Summary
שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.
Abstract
אוכלוסיות מאוד מיוחדים, אבל קטן מאוד של תאים ממלאים תפקידים חשובים ברקמות רבות. זיהוי תאים מסוג סמנים ספציפיים ביטוי הגן תוכניות תת תאים נדירים ביותר כבר אתגר משתמש רגיל כולו רקמות גישות. ביטוי גנים פרופיל של תאים בודדים מאפשר גישה חסרת תקדים סוגי תאים המרכיבים רק אחוז קטן של רקמה בסך הכל 1-7. בנוסף, טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבחון את ביטוי הגן תוכניות באים לידי ביטוי זמני של מספר קטן של תאים במהלך מעברים התפתחותיים דינמיים 8.
בעיה זו של גיוון הסלולר עולה שוב ושוב במערכת העצבים המרכזית (CNS) שבו קשרים עצביים יכול להתרחש בין תאים שונים לגמרי 9. מספרם המדויק של תאים מסוגים שונים אינו ידוע במדויק, אך ההערכה היא כי ייתכנו כמה שרק 1000 סוגים שונים של קליפת המוח אניtself 10. הפונקציה (ים) של מעגלים עצביים מורכבים יכול לסמוך על כמה סוגי נוירונים נדירים הגנים שהם מבטאים. על ידי זיהוי סמנים חדשים וסיוע מולקולרי לסווג נוירונים שונים, הגישה מתא בודד שימושית במיוחד בניתוח של סוגי תאים במערכת העצבים. היא עשויה גם לעזור להבהיר מנגנוני ההתפתחות העצבית על ידי זיהוי גנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי ושבילים גנים במהלך בשלבים המוקדמים של הפיתוח אבי העצבית.
כמו רקמה, פשוט לגשת בקלות עם מגוון עצבי ניכר, חוליות הרשתית היא מערכת מודל מעולה ללימוד תהליכי פיתוח הסלולר, בידול עצבית גיוון עצבי. עם זאת, כמו בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, זה הגיוון הסלולרי יכול להציג בעיה לקבוע את המסלולים הגנטיים המניעים אבות רשתית לאמץ גורל תאים ספציפיים, במיוחד לנוכח העובדה photoreceptors מוט לפצות את אמאjority של האוכלוסייה הכולל תא רשתית 11. כאן אנו מדווחים על שיטה לזיהוי של תמלילי לידי ביטוי בתאי רשתית יחיד (איור 1). הטכניקה מתחיל מתא בודד פרופיל מאפשר הערכה של כמות הנוכחי הטרוגניות בתוך אוכלוסיות סלולריים שונים של הרשתית 2,4,5,12. בנוסף, שיטה זו חשף שורה של גנים מועמדים חדשים אשר עשויים לשחק תפקיד (ים) את גורל התא תהליכי קבלת ההחלטות המתרחשים קבוצות משנה של ובתאים רשתית 8. עם כמה שינויים פשוטים לפרוטוקול, טכניקה זו יכולה להיות מנוצל על רקמות שונות סוגי תאים.
Protocol
1. תא דיסוציאציה
- תרשים זרימה מתאר את הפרוטוקול הוא מוצג באיור 1. לקבלת מספרי קטלוג של חומרים כימיים מסוימים בשימוש בכל פרוטוקול זה, עיין בטבלה 1. לנתח את הרשתית באמבטיה PBS. במהלך הנתיחה, עדיף להסיר את הזגוגית ואת העדשה מאז להשאיר אותם עם הרשתית יכולים לעכב את ניתוק. זה לא תמיד חשיבות מכרעת כדי להסיר את כל אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) ובחלק מהמקרים זה עשוי להיות בלתי אפשרי לחלוטין להסיר אותו. עם זאת, עבור בודדים אפיון ניסויים התא של קולטני האור, הרשתית יש להסיר. אי להסיר את הרשתית עלולה לגרום לזיהום של התא פרופילים מוט עם הגנים לידי ביטוי הרשתית. זהו ככל הנראה בשל הקשר בין photoreceptors ואת הרשתית.
על דיסוציאציה, שלמות הרשתית Murine בוגרים מודגרת על 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל 20μl פעיל פפאין, ציסטאין 20 μl 25 מ"מ 5 מ"מ EDTA, ו 360 μl פתרון מאוזן של האנק מלח (HBSS) השלימו עם 10 HEPES מ"מ. מסנן שקצהו טיפים פיפטה משמשים את כל הצעדים ברחבי פרוטוקול כדי למזער אפשרות של זיהום. ריכוז פפאין וזמן הדגירה משתנה בהתאם לגיל ואופי הרקמות. לדוגמה, כדי לנתק את פיתוח הרשתיות מבודדים ביום הלידה 0 (P0), דגירה הרשתית של 10 μl פעיל פפאין, 10 ציסטאין μl 25 מ"מ 5 מ"מ EDTA, ו 380 μl פתרון מאוזן של האנק מלח (HBSS) השלימו עם 10 HEPES מ"מ במשך 10 דקות ב 37 ° C. הרשתיות ממינים שונים דורשים גם תנאים שונים מעט. הרשתית הם עוף רזה יותר הרשתיות העכבר רוב שלבי ההתפתחות. באמצעות 10 μl פעיל פפאין, ציסטאין 10 μl 25 מ"מ 5 מ"מ EDTA, ואת תמיסת מלח מאוזן 380 הנק של μl (HBSS) השלימו עם 10 HEPES מ"מ 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מספיקה כדי לנתק את these הרשתיות. - לטפוח בעדינות את הצינור כדי לסלק את כל התאים התיישבו, אז triturate בעדינות 10-20 פעמים עם pipettor p1000. דגירה של 10 דקות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס אם גושים גדולים של רקמה להתמיד מחדש triturate 10-20 פעמים.
- הוסף 5 μl של DNase אני (10 U / μl) ו דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. Triturate בעדינות pipettor p1000. המספר המדויק של פעמים יהיה צורך לקבוע באופן אמפירי, אבל בדרך כלל נופל בין 10-20.
- סרכזת בצנטריפוגה בטבלה העליונה בסל"ד 3000 דקות 3 הסר supernatant, עוזב 100-200 μl של נוזל בתחתית, והקש על צינור כדי לסלק גלולה. הוסף 1 מ"ל של HBSS ו resuspend גלולה עם טחינה דקה ועדינה. הקשה על הצינור הוא קריטי כאן פשוט resuspending גלולה עם lyse רבים של תאים ברשתית. זה נכון במיוחד עם הרשתיות Murine בוגרים.
- צנטריפוגה בסל"ד 3000 3 דקות מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend ב μl 450 של PBS להכילing 0.1% BSA. חשוב להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר כדי למזער את נוכחותו של mRNAs מתאי lysed וכל מוצרי ניתוק שיכול לעכב תגובות עתידיות.
2. איסוף תאים בודדים
- הכן שתי מנות 6 ס"מ המכיל 5 מ"ל של PBS השלימו עם BSA 0.1%. הצלחת התאים הסתייגותם לצלחת 1 ולאפשר התאים להסתפק דקות לפחות 5. צפיפות התאים לשמש תלוי במידה רבה על אופיו של תאים בודדים להיות צדודית. לדוגמה, עבור תאים נדירים מאוד שסומנו בסמן פלורסנטי כגון ה-GFP, הרשתיות הסתייגותם שלמות מצופה על צלחת 6 ס"מ אחד. עבור תאים כי הם קצת יותר עשיר, פחות תאים אלה מצופה תחילה כדי להקל למסוק 1 (או קרוב מאוד ל 1) עם תא micropipette 1.
- מניחים את צלחת של תאים הסתייגותם על מיקרוסקופ הפוכה. אנו משתמשים במודל IMT-2 מהאולימפוס. שימוש micropipettes כי כבר הנמשכים Fiנה עצה (קוטר פנימי 0.5 מ"מ, קוטר חיצוני 1.04 מ"מ) (איור 2), יחד עם צינור aspirator, לקצור תא בודד. התאים בקלות להיכנס micropipette כשהוא נמצא קרוב אליהם על צלחת. זה קריטי, כי צינור aspirator הוא לא ארוך מדי ולא קצר מדי למרחק לשלב הקשורים מיקרוסקופ הפוכה (צינורות aspirator אנו משתמשים במיקרוסקופ הפוכה שלנו הם 38.1 ס"מ). אם הצינור ארוך מדי, התאים לא יכול להיות מגורש ביעילות לתוך הצינור אוסף מ micropipette. הסיבה העיקרית שאנחנו משתמשים יותר IMT-2 דגם מיקרוסקופ הפוכה היא שמצאנו יש לו את המרחק האידיאלי לשלב להרכבה aspirator שלנו צינורות. לאחר הזנת micropipette, תא (או תאים) מסולק על צלחת 2 (צלחת לשטוף) כדי להבטיח שאף אחד ורק תא אחד נאסף על פרופיל ביטוי הגנים. בצלחת השנייה היא לעתים קרובות יש צורך להסיר או תאים זרים עם micropipette חדשאו להעביר את התא של עניין למקום אחר על מנת להבטיח כי רק תא בודד נכנס micropipette.
- כאשר תא יחיד מבודד לחלוטין תאים שכנים, השתמש micropipette חדש לשאוב את התא עניין בסעיף 2.2 ואז לגרש אותו ישירות לתוך צינור 0.2 PCR מ"ל המכיל 4.5 חיץ μl תמוגה התא. התא מסולק על הצד של הצינור, נזהרים שלא לשבור את קצה micropipette לתוך הצינור. דוגמאות ניתן סובב בקצרה microcentrifuge הספסל העליון לטבול את התא במאגר תמוגה. ספינינג זה נעשה בדרך כלל לאחר כל תא 5 ואז שוב בסוף collection.Tubes המכילים תאים בודדים בתוך מאגר תמוגה יש לשמור על הקרח למשך בידוד תא בודד. לקבלת תוצאות אופטימליות, תאים בודדים נאספים בתוך חלון של שעתיים לאחר ניתוק. אחרי כל הזמן הזה שחלף, עדיף להמשיך לשלב שעתוק לאחור מאז זמן נוסף היה observאד כדי להגדיל את הסיכוי של השפלה RNA.
3. הפוך תמלול
- בקצרה לסובב את דגימות minicentrifuge benchtop על מנת להבטיח את כל תאים בודדים שקועים למאגר תמוגה התא. כדי לקדם את תמוגה התא, דגירה מדגם ב 70 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. ב thermocycler. מיד להניח את הצינורות בחזרה על קרח.
- השאירו את הצינורות על קרח דק '2. במשך כל התוספות מגיב, השתמש קצה הפילטר טיפים פיפטה כדי למנוע זיהום. כדי לבצע שעתוק לאחור, מוסיפים 0.33 μl כתב עילי III (200 U / μl) 0.05 μl RNase אינהיביטור (40 U / μl), ו 0.07 μl חלבון T4 32 גנים. דגירה תערובת התגובה במשך 50 דקות ב 50 מעלות צלזיוס thermocycler. לנטרל את האנזים ב 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומניחים על קרח.
- כדי להסיר פריימר חינם, להוסיף 0.1 מאגר exonuclease μl (10X), 0.8 DH μl 2 0 (כיתה ביולוגיה מולקולרית), ו -0.1 exonuclease μl אני (20 U / μl). דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בthermocycler. לנטרל את האנזים על ידי דוגרים התגובה על 80 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות ולאחר מכן הנחת הצינורות על הקרח.
4. עוקב ו מתא בודד PCR
- הוסף μl 6 מתערובת התגובה עוקב ולהשתמש thermocycler כדי לדגור מדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, לחיצה ארוכה על 4 מעלות צלזיוס
- הוסף 10 μl של המדגם זנב לתערובת תגובת PCR ולבצע סינתזה של גדיל השני הגברה באמצעות PCR את התנאים הבאים:
- 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות
- 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות
- 72 מעלות צלזיוס למשך 16 דקות
- 93 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות
- 67 מעלות צלזיוס במשך דקות 1
- 72 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות, והוסיף 6 שניות בכל מחזור
- עבור לשלב 4 34 פעמים
- 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
- להחזיק ב 4 ° C
5. תיוג עבור שבבי Affymetrix
- 10-20 מיקרוגרם תווית של cDNA (ריכוז של התוצאה cDNA הגברהing מתא בודד בדרך כלל ~~~V 1 מיקרוגרם / μl) להשיג הכלאה חזקים על microarrays Affymetrix. ראשית, שבר cDNA על ידי הוספת 10-20 μl של תא יחיד cDNA עד 8 1X μl אחד Phor, כל חיץ 1 μl של מדוללת (01:10 ב 1X אחד Phor, כל חיץ) DNaseI ב 80 μl התגובה. דגירה של thermocycler דקות 13 בשעה 37 ° C. להשבית אני DNase במשך 15 דקות ב 100 מעלות ומניחים על קרח.
- הוסף 20 μl TdT חיץ 5X, ביוטין 2.5 μl N6-ddATP (אנזו Biosciences), ו 1 TdT μl (דילול 1:08 במאגר TdT).
- דגירה של 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, אז 5 דק 'ב 65 ° C. חנות ב -20 ° C או להכליא מיד microarray Affymetrix. ההכלאה מתבצעת באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים Affymetrix.
6. נציג תוצאות
כדי להעריך את איכות μl, cDNA 10 המדגם cDNA הועמס על ג'ל agarose 1%. CDNA נמדד בעיקר בגודל טווח (500-2000 bp)והעוצמה של המריחה cDNA (איור 1 ו 3 א איור). ב ג 'ל מתואר באיור 1, כל נתיב אחר מראה כתם cDNA של תאים ברשתית מבודד E16.5. הנתיבים בין להראות את כתמי כתוצאה כאשר התקשורת היא רק aspirated לתוך מחט והפקידו לתוך צינור ה-PCR. נתיבים אלה לא נעדר לחלוטין כתם קלוש, אבל הם לא מראים שום תוצאות, כאשר גנים מסוימים primers ה-PCR נעשה שימוש כדי להגביר את הגנים מהם. בנוסף, עוצמת למרוח cDNA יכול להשתנות מעט (השווה איור 1 ו 3 א 'איור). במסלולים איור 3 א, F, G, H מכילים מריחות חזקים cDNA תוך נתיבי B, C, D ו-E הם הרבה פחות חזקים.
הגן הספציפי PCR משמש כמסך משני איכות cDNA מתא בודד. CDNAs את באיור 3 בודדו תאים ניאון הגנגליון ברשתית והם היו טסטד באמצעות primers ה-PCR עבור תא גנגליון ברשתית סמנים Brn3b ו Pax6. עבור assay זה, 1 μl של cDNA היה נתון PCR במשך 30 מחזורים. בזמן אמת כמותי PCR יהיה assay עדיף, אבל זה יכול להיות יקר מדי ואינו הכרחי רק להעריך את איכות cDNA. כל 8 של תאים בודדים נדבקה Brn3b ו 6 מתוך 8 עבור Pax6 (איור 3 ב). אפילו כתמי cDNA שהיו חזקים פחות להקות המיוצרים עבור Brn3b ו Pax6. למרות התוצאות הללו PCR, זה הניסיון שלנו כי כתמי cDNA כגון אלה נתיבים B, C, D ו-E לא תניב הכלאות חזקים על מערכים Affymetrix והם נמנעו בדרך כלל. גן מסוים PCR עבור סמן photoreceptor CRX שימש כדי לקבוע את רמת הזיהום של cDNAs תא בודד (איור 3 ב). סמן photoreceptor נבחר כי תאים אלה מהווים את הרוב של הרשתית (~ 70%), ולכן כל תמוגה התא שהתרחש קרוב לוודאי כרוכה מוט photoreceptors. יש רק כמות קלוש של ההווה CRX אלה ההכנות cDNA גם לאחר 30 מחזורים של PCR. לבסוף, המסך הזה PCR המבוסס על יכול לשמש כדי להתחיל לקבוע אילו קבוצות משנה של סוג תא מסוים את cDNAs נגזרו לפני העמדת להם פרופיל microarray מלא. זו יכולה לסייע לתעדף את התאים צדודית, כמו זה היא הצעד היקר ביותר בתהליך. כך, למשל, זיהינו תת קבוצות של תאים הגנגליון ברשתית ידי הקרנת להם את קיומו של הגן Tachykinin1 (איור 3 ב).
ממסך ה-PCR מבוסס קטן, תאים בודדים מסוימים נבחרים ו cDNAs שלהם הכלאה כדי microarray Affymetrix. נתוני microarray משווים דפוסי ניתן לגלות באמצעות אלגוריתמים באשכולות רגילים. Heatmaps, כמו באיור 4, נוצרות כדי לייצג באופן גרפי את הנתונים. ישנן שתי מסקנות עיקריות לגבי אפיון התא היחיד הנתונים בתרשים 4. ראשית, הגנים לידי ביטוי סוגי תאים מסוימים ניתן למצוא כמעט אך ורק באותם סוגי תאים לאחר פרוטוקול תא בודד מבוצע. ברוב המקרים שבהם הגנים סמן של סוג תא אחד מצויים גם סוג התא השני, כגון ההבחנה, כי התאים דו קוטבית להביע כמה גנים "רוד" ברמות נמוכות יותר, בביטוי זה סוג התא השני הוא אישר בקלות באתרו על ידי אחד ההכלאה או מכתים נוגדנים. שנית, בתוך amacrine מגוונת יותר תאים פרופילים הגנגליון, ההטרוגניות של ביטוי גנים ניכר מיד. Pou4f1 באה לידי ביטוי רק על 1/4 של תאים הגנגליון מתפתחות, בעוד Nr4a2 ו Scube2 שתי דוגמאות של גנים לידי ביטוי הטרוגני בתאים amacrine שונים. למעשה, הגנים המוצגים Heatmap הם רק מדגם קטן כמו כמה מאות גנים זוהו כפי שאושרו סמנים של תאים הגנגליון מתפתחות או סמנים של אוכלוסיות שונות של תאים amacrine 2,4.
class = "jove_content"> 
באיור 1. תרשים זרימה של שיטת תא בודד פרופיל. הרשתיות ראשון הם מבודד ניתק לתוך תאים בודדים באמצעות פפאין. שנית, תאים בודדים נקצרים עם מחט זכוכית משך והפקיד לתוך צינורות ה-PCR. התאים lysed ו cDNA הגברה באמצעות שעתוק לאחור ולאחריו ה-PCR. איכות cDNA וכתוצאה מכך מוערך על ג'ל agarose כמו זה המוצג. אחרי הסולם DNA במסלול 1, נתיבי מראים כתמי cDNA של תאים בודדים (מסומנת בסוגריים אדומות) לסירוגין עם מוצרי הגברה מ שולטת בתקשורת. מריחות של איכות זו (בסוגריים האדומים) הם הכלאה כדי microarrays Affymetrix.
איור 2. תמונות של מחטים צינור הרכבה aspirator. תאים בודדים מבודדים באמצעות פעולה של נימימשך micropipette כוס (קוטר פנימי 0.5 מ"מ, קוטר חיצוני 1.04 מ"מ) מועברים על ידי לחץ של נושבת לתוך aspirator. חשוב צינור aspirator הוא גם מספיק זמן כדי לתמרן בקלות וקצר מספיק כדי למלא באופן מהימן תאים בודדים. מבט תקריב של צינור נימי נכנס מחט מוצג ב '
איור 3. דוגמה מייצגת של כתמי תא בודד cDNA ו PCRs גנים ספציפיים. כדי לקבוע את האיכות של תא בודד לאחר cDNA הגברה, 10 μl של המדגם כל תא בודד נוהלו על 1% agarose ג'ל יחד עם שליטה שלילי (א '). למרוח אמור להופיע בין 500-2000 bp. הקרנה נוספת PCR מבוסס על גנים מסוימים יכול לעזור לזהות / לאשר את סוג תא בודד ואת כמות הזיהום הנוכחי במדגם (ב '). פריימרים ספציפיים של התא גנגליון ברשתית סמנים Brn3bו Pax6 נבדקו כדי לוודא את זהותו של תאים אלה (שורות 1 ו -2). כדי להעריך את כמות זיהום photoreceptor בהכנת, פריימרים ספציפיים סמן photoreceptor CRX שימשו (שורה 3). תת קבוצות של תאים הגנגליון עשוי גם להיות מזוהה באמצעות הקרנת עבור סמנים כמו Tachykinin1 (שורה 4).
