet fra denne kultiverte neuron systemet deretter testes in vivo ved hjelp av etablerte dyr models som illustrerer komplementære natur av disse to tilnærmingene til den generelle studiet av HSV-1 latency.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker leserne for sine gjennomtenkte forslag som bidro til å forbedre dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) og IM (AI073898, GM056927) fra NIH. MK ble støttes delvis av en NIH trening stipend (5T32 AI007180).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
  2. Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).
  3. Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).
  4. Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).
  5. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).
  6. Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).
  7. Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
  8. Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
  9. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
  10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
  11. Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
  12. Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
  13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
  14. Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
  15. Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
  16. Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
  17. Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
  18. Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
  19. Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
  20. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
  21. Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
  22. Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
  23. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
  24. Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
  25. Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
  26. Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
  27. Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).

Tags

Immunologi nevron cellekultur herpes simplex virus (HSV) molekylær biologi virologi
En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, More

Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., Mohr, I. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter