وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

Summary

تم وصف طريقة لعزل خلايا الشبكية واحد، والتضخيم لاحق من cDNAs بهم. وحيدة الخلية transcriptomics يكشف عن درجة من عدم التجانس الحالي الخلوي في الأنسجة والجينات تكشف علامة جديدة للسكان الخلية نادر. ويمكن تعديل البروتوكول المرافق لتتناسب مع العديد من أنواع مختلفة من الخلايا.

Abstract

السكان درجة عالية من التخصص، ولكنها صغيرة جدا من الخلايا تلعب دورا هاما في العديد من الأنسجة. وكان تحديد خلية من نوع علامات وبرامج محددة التعبير الجيني للخلية فرعية نادرة للغاية تحديا باستخدام معيار كامل الأنسجة النهج. التنميط الجيني التعبير من الخلايا الفردية تسمح للوصول لم يسبق لها مثيل إلى أنواع الخلايا التي تشكل إلا نسبة ضئيلة من مجموع النسيج ^1-7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة البرامج التعبير الجيني الذي يتم التعبير عن عابر في أعداد صغيرة من الخلايا خلال التحولات التنموية الحيوية ^8.

هذه مسألة التنوع الخلوية تنشأ مرارا وتكرارا في الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث الوصلات العصبية يمكن أن يحدث بين خلايا مختلفة تماما ^9. العدد الدقيق للأنواع الخلايا متميزة ليس معروفا على وجه التحديد، ولكن لم يقدر أنه قد يكون هناك ما يصل الى 1000 من أنواع مختلفة في القشرة أناtself ^10. قد تكون وظيفة (ق) من الدوائر العصبية المعقدة الاعتماد على بعض أنواع الخلايا العصبية النادرة والجينات التي تعبر عنها. من خلال تحديد علامات جديدة وتساعد على تصنيف جزيئيا الخلايا العصبية المختلفة، ونهج وحيد الخلية هو مفيدة بشكل خاص في تحليل أنواع الخلايا في الجهاز العصبي. كما قد يساعد على توضيح آليات تطوره العصبي عن طريق تحديد الجينات وأعرب تفاضلي ومسارات الجينات خلال المراحل الأولى من التنمية سلف الخلايا العصبية.

كما منديل، بسيط الوصول إليها بسهولة مع تنوع كبير الخلايا العصبية، في شبكية العين عند الفقاريات هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة عمليات التنمية الخلوية، وتمايز الخلايا العصبية وتنويع الخلايا العصبية. ومع ذلك، كما هو الحال في أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي، ويمكن لهذا التنوع الخلوية يمثل مشكلة لتحديد مسارات الوراثية التي تدفع الأسلاف شبكية العين إلى اعتماد مصير خلية معينة، وخصوصا ان مبصرات قضيب يشكلون أماهjority من السكان خلايا شبكية المجموع ^11. هنا نقدم تقريرا عن طريقة لتحديد هوية النصوص التي أعرب عنها في خلايا الشبكية واحد (الشكل 1). أسلوب التنميط وحيدة الخلية يسمح لتقييم حجم السكان الحالي عدم التجانس داخل الخلوية المختلفة من شبكية العين ^2،4،5،12. وبالإضافة إلى ذلك، فقد كشفت هذه الطريقة مجموعة من الجينات المرشحة الجديدة التي قد تلعب دور (ق) في مصير الخلية عمليات صنع القرار التي تحدث في مجموعات فرعية من الخلايا الاصلية في شبكية العين ^8. مع بعض التعديلات البسيطة في البروتوكول، يمكن أن تستخدم هذه التقنية لأنسجة عديدة ومختلفة وأنواع الخلايا.

Protocol

1. خلية التفكك

1. مخطط انسيابي يحدد بروتوكول يظهر هو الشكل 1. لأرقام التسويقي للكواشف خاصة لاستخدامه خلال هذا البروتوكول، يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1. تشريح شبكية العين في حمام برنامج تلفزيوني. خلال تشريح، فمن الأفضل لإزالة الجسم الزجاجي والعدسة منذ ابقائها مع شبكية العين من الممكن أن تعوق التفكك. أنها ليست دائما ذات أهمية حاسمة لإزالة كافة الظهارة الشبكية الصباغ (RPE)، وفي بعض الحالات قد يكون من المستحيل إزالته تماما. ومع ذلك، لاحد التجارب التنميط خلية من خلايا مستقبلة للضوء، ينبغي إزالة RPE. يمكن للفشل لإزالة RPE يؤدي إلى تلوث لمحات الخلية قضيب مع RPE الجينات التي أعرب عنها. وهذا هو الأرجح بسبب الاتصال بين خلايا مستقبلة للضوء وRPE لل.
   للانفصال، وحضنت كل شبكية العين الفئران البالغين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 20ميكرولتر المنشط غراء، 20 ميكرولتر سيستين 25 مم في EDTA 5 ملم، و 360 ميكروليتر هانك في محلول ملحي متوازن (HBSS) تستكمل مع 10 HEPES ملي. وتستخدم نصائح ماصة فلتر ذات الرؤوس لجميع الخطوات في جميع أنحاء بروتوكول للحد من التلوث المحتمل. وسوف تركز غراء ووقت حضانة تختلف وفقا لعمر وطبيعة النسيج. على سبيل المثال، أن تنأى تطوير شبكية العين معزولة في يوم ما بعد الولادة 0 (P0)، احتضان شبكية العين في 10 غراء المنشط ميكرولتر، 10 ميكرولتر سيستين 25 مم في EDTA 5 ملم، و 380 ميكروليتر هانك في محلول ملحي متوازن (HBSS) تستكمل مع HEPES 10 ملم لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية. شبكية العين من مختلف الأنواع كما تتطلب ظروف مختلفة قليلا. شبكية العين هي أرق من الدجاج شبكية العين الفأر في معظم مراحل التنمية. باستخدام 10 ميكرولتر المنشط غراء، 10 ميكرولتر سيستين 25 مم في EDTA 5 ملم، والحل هانك 380 ميكروليتر في سولت المتوازن (HBSS) تستكمل مع HEPES 10 ملم لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية كافية لفصل تيذات المناظر شبكية العين.
2. اضغط بلطف على أنبوب لإخراج أي خلايا تسويتها، يسحن ثم بلطف 10-20 مرات مع pipettor P1000. احتضان ل10 دقيقة إضافية بلغت 37 درجة مئوية إذا كتل كبيرة من الأنسجة لا تزال قائمة ومن ثم إعادة يسحن، 10-20 مرة.
3. إضافة 5 ميكرولتر من الدناز أنا (10 U / ميكرولتر) واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يسحن بلطف مع pipettor P1000. والعدد الدقيق للمرة يجب أن يتم تحديد تجريبيا، ولكن يقع عادة ما بين 10-20.
4. أجهزة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق إزالة طاف، وترك 100-200 ميكروليتر من السائل في الجزء السفلي، والاستفادة من أنبوب لإخراج بيليه. إضافة 1 مل من HBSS وresuspend وبيليه مع سحن لطيف. التنصت على أنبوب أمر بالغ الأهمية هنا كما resuspending ببساطة بيليه مع ليز العديد من الخلايا في شبكية العين. هذا صحيح لا سيما مع شبكية العين الفئران البالغين.
5. الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق بعناية إزالة طاف وresuspend في 450 ميكروليتر من PBS تحتويجي BSA 0.1٪. من المهم أن إزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن للتقليل من وجود mRNAs من الخلايا هي lysed ومنتجات أي من التفكك التي يمكن أن تحول دون ردود الفعل في المستقبل.

2. حصاد خلايا واحدة

1. إعداد طبقين 6 سم تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1٪. لوحة الخلايا تنفصل على طبق واحد وتسمح للخلايا لتسوية ما لا يقل عن 5 دقائق. كثافة الخلية المستخدمة تعتمد إلى حد كبير على طبيعة الخلايا واحد يجري لمحة. على سبيل المثال، للخلايا نادرة جدا المسمى مع علامة فلوري مثل هذا GFP، ومطلي شبكية العين فصل كامل على صحن واحد 6 سم. للخلايا التي هي إلى حد ما أكثر وفرة، والمطلية في البداية أقل من الخلايا لجعلها أسهل للحصاد واحد (أو قريبة جدا من واحد) مع خلية micropipette الأولى.
2. وضع لوحة من الخلايا تنفصل عن مجهر مقلوب. نستخدم نموذج IMT-2 من أوليمبوس. باستخدام بال micropipettes التي تم رسمها لاسلكي بالإنترنتشمال شرق رأس (الداخلية قطرها 0.5 ملم، القطر الخارجي 1،04 ملم) (الشكل 2)، وجنبا إلى جنب مع أنبوب الشافطة، حصاد خلية واحدة. الخلايا تدخل بسهولة في micropipette عندما يتم وضعها على مقربة من لهم على طبق. فمن الأهمية بمكان أن الأنبوب الشافطة ليست طويلة جدا ولا قصيرة جدا لالمسافة إلى مرحلة المرتبطة المجهر المقلوب (أنابيب الشافطة التي نستخدمها مع مجهر مقلوب لدينا هي 38.1 سم طويلة). إذا كان أنبوب طويل جدا، قد لا يمكن طرد الخلايا بكفاءة من micropipette في أنبوب جمع. السبب الرئيسي نستخدم القديمة IMT-2 نموذج المجهر المقلوب هو أننا قد وجدت أنه يحتوي على مسافة مثالية لمرحلة للأنابيب لدينا الجمعية الشافطة. بعد دخول micropipette، وطرد خلية (أو خلايا) على لوحة ثانية (لوحة غسيل) لضمان أن يتم حصاد واحد وخلية واحدة فقط لتحديد ملامح التعبير الجيني. على لوحة 2 غالبا ما يكون من الضروري إزالة أي خلايا غريبة مع micropipette جديدأو نقل خلية من الاهتمام إلى موقع آخر للتأكد من أنه ليس هناك سوى خلية واحدة يدخل micropipette.
3. عندما يتم معزولة تماما خلية واحدة من الخلايا المجاورة، واستخدام micropipette جديدة لنضح الخلية من الفائدة كما في القسم 2.2، ثم طرد مباشرة في أنبوب 0،2 مل PCR يحتوي على 4،5 تحلل الخلية ميكرولتر العازلة. وطرد خلية على الجانب من الأنبوب، والحرص على عدم قطع غيض من micropipette في أنبوب. ويمكن نسج هذه العينات لفترة وجيزة في microcentrifuge مقعد العلوي أن تزج الخلية في عازلة تحلل. وعادة ما يتم هذا الغزل بعد كل خلية 5 ثم مرة أخرى في نهاية collection.Tubes التي تحتوي على الخلايا وحيدة في المنطقة العازلة تحلل يجب أن تبقى على الجليد لمدة عزل خلية واحدة. لأفضل النتائج، يتم جمع الخلايا واحد ضمن إطار لمدة ساعتين في مرحلة ما بعد تفكك. بعد هذا الوقت قد انقضى، فمن الأفضل للشروع في خطوة النسخ العكسي منذ وقت إضافي كان observإد لزيادة فرص تدهور الحمض النووي الريبي.

3. عكس النسخ

1. تدور فترة وجيزة على العينات في minicentrifuge الفوق لضمان مغمورة جميع الخلايا واحد في خلية العازلة تحلل. لتعزيز تحلل الخلية، واحتضان العينة على 70 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. في thermocycler. تضع فورا الأنابيب مرة أخرى على الجليد.
2. ترك الأنابيب في الثلج لمدة 2 دقيقة. لجميع الإضافات كاشف، استخدم فلتر طرف ماصة نصائح لمنع التلوث. لإجراء النسخ العكسي، إضافة 0.33 ميكروليتر مرتفع الثالث (200 U / ميكرولتر)، 0.05 ميكروليتر ريبونوكلياز المانع (40 U / ميكرولتر)، و 0.07 ميكروليتر T4 جينة بروتين 32. احتضان خليط التفاعل لمدة 50 دقيقة عند 50 درجة مئوية في thermocycler. تعطيل الإنزيم في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ومكان على الجليد.
3. لإزالة فتيل مجانا، إضافة 0.1 الواق نوكلياز خارجية ميكروليتر (10X)، 0.8 درهم ميكرولتر ₂ 0 (الجزيئية أحياء الصف)، و 0.1 نوكلياز خارجية ميكرولتر أنا (20 U / ميكرولتر). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في1 thermocycler. تعطيل الإنزيم بواسطة احتضان رد الفعل في 80 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ومن ثم وضع أنابيب على الجليد.

4. المخلفات واحدة خلية-PCR

1. إضافة 6 ميكرولتر من خليط التفاعل المخلفات واستخدام thermocycler لاحتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، و 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية
2. إضافة 10 ميكرولتر من عينة الذيل إلى خليط التفاعل PCR وتنفيذ أعمال تركيب الشق الثاني والتضخيم PCR باستخدام الشروط التالية:
   1. 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
   2. 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
   3. 72 درجة مئوية لمدة 16 دقيقة
   4. 93 درجة مئوية لمدة 40 ثانية
   5. 67 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
   6. 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق، واضاف 6 ثوانى لكل دورة
   7. انتقل إلى الخطوة 4 34 مرة
   8. 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة
   9. عقد في 4 درجات مئوية

5. وصفها لرقائق Affymetrix

1. التسمية 10-20 ميكروغرام من [كدنا] (تركيز النتيجة [كدنا] تضخيموعادة ما جى من خلية واحدة ~ و1 ميكروغرام / ميكرولتر) للحصول على تهجين قوي على ميكروأرس Affymetrix. الأول، جزء من [كدنا] بإضافة 10-20 ميكرولتر من [كدنا] وحيدة الخلية إلى 8 1X ميكرولتر واحدة الإستعارة، كل العازلة و 1 ميكرولتر من المخفف (1:10 في 1X واحدة الإستعارة، كل العازلة) DNaseI في 80 ميكرولتر رد فعل. احتضان في thermocycler لمدة 13 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تعطيل وأنا الدناز لمدة 15 دقيقة في 100 درجة مئوية ومكان على الجليد.
2. إضافة 20 ميكرولتر العازلة TDT 5X، 2.5 البيوتين ميكرولتر N6-ddATP (انزو العلوم البيولوجية)، و 1 TDT ميكروليتر (01:08 المخفف في عازلة TDT).
3. احتضان لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية، ثم 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. متجر في -20 درجة مئوية أو هجن فورا إلى ميكروأري Affymetrix. يتم تنفيذ التهجين باستخدام معيار بروتوكولات Affymetrix.

6. ممثل النتائج

لتقييم جودة ميكرولتر، [كدنا] 10 من [كدنا] عينة تم تحميلها على هلام الاغاروز 1٪. ويحكم على رأسها [كدنا] من قبل مجموعة حجم (500-2000 بي بي)وشدة تشويه [كدنا] (الشكل 1 والشكل 3A). في هلام المبين في الشكل 1، كل حارة أخرى يظهر تشويه [كدنا] من خلايا الشبكية معزولة E16.5. في الممرات بين إظهار مسحة الناتجة عندما يستنشق وسائل الاعلام فقط إلى إبرة وأودعت في أنبوب PCR. هذه المسارات هي أبدا خالية تماما من مسحة باهتة، لكنها لا تظهر أية نتائج عندما يتم استخدام الجينات المحددة الاشعال PCR لتضخيم الجينات منها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لشدة التشويه [كدنا] تختلف نوعا ما (قارن الشكل 1 والشكل 3A). في الممرات 3A الشكل 1، و، ز، ح، وتحتوي على مسحات [كدنا] قوية بينما الممرات ب، ج، د، ه، وإلى حد كبير هي أقل قوة.

يتم استخدام الجينات المحددة PCR كشاشة ثانوية من نوعية [كدنا] من خلية واحدة. تم عزل cDNAs في الشكل (3) من الفلورسنت خلايا عقدة شبكية العين، وكانوا بصدد إجراء تجاربد باستخدام بادئات PCR للالشبكية العقدة خلية علامات Brn3b وPax6. لهذا الفحص، تعرض 1 ميكرولتر من [كدنا] إلى PCR لمدة 30 دورات. سيكون في الوقت الحقيقي PCR كمي يكون من الأفضل فحص، ولكنها يمكن أن تكون باهظة التكلفة، وليس من الضروري لتقييم جودة مجرد [كدنا]. اختبرت كل 8 من خلايا وحيدة إيجابية لBrn3b و 6 من أصل 8 لPax6 (الشكل 3B). حتى كدنا] المسحات التي كانت أقل قوة العصابات المنتجة للBrn3b وPax6. على الرغم من هذه النتائج PCR، فمن خبرتنا أن المسحات [كدنا] مثل تلك الموجودة في الممرات ب، ج، د، ه و لم تسفر التهجين قوي على صفائف Affymetrix ويتم تجنب عموما. تم استخدام جينات محددة PCR لCRX علامة مبصرة لتحديد مستوى التلوث في cDNAs خلية واحدة (الشكل 3B). وقد تم اختيار علامة مبصرة لأن هذه الخلايا تشكل الغالبية العظمى من شبكية العين (~ 70٪)، وبالتالي، فإن أي تحلل الخلية التي وقعت على الأرجح إشراك قضيب photoreceptors. لم يكن هناك سوى مبلغ خافت من الحاضر CRX في هذه الاستعدادات حتى كدنا] بعد 30 دورات من PCR. أخيرا، يمكن استخدام هذه الشاشة PCR المستندة إلى البدء في تحديد مجموعات فرعية من نوع خاص خلية تم الحصول على cDNAs من قبل تعريضهم إلى التنميط ميكروأري كامل. هذا يمكن أن يساعد على إعطاء الأولوية لالخلايا التي يتم لمحة، وهذه هي الخطوة الأكثر كلفة في هذه العملية. على سبيل المثال، تمكنا من تحديد مجموعات فرعية من الخلايا عقدة شبكية العين عن طريق فحص لهم لحضور Tachykinin1 الجين (الشكل 3B).

من الشاشة PCR صغيرة مقرها، ويتم اختيار الخلايا واحدة خاصة بهم وcDNAs المهجنة لميكروأري Affymetrix. تتم مقارنة البيانات ميكروأري ويمكن اكتشاف أنماط باستخدام خوارزميات التجميع القياسية. تتولد Heatmaps، كما هو الحال في الشكل (4)، لتمثيل البيانات بيانيا. هناك نوعان من الاستنتاجات الرئيسية المتعلقة التنميط خلية واحدة البيانات في الشكل 4. أولا، يتم العثور على الجينات التي أعرب عنها في أنواع معينة من الخلايا بشكل حصري تقريبا في تلك الأنواع الخلية بعد يتم تنفيذ بروتوكول خلية واحدة. في معظم الحالات حيث تم العثور على جينات علامة من نوع خلية واحدة أيضا في نوع الخلية الثانية، مثل ملاحظة أن الخلايا القطبين التعبير عن بعض "قضيب" الجينات في المستويات الدنيا، ويتأكد بسهولة هذا التعبير في نوع الخلية الثانية من قبل، سواء في موطنهم تهجين أو تلطيخ الجسم المضاد. الثانية، ضمن عديم الاستطالات أكثر تنوعا وملامح خلية العقدة، والتباين في التعبير الجيني يتضح على الفور. وأعرب عن Pou4f1 فقط في حوالي 1/4 للخلايا العقدة النامية، في حين Nr4a2 وScube2 مثالين من الجينات في خلايا أعرب heterogeneously عديم الاستطالات مختلفة. في الواقع، على الجينات هو مبين في heatmap ليست سوى عينة صغيرة كما تم التعرف على عدة مئات من الجينات، وأكد كدلالة على وجود خلايا العقدة النامية أو كعلامات من مجموعات مختلفة من الخلايا عديم الاستطالات ^2،4.

الطبقة = "jove_content">
الشكل 1. مخطط لطريقة التنميط خلية واحدة. شبكية العين الأولى هي المعزولة وفصلها في الخلايا الفردية باستخدام غراء. الثانية، ويتم حصاد الخلايا واحد بإبرة الزجاج وسحبت وأودعت في أنابيب PCR. وهذه الخلايا هي lysed وكدنا] تضخيم باستخدام النسخ العكسي تليها PCR. ويتم تقييم نوعية الناتج [كدنا] على هلام الاغاروز مثل واحد هو مبين. بعد أن سلم الحمض النووي في المسار الأول، والممرات إظهار مسحة [كدنا] من خلايا مفردة (المشار إليها بواسطة الأقواس الحمراء) بالتناوب مع منتجات التضخيم من الضوابط وسائل الاعلام. وتهجين مسحات من هذه النوعية (بين قوسين باللون الأحمر) لميكروأرس Affymetrix.

الشكل 2. يتم عزل صور الإبر والشافطة الجمعية أنبوب. الخلايا واحدة باستخدام عمل شعري منسحبت زجاج micropipette (الداخلية قطرها 0.5 ملم، القطر الخارجي 1.04 ملم) ويتم نقلها بواسطة ضغط النفخ في الشافطة. من المهم أن أنبوب الشافطة على حد سواء لفترة كافية للتلاعب بسهولة وقصيرة بما فيه الكفاية لأداء موثوق بها الخلايا الفردية. ويبين وجهة نظر عن قرب من الأنابيب الشعرية وانسحبت إلى إبرة في B.

الشكل 3. مثال ممثل مسحات خلية واحدة [كدنا] وتقارير إتمام المشروعات جين معين. لتحديد نوعية خلية واحدة [كدنا] بعد التضخيم، تم تشغيل 10 ميكرولتر من كل عينة خلية واحدة على هلام الاغاروز 1٪ جنبا إلى جنب مع سيطرة سلبية (A). وينبغي أن يكون تشويه تظهر بين 500-2000 شركة بريتيش بتروليوم. ويمكن إضافية PCR القائم على الكشف عن جينات محددة تساعد على تحديد / تأكيد نوع من الخلايا التي تم عزلها ومقدار التلوث الحالي في العينة (B). الاشعال محددة لخلية العقدة الشبكية وضع العلامات Brn3bوجرى اختبار Pax6 لتأكيد هوية هذه الخلايا (الصفوف 1 و 2). لتقييم حجم التلوث مبصرة في التحضير، واستخدمت بادئات محددة لCRX علامة مبصرة (الصف 3). ويمكن أيضا مجموعات فرعية من خلايا العقدة الكشف عن هويته من خلال فحص لعلامات مثل Tachykinin1 (الصف 4).

الشكل 4. وحيد الخلية من الجينات التعبير علامة. يتم عرض نتائج ميكروأري عن الجينات المحددة التي أعرب عنها في خلايا 22 واحد واضح في شكل heatmap. تم تحجيم شدة من الإشارات ميكروأري لتتوافق مع كثافة اللون الأحمر. أسود يشير إلى عدم وجود إشارة على ميكروأري]. تم عزل الخلية عقدة شبكية العين (RGC) السلائف تبين من النقاط الزمنية الجنينية، في حين تم عزل خلايا شبكية العين الأخرى من البالغين.

