Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Summary

Verfahren zur Isolierung von einzelnen Zellen der Netzhaut und anschließende Amplifikation der cDNA beschrieben. Einzelzell-Transcriptomics zeigt den Grad der zellulären Heterogenität in einem Gewebe und deckt neuen Markergene für seltene Zellpopulationen. Die beigefügten Protokoll kann eingestellt werden, um viele verschiedene Zelltypen zu entsprechen.

Abstract

Hoch spezialisierte, aber außerordentlich klein Populationen von Zellen spielen eine wichtige Rolle in vielen Geweben. Die Identifizierung von Zelltyp-spezifische Marker und Genexpression bei extrem seltenen Zellpopulationen war eine Herausforderung unter Verwendung von Standard-gesamte Gewebe Ansätze. Genexpressionsanalysen von einzelnen Zellen ermöglicht einen beispiellosen Zugang zu Zelltypen, die nur einen kleinen Prozentsatz des gesamten Gewebes ^1-7 umfassen. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet, um die Genexpression, die vorübergehend in eine kleine Anzahl von Zellen während der dynamischen Entwicklungsübergänge ⁸ exprimiert zu prüfen.

Diese Ausgabe der zellulären Vielfalt stellt sich im Rahmen des zentralen Nervensystems (ZNS), wo neuronale Verbindungen zwischen ganz unterschiedlichen Zellen vorkommen können ^9. Die genaue Anzahl unterschiedlicher Zelltypen ist nicht genau bekannt, aber es wurde geschätzt, dass mehr als 1000 verschiedene Arten in der Rinde i seintself ^10. Die Funktion (en) von komplexen neuronalen Schaltkreise können auf einige der seltenen Arten neuronaler und die Gene die sie ausdrücken verlassen. Durch die Identifizierung neuer Marker und helfen, molekular klassifizieren verschiedene Neuronen, ist die Single-Cell-Ansatz besonders nützlich bei der Analyse von Zelltypen im Nervensystem. Es kann auch helfen, die Mechanismen der neuralen Entwicklung durch Identifizierung differentiell exprimierter Gene und Gen-Bahnen während der frühen Stadien der neuronalen Vorläuferzellen Entwicklung aufzuklären.

Als einfache, leicht zugängliche Gewebe mit erheblichen neuronalen Vielfalt, ist die Retina von Wirbeltieren als ein Modellsystem für die Untersuchung der Prozesse der zellulären Entwicklung, neuronale Differenzierung und neuronaler Diversifikation. Doch wie in anderen Teilen des ZNS, kann dieser zelluläre Vielfalt ein Problem für die Bestimmung der genetischen Signalwege, die retinalen Vorläuferzellen zu fahren, um eine bestimmte Zelle Schicksal annehmen zu präsentieren, zumal die Stäbchen-Photorezeptoren aus denen der maMehrheit der gesamten Netzhaut Zellpopulation ^11. Hier berichten wir ein Verfahren zur Identifizierung der Transkripte in einzelner retinaler Zellen (1) ausgedrückt. Die einzelnen Zellen Profilierung Technik erlaubt die Beurteilung der Menge an Heterogenität, in verschiedenen Zellpopulationen der Netzhaut ^2,4,5,12. Darüber hinaus hat diese Methode eine Reihe von neuen Kandidatengenen, die Rolle (n) in die Zelle Schicksal Entscheidungsprozesse, die in Teilmengen von retinalen Vorläuferzellen ⁸ auftreten können, spielen enthüllt. Mit wenigen einfachen Anpassung des Protokolls, kann diese Technik für viele verschiedenen Geweben und Zelltypen verwendet werden.

Protocol

1. Zelldissoziation

1. Ein Flussdiagramm, das Protokoll wird gezeigt, Abbildung 1 ist. Für die Bestellnummern der einzelnen Reagenzien in diesem Protokoll verwendet, entnehmen Sie bitte Tabelle 1. Sezieren die Netzhaut in einem PBS-Bad. Während der Dissektion, ist es am besten, den Glaskörper und die Linse, da halten sie mit der Netzhaut kann die Dissoziation behindern entfernen. Es ist nicht immer von entscheidender Bedeutung für alle dem retinalen Pigmentepithel (RPE) zu entfernen, und in einigen Fällen kann es unmöglich, vollständig zu entfernen. Doch für einzelne Zelle Profilierung Experimente von Photorezeptoren, sollte das RPE entfernt werden. Wird das RPE entfernen kann, um eine Kontamination der Stange Zelle Profile mit RPE exprimierten Genen führen. Dies ist vermutlich auf die Verbindung zwischen den Photorezeptoren und RPE.
   Für die Dissoziation, werden ganze adulten Maus Netzhaut bei 37 ° C für 10 min in einem 1,5 ml-Röhrchen, enthaltend 20 inkubiertul aktivierten Papain, 20 ul 25 mM Cystein in 5 mM EDTA und 360 ul Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10 mM HEPES. Filter-bestückte Pipettenspitzen sind für alle Schritte im gesamten Protokoll, um mögliche Verunreinigungen zu minimieren verwendet. Das Papain-Konzentration und die Zeit der Inkubation wird entsprechend dem Alter und der Art des Gewebes variieren. Zum Beispiel zu distanzieren Entwicklung Netzhaut am postnatalen Tag 0 (P0) isoliert, bebrüten die Netzhaut in 10 ul aktiviertem Papain, 10 ul 25 mM Cystein in 5 mM EDTA und 380 ul Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10 mM HEPES 10 min bei 37 ° C Netzhaut aus verschiedenen Spezies erfordern auch leicht veränderten Bedingungen. Huhn Netzhaut sind dünner als Maus Netzhaut bei den meisten Stadien der Entwicklung. Unter Verwendung von 10 ul aktivierten Papain, 10 ul 25 mM Cystein in 5 mM EDTA und 380 ul Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10 mM HEPES, 5 min bei 37 ° C ergänzt ausreichend ist, um t distanziereniese Netzhaut.
2. Klopfen Sie leicht an das Rohr, um alle Zellen besiedelt zu vertreiben, dann sanft verreiben 10-20 mal mit einer Pipette P1000. Inkubieren Sie für weitere 10 min bei 37 ° C, wenn große Klumpen von Gewebe-und dann wieder anhalten verreiben 10-20 mal.
3. 5 l der DNase I (10 U / ul) und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. Man reibt vorsichtig mit einem P1000-Pipette. Die genaue Anzahl von Malen muss empirisch bestimmt werden, aber im Allgemeinen zwischen 10-20.
4. Zentrifuge in einer Tischzentrifuge bei 3000 rpm für 3 min den Überstand, so dass 100 bis 200 mu l Flüssigkeit am Boden, und tippen Sie auf das Rohr, um das Pellet zu lösen. 1 ml HBSS und das Pellet mit sanften Verreibung. Antippen des Röhrchens ist entscheidend, wie hier einfach Resuspendieren des Pellets mit lysieren viele der Netzhautzellen. Dies gilt vor allem mit erwachsenen Mäuse-Netzhaut.
5. Zentrifuge bei 3000 rpm für 3 min Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren in 450 ul PBS enthaltenIng. 0,1% BSA. Es ist wichtig, so viele der Überstand wie möglich zu entfernen, um die Anwesenheit von mRNAs aus lysierten Zellen und alle Produkte von der Dissoziation, die zukünftige Reaktionen hemmen könnte zu minimieren.

2. Ernte Einzelzellen

1. Planen zwei 6-cm-Schalen mit 5 ml PBS mit 0,1% BSA ergänzt. Plate Die dissoziierten Zellen auf einem Teller und lassen die Zellen für mindestens 5 min absetzen. Die Zelldichte verwendet wird, hängt stark von der Art der einzelnen Zellen, deren Profil. Zum Beispiel, für sehr seltenen Zellen mit einem fluoreszierenden Marker, wie ein GFP markiert werden ganze dissoziiert Netzhaut auf einem 6 cm Schale ausplattiert. Für Zellen, die etwas reichlich vorhanden sind, benötigt man weniger Zellen zunächst ausplattiert, um es einfacher, eine (oder sehr nahe an eine) Zelle mit der ersten Mikropipette ernten.
2. Die Platte von dissoziierten Zellen auf einem inversen Mikroskop. Wir verwenden die IMT-2-Modell von Olympus. Mit Mikropipetten, die zu einer fi wurden gezogenne Spitze (Innendurchmesser 0,5 mm, Außendurchmesser 1,04 mm) (Abbildung 2) und zusammen mit einem Ansaugrohr, ernten Sie eine einzelne Zelle. Die Zellen leicht in die Mikropipette, wenn es nah an ihnen ist auf der Schale gelegt. Es ist entscheidend, dass das Ansaugrohr weder zu lang noch zu kurz für den Abstand auf die Bühne mit dem inversen Mikroskop (Die Aspirator Röhren verwenden wir mit unseren inverse Mikroskop sind 38,1 cm lang) verbunden ist. Wenn das Rohr zu lang ist, können Zellen nicht effizient aus der Mikropipette vertrieben werden in das Sammelröhrchen. Der primäre Grund verwenden wir die älteren IMT-2-Modell inverse Mikroskop ist, dass wir gefunden haben, hat es den idealen Abstand zur Bühne für unsere Ansaugbaugruppe Röhren. Nach Eingabe der Mikropipette, wird die Zelle (oder Zellen) auf einer zweiten Platte (Waschplatte) ausgestoßen, um sicherzustellen, dass eine und nur eine Zelle für Genexpressionsanalysen geerntet wird. Auf der zweiten Platte ist es oft notwendig, entweder zu entfernen Fremdzellen mit einem neuen Mikropipetteoder bewegen Sie die Zelle von Interesse an einen anderen Ort, um sicherzustellen, dass nur eine einzige Zelle der Mikropipette betritt.
3. Wenn eine einzelne Zelle ist komplett aus den benachbarten Zellen isoliert, verwenden Sie eine neue Mikropipette, um die Zelle von Interesse wie in Abschnitt 2.2 ansaugen und dann vertreiben sie direkt in ein 0,2 ml PCR-Röhrchen mit 4,5 ul Zell-Lyse-Puffer. Die Zelle wird auf die Seite der Röhre ausgestoßen, ohne sie zu brechen Sie die Spitze der Mikropipette in die Röhre. Die Proben lassen sich kurz in einem Tisch-Mikrozentrifuge, um die Zelle in Lysepuffer tauchen gesponnen werden. Diese Spinnerei ist in der Regel nach jedem fünften Zelle und dann wieder am Ende des collection.Tubes enthalten einzelne Zellen in Lysepuffer sollte auf Eis für die Dauer der Einzelzellisolierung gehalten werden getan. Für optimale Ergebnisse ist, werden einzelne Zellen innerhalb einer Zwei-Stunden-Fenster nach der Dissoziation gesammelt. Nach Ablauf dieser Zeit, ist es am besten an die reverse Transkription Schritt fort, da zusätzliche Zeit wurde beobachtbareed, um die Chancen erhöhen, RNA-Abbau.

3. Reverse Transkription

1. Kurz drehen die Proben in einer Tischzentrifuge Minizentrifuge, um sicherzustellen, all die einzelnen Zellen in der Zell-Lyse-Puffer eingetaucht sind. Zur Zell-Lyse zu fördern, inkubieren Sie die Probe bei 70 ° C für 90 Sekunden. in einem Thermocycler. Anschließend wird der Schlauch zurück auf dem Eis.
2. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 2 min. Für alle Reagenzzugaben, verwenden Filter-Spitze Pipettenspitzen, um eine Kontamination zu verhindern. Um die reverse Transkription durchzuführen, fügen 0,33 ul Superscript III (200 U / ul), 0,05 ul RNase Inhibitor (40 U / ul) und 0,07 ul T4-Gen 32-Protein. Inkubieren des Reaktionsgemisches für 50 min bei 50 ° C in einem Thermocycler. Inaktivierung der Enzyme bei 70 ° C für 15 min und auf Eis.
3. Um den freien Primer zu entfernen, fügen 0,1 ul Exonuklease Buffer (10x), 0,8 ul dH ₂ 0 (Molekularbiologie) und 0,1 ul Exonuclease I (20 U / ul). Bei 37 ° C für 30 min inein Thermocycler. Inaktivierung der Enzyme durch Inkubieren der Reaktion bei 80 ° C für 25 Minuten und dann Anordnen der Gefäße auf Eis.

4. Tailing und Einzelzell-PCR

1. In 6 ul des Tailing Reaktionsgemisch und mit einem Thermocycler, um die Probe bei 37 ° C inkubieren für 20 min, 70 ° C für 10 min, Halten bei 4 ° C
2. In 10 ul der tailed Probe auf die PCR-Reaktionsmischung und führen Sie den zweiten Strang Synthese und PCR-Amplifikation mit den folgenden Bedingungen:
   1. 95 ° C für 2 min
   2. 37 ° C für 5 min
   3. 72 ° C für 16 min
   4. 93 ° C für 40 Sek.
   5. 67 ° C für 1 min
   6. 72 ° C für 6 min, Zugabe von 6 sec pro Zyklus
   7. Gehen Sie zu Schritt 4 34-mal
   8. 72 ° C für 10 min
   9. Halten bei 4 ° C

5. Kennzeichnung für Affymetrix-Chips

1. Etikett 10-20 ug cDNA (die Konzentration des amplifizierten cDNA-SuchergebnisIng. aus einer einzigen Zelle ist in der Regel ~ 1 ug / ul), eine robuste Hybridisierung auf Affymetrix-Microarrays zu erhalten. Erstens, die cDNA-Fragment durch Zugabe von 10-20 ul der Single-Cell-cDNA zu 8 ul 1X One-Pho-All-Puffer und 1 ul der verdünnten (1:10 in 1X One-Phor-All-Puffer) DNaseI in einem 80 ul Reaktion. Inkubieren in einem Thermocycler für 13 min bei 37 ° C Inaktivierung der DNase I für 15 min bei 100 ° C und auf Eis stellen.
2. Je 20 ul 5X TdT-Puffer, 2,5 ul Biotin N6-ddATP (Enzo Biosciences), und 1 ul TdT (1:8 verdünnt in TdT-Puffer).
3. Inkubieren für 90 min bei 37 ° C, dann 5 min bei 65 ° C Lagerung bei -20 ° C oder hybridisieren sofort zu einem Affymetrix Microarray. Die Hybridisierung wird unter Verwendung von Standard-Protokollen Affymetrix.

6. Repräsentative Ergebnisse

Um die Qualität der cDNA, 10 ul der cDNA-Probe zu beurteilen wurde auf einem 1% Agarosegel geladen. Die cDNA wird hauptsächlich durch die Größenbereich beurteilt (500-2000 bp)und Intensität der cDNA-Abstrich (Abbildung 1 und Abbildung 3a). In dem Gel in Abbildung 1 dargestellt, zeigt jedes zweite Fahrspur ein cDNA-Abstrich von Zellen der Netzhaut isoliert E16.5. Die Gassen dazwischen zeigen die daraus resultierenden Abstriche, wenn nur Medien in die Nadel gesaugt wird und hinterlegt in das PCR-Röhrchen. Diese Gassen sind nie völlig frei von einem schwachen Abstrich, aber sie zeigen keine Ergebnisse, wenn Gen-spezifischen PCR-Primer verwendet werden, um Gene von ihnen zu verstärken. Darüber hinaus kann die Intensität der cDNA-Abstrich etwas variieren (vgl. Abbildung 1 und Abbildung 3a). In 3a Spuren a enthalten f, g und h robuste cDNA Abstriche während die Bahnen b, c, d und e sind wesentlich weniger robust.