באיור 4. ביטוי תא בודד של גנים סמן. התוצאות microarray של גנים נבחרים לידי ביטוי ב -22 תאים בודדים שונים מוצגים בפורמט Heatmap. עוצמות מן האותות microarray כבר scaled להתכתב עם האינטנסיביות של צבע אדום. שחור מציין את העדר האות על microarray. תאים ברשתית את הגנגליון (RGC) מבשרי המוצגים בודדו נקודות זמן עובריים, בעוד תאים אחרים נותקו מן הרשתית בוגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר המתרחבת של מחקרים חושפים שונות חזקים תא אל תא אוכלוסיות שנחשבו הומוגנית יותר מבחינת ביטוי הגנים שלהם 6,8. לפחות במקרה אחד, ביטוי הגן הזה "רעש" הוכח לשחק תפקיד ביולוגי חשוב 13. ביטוי גנים ההבדלים בין תאים בודדים הם הסתירו באמצעות מסורתיים כולו רקמות שיטות. ניסויים אלה ליצור את פרופיל הביטוי של התא "הממוצע", אשר לא יכול להיות נציג 14. כאן אנו מציגים שיטה בידוד וזיהוי של דפוסי ביטוי גנים של תאים ברשתית בודדים. מחקר של תאים בודדים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההטרוגניות הסלולר ביסוד רקמות מורכבות, שהוא קריטי לקביעת ייחודיים דפוסי ביטוי גנים של סוגי תאים שונים. בנוסף, תא יחיד בידוד יכול לספק תובנות לגבי התוכניות גנים המניעים את פעילות indivתאים idual של נקודות זמן לאורך הפיתוח. למרות שימושי במיוחד בחקר מערכת העצבים, שם התפקוד של רשתות סלולריות מורכבות יכולים לסמוך על ביטוי הגן ייחודי של סוגי תאים נדירים, פרוטוקול זה ניתן להתאים לבודד תאים בודדים מרקמות שונות.
ברשתית מוקדם בפיתוח Murine, בתאי הגנגליון, תאים אופקיים, תאים חרוט photoreceptor ותאי amacrine נוצרות כל בחלון חופפים הזמן 15. בנוסף, כל תא אשר יצאו את מחזור התא נמצא בשלב אחר של ההתבגרות ועובדה זו רק מוסיף למורכבות של הרשתית המתפתח. לבסוף, עבור סוגים מסוימים של נוירונים ברשתית, קיימים מורפולוגיות שונות ומשונות (עד ~ 30 במקרה של תאים amacrine) ברשתית בוגרת 16. מאז הרשתית היא כזו תערובת של סוגי תאים, microarray וניתוח הסידורי של ביטוי גנים (SAGE) מחקרים המבוססים על 17-19, כי הסתמכה על homogenization של הרשתית כולה אינם יכולים לחשוף את סמני הגנים לידי ביטוי תת נדירים לא מצליח לפתור דינמיים ביטוי גנים הבדלים בין סוגי תאים, במיוחד בתקופת פיתוח. כדי להתחיל להבין את המורכבות של סוגי תאים שונים, הן ברשתית מבוגרים במהלך התפתחות הרשתית, גן יחיד את התא ביטוי פרופילים של ~ 200 תאים בודדים רבים בנקודות זמן שונות כבר ניתחו 2-5,8. את הנתונים המתקבלים סיפקה שורה של סמנים חדשים עבור סוגי תאים בודדים ובתנאי צוהר מעברים חשובים בזמן התפתחותית שהיו קודם לכן שלא מעריכים אותם.
ביטוי בפרופילים בודדים סלולריים חשפו הטרוגניות רבה ביטוי גנים בתאים amacrine 4, שם זה היה צפוי, ובכל התאים מולר גליה, שם היה צפוי 5. תוך בחינה של נתונים יחיד סלולריים amacrine גילה יותר מ -450 גנים התבטאו amacrineתאים אחרים שלא נכללו סוגי תאים ברשתית, אף אחד הגנים הללו באו לידי ביטוי כל התאים amacrine 4. תוצאות אלו כנראה נובעות מהעובדה כי מעמד תא amacrine מגוונת מאוד הטרוגניות הבסיסית היא השתקפות של פונקציות שונות של תאים אלה. ממצאים אלו לא היה אפשרי באמצעות שלמות רקמות המבוססות גישות. לבסוף, רכיבה על אופניים ובתאים רשתית (RPCs) מוצג התואר הגבוה ביותר של ההטרוגניות על ביטוי הגנים של כל אחד מסוגי התאים ברשתית צדודית 8. גורמי תעתוק היו בכיתה של גנים עם בדרגה הגבוהה ביותר של הטרוגניות בין ובתאים, דבר המצביע על כך דינמיים ביטוי בדפוסי הגן יכול לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות סוגים שונים תאים ברשתית 8. שוב, תוצאות אלו לא היה אפשרי ללא שימוש בטכניקה אחת ביטוי גנים בתא פרופיל.