Discussion

عدد الآخذة في التوسع من الدراسات التي تكشف عن قوة الخلية الى خلية التغير في السكان الذين يعتقد انهم كانوا أكثر تجانسا فيما يتعلق التعبير الجيني على ^6،8. في واحدة على الأقل، وقد تبين أن هذا الجين التعبير عن "الضجيج" للعب وظيفة هامة البيولوجية ^13. وتحجب الخلافات التعبير الجيني بين الخلايا الفردية باستخدام التقليدية كامل النسيج الأساليب. هذه التجارب توليد الملف تعبير عن خلية "متوسط"، والتي قد لا تكون ممثلة ^14. هنا نقدم وسيلة لعزل والتعرف على أنماط التعبير الجيني من خلايا الشبكية واحدة. دراسة الخلايا الفردية تسمح للباحثين للتحقيق في عدم تجانس الأنسجة الخلوية وراء المعقدة، وهو أمر حاسم لتحديد أنماط التعبير الجيني مميزة من مختلف أنواع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن وحيدة الخلية العزلة توفير نظرة ثاقبة على برامج الجينات قيادة نشاط individual الخلايا في وقت نقاط في جميع أنحاء التنمية. على الرغم مفيدة بشكل خاص في دراسة الجهاز العصبي، حيث أداء الشبكات الخلوية المعقدة يمكن أن تعتمد على التعبير الجيني فريد من أنواع الخلايا نادرة، يمكن تكييف هذا البروتوكول لعزل الخلايا الفردية من الأنسجة المختلفة.

في الشبكية المبكر النامية الفئران، يتم إنشاء جميع خلايا العقدة، والخلايا الأفقية، وخلايا مستقبلة للضوء والخلايا المخروطية عديم الاستطالات في إطار تداخل الوقت ^15. بالإضافة إلى ذلك، كل خلية التي خرجت من دورة الخلية هو في مرحلة مختلفة من النضج وهذه حقيقة، فقط يضيف إلى تعقيد شبكية العين النامية. أخيرا، بالنسبة لبعض أنواع من الخلايا العصبية للشبكية، توجد morphologies عديدة مختلفة (إلى ~ 30 في حالة الخلايا عديم الاستطالات) في شبكية العين ناضجة ^16. منذ الشبكية مثل هذا الخليط من أنواع الخلايا، ميكروأري والتحليل التسلسلي للالتعبير الجيني (SAGE) دراسات مقرها ^17-19 التي اعتمدت على homogenizأوجه من شبكية العين بأكملها غير قادرة على كشف علامات الجينات التي أعرب عنها في أنواع فرعية نادرة وغير قادرة على حل الخلافات دينامية التعبير الجيني بين أنواع الخلايا، وخصوصا خلال التنمية. لنبدأ في فهم مدى تعقيد أنواع مختلفة من الخلايا في كل من الكبار وشبكية العين خلال تطوير شبكية العين، وقد تم تحليل الجينات التعبير ملامح خلية واحدة من الخلايا 200 ~ فردي من العديد من نقاط زمنية مختلفة ^2-5،8. وقد وفرت البيانات الناتجة مجموعة من علامات جديدة لأنواع الخلايا الفردية، وقدمت نافذة على التحولات المهمة في وقت التنموية التي كانت محل تقدير من قبل.

التعبير عن خلية واحدة قد كشفت عن ملامح عدم تجانس كبير في التعبير الجيني في الخلايا عديم الاستطالات ^4، حيث كان من المتوقع، في الخلايا الدبقية، ومولر، حيث كان غير متوقع ^5. في حين كشفت دراسة للبيانات الخلية عديم الاستطالات واحدة أكثر من 450 الجينات التي تم الإعراب عنها في عديم الاستطالاتالخلايا واستبعادها من غيرها من أنواع الخلايا في شبكية العين، وأعرب عن أي من هذه الجينات في خلايا جميع عديم الاستطالات ^4. هذه النتائج على الأرجح تنشأ من حقيقة أن الطبقة خلية عديم الاستطالات هي متنوعة للغاية، والكامنة وراء عدم التجانس هو انعكاس لوظائف متميزة من هذه الخلايا. وهذه النتائج لم يكن من الممكن استخدام كل الأنسجة النهج القائمة. أخيرا، عرض الدراجات الخلايا الاصلية في شبكية العين (محاولات RPCs) أعلى درجة من التجانس في التعبير الجيني من أي نوع من أنواع خلايا شبكية لمحة ^8. وكانت عوامل النسخ فئة من الجينات وفقا لأعلى درجة من التجانس بين الخلايا الاصلية، مما يدل على أن دينامية أنماط التعبير الجيني يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في تطوير نوع من أنواع خلايا شبكية مختلفة ^8. مرة أخرى، فإن هذه النتائج لم تكن ممكنة دون استخدام جينات خلية واحدة أسلوب التنميط التعبير.

وحيد الخلية دراسات transcriptomeويمكن أيضا أن تستخدم لاكتساب المعرفة في آليات المرض. في كثير من أمراض الاعصاب، بما في ذلك الأمراض التنكسية الشبكية، بعض الخلايا العصبية في حين تموت الخلايا العصبية المجاورة البقاء على قيد الحياة ^20. فهم لماذا بعض الخلايا تخضع لموت الخلايا المبرمج يتطلب التعرف على الجينات أو برامج الجين الذي يتم تغيير في الخلايا الفردية في هذه النماذج المرض. وسوف كامل الأنسجة النماذج مرة أخرى تحجب يحتمل التغييرات منذ خلايا في كثير من الأحيان لا تموت في نفس الوقت، وبالتالي، في أي وقت معين من الأنسجة هي مزيج من الموت والباقين على قيد الحياة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، من أجل العديد من أنواع السرطان في خلية المنشأ هي مسألة مفتوحة. هذا هو الحال بشكل خاص مع ورم الشبكية الطفولة العين. مؤخرا باستخدام بروتوكول الخلية التنميط واحدة تفاصيلها هنا، تبين أن الخلايا الفردية من retinoblastomas تملك برامج التعبير الجيني من أنواع خلايا متعددة ^21. يبدو أن هذه الخلايا هي هجين من الخلايا الاصلية غير متمايز والخلايا العصبية ²1. هذه التجارب اللازمة تحليلا على مستوى خلية واحدة، وسوف لم يكن ممكنا مع النهج النسيج كله.

النهج البديلة

التضخيم خطي هو بديل لبروتوكول تضخيم PCR القائم على تفاصيلها هنا. في حين يعتقد PCR القائم على التضخيم أن يؤدي إلى انحراف العلاقات وفرة، ويعتقد أن تضخيم خطي للحفاظ على هذه العلاقات ^22. وقد استخدمت هذه التقنية من التضخيم خطي لمحة أنواع الخلايا العصبية عدة ^23. ومع ذلك، فقد أشارت مقارنات مباشرة بين طريقتين التي يمكن ان ترتبط تقنية تضخيم خطي مع ارتفاع معدل سلبية كاذبة ^24،25. نؤيد طريقة PCR مقرها بالتفصيل في هذا التقرير وذلك لسببين. أولا، في تجاربنا ونحن نركز على الجينات مع وجود اختلافات تعبير قوي بين الخلايا. ثانيا، لقد تم العثور على وجود علاقة جيدة جدا بين خلية واحدة لدينا ميكروأري المواليةتقديم تجارب ودراسات في التهجين في الموقع لنفس الجينات. في الواقع، حتى الآن لقد قمنا في التهجين الموضع لمئات من الجينات، ولقد لاحظت ما لا يقل عن 75٪ تتناسب مع نمط وتوقع من ميكروأرس. هذا هو الأكثر احتمالا تقدير متحفظ منذ السبب الأكثر شيوعا لتناقض هو عدم وجود إشارة من التحقيق في الموقع.