בית transcriptome סלולריים מחקריםיכול גם להיות מנוצל כדי לקבל תובנות לגבי מנגנוני המחלה. במחלות ניווניות רבות, כולל מחלות ניווניות של הרשתית, הנוירונים מתים תוך כמה נוירונים שכנים לשרוד 20. הבנת למה תאים מסוימים עוברים אפופטוזיס דורש זיהוי של גנים או תוכניות הגן, כי הם שינו בתאים בודדים אלה מודלים המחלה. כולו רקמות מודלים שוב פוטנציאל להסתיר את השינויים מאז התאים לרוב אינם מתים בעת ובעונה אחת, ולכן בכל רגע נתון הרקמה הוא תערובת של תאים מתים לשרוד. בנוסף, עבור סוגי סרטן רבים בתא המוצא היא שאלה פתוחה. הדבר נכון במיוחד במקרה של רטינובלסטומה בעין הילדות הגידול. לאחרונה באמצעות פרוטוקול פרופיל יחיד התא מפורטים כאן, הוכח כי תאים בודדים retinoblastomas בעלי ביטוי גנים תוכניות של סוגי תאים מרובים 21. נראה כי תאים אלו הם בני כלאיים של ובתאים שלא עברו התמיינות נוירונים 21. ניסויים אלה נדרש ניתוח ברמת תא בודד ולא היה אפשרי עם גישות רקמות שלמות.
גישות חלופיות
הגברה ליניארית מהווה חלופה פרוטוקול ה-PCR המבוססת על הגברה מפורטים כאן. בעוד ה-PCR המבוססת על הגברה הוא האמין לגרום עיקום של שפע יחסי, הגברה לינארית נחשב לשמור על יחסים אלה 22. הטכניקה של הגברה ליניארית שימש סוגי פרופיל עצביים מספר 23. עם זאת, השוואה ישירה בין שתי השיטות הראו כי טכניקת הגברה ליניארית יכולה להיות קשורה עם שיעור גבוה שלילית כוזבת 24,25. אנו מעדיפים את שיטת ה-PCR המבוססת על המפורט בדוח זה משתי סיבות. ראשית, בניסויים שלנו אנו מתמקדים גנים עם ביטוי חזק ההבדלים בין תאים. שנית, מצאנו מתאם טוב מאוד בין תא בודד שלנו microarray Proהגשת ניסויים במחקרים הכלאה באתרו של אותם גנים. למעשה, עד היום יש לנו לבצע הכלאות באתרו של מאות גנים הבחינו לפחות 75% תואמת את הדפוס החזוי מ microarrays את. זהו ככל הנראה הערכה שמרנית שכן הסיבה הנפוצה ביותר היא חוסר התאמה חוסר האות ב בדיקה באתרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
References
- Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
- Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
- Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup. Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).
- Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).
- Roesch, K. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).
- Ramos, C. A. Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2, e159 (2006).
- Chiang, M. K., Melton, D. A. Single-cell transcript analysis of pancreas development. Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).
- Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression. PLoS ONE. 3, e1588 (2008).
- Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).
- Stevens, C. F. Neuronal diversity: too many cell types for comfort. Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).
- Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).
- Kim, D. S. Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina. J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).
- Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453, 544-547 (2008).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).
- Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).
- Masland, R. H., Raviola, E. Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina. Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).
- Blackshaw, S. Genomic analysis of mouse retinal development. PLoS Biol. 2, e247 (2004).
- Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).
- Chowers, I. Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).
- Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations. Nature. 406, 195-199 (2000).
- McEvoy, J. F. -O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis. Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).
- Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
- Ginsberg, S. D., Che, S. Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons. J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).
- Iscove, N. N. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).
- Subkhankulova, T., Livesey, F. J. Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level. Genome Biol. 7, R18 (2006).