Gen-spezifische PCR als einem sekundären Screening der Qualität der cDNA aus einer einzigen Zelle verwendet. Die cDNAs in Abbildung 3 wurden von fluoreszierenden retinalen Ganglienzellen isoliert und sie waren tested mittels PCR-Primer für den retinalen Ganglienzellen Marker Brn3b und Pax6. Für diesen Test wurde 1 ul der cDNA mit PCR für 30 Zyklen unterzogen. Quantitative Echtzeit-PCR-Assay würde eine bevorzugte, aber es kann teuer und ist nicht erforderlich, nur die Beurteilung der Qualität cDNA. Alle 8 der einzelnen Zellen getestet Brn3b und 6 positiv aus 8 für Pax6 (Abbildung 3b). Selbst die cDNA Abstriche, die weniger robust waren produzierten Bänder für Brn3b und Pax6. Trotz dieser PCR-Ergebnisse, ist es unsere Erfahrung, dass cDNA Abstriche, wie sie in den Spuren b, c, d und e ergeben keine robuste Hybridisierungen auf Affymetrix-Arrays und werden in der Regel vermieden. Gen-spezifische PCR-Markierung für den Photorezeptor Crx wurde verwendet, um den Grad der Verschmutzung in den einzelnen Zelle cDNAs (3b) zu bestimmen. Photorezeptor Marker wurde gewählt, da diese Zellen die die Mehrheit der Netzhaut (~ 70%) und daher würde eine Zell-Lyse, die aufgetreten sind wahrscheinlich beinhalten Stange PhotorezeptorenRezeptoren. Es gab nur eine schwache Menge Crx in dieser cDNA-Zubereitungen auch nach 30 Zyklen der PCR. Schließlich kann das PCR-basierter Bildschirm verwendet werden, um, um festzustellen, welche Untergruppen von einem bestimmten Zelltyp die cDNAs aus, bevor sie einer vollen Mikroarray Profilierung abgeleitet werden. Dies kann helfen, die Zellen, die profiliert sind, da dies der teuerste Schritt in dem Prozess zu priorisieren. Zum Beispiel haben wir Teilmengen von retinalen Ganglienzellen durch Screenen auf die Anwesenheit des Gens Tachykinin1 (3b) identifiziert.

Von der kleinen PCR-basierten Bildschirm, sind insbesondere einzelne Zellen ausgewählt und deren cDNAs zu einem Affymetrix Microarray hybridisiert. Die Microarray-Daten verglichen wird und Muster können entdeckt unter Verwendung von Standard-Clustering-Algorithmen werden. Heatmaps, wie in 4, werden erzeugt, um grafisch die Daten. Es gibt zwei wichtige Rückschlüsse auf die einzelne Zelle Profiling-Daten in Abbildung4. Zuerst werden Gene in spezifischen Zelltypen exprimiert fast ausschließlich in den Zelltypen gefunden, nachdem die Zelle Protokoll durchgeführt wird. In den meisten Fällen, in denen Markergene eines Zelltyps auch in einem zweiten Zelltyp, wie die Beobachtung, dass einige bipolaren Zellen "Stab"-Gene exprimieren auf unteren Ebenen dieser Ausdruck in der zweiten Zelle Art, die leicht durch entweder in situ bestätigt gefunden Hybridisierung oder Antikörper-Färbung. Zweitens, in der vielfältigere Amacrin und Ganglienzellen Profilen, ist Heterogenität der Genexpression sofort ersichtlich. Pou4f1 nur in etwa 1/4 der Entwicklung Ganglion-Zellen exprimiert, während NR4A2 und Scube2 zwei Beispiele für heterogen exprimierte Gene in verschiedenen Amakrinzellen sind. In der Tat sind die Gene in der Heatmap zeigt nur eine kleine Auswahl als mehrere hundert Gene identifiziert wurden und als Marker für die Entwicklung Ganglienzellen oder als Marker für verschiedene Populationen von Amakrinzellen ^2,4 bestätigt.

Abbildung 1. Ablaufplan der einzelnen Zelle Profiling-Methode. Erste Netzhaut sind isoliert und dissoziiert in einzelne Zellen unter Verwendung von Papain. Zweitens werden die einzelnen Zellen mit einem Glas gezogen Nadel geerntet und hinterlegt in PCR-Röhrchen. Die Zellen werden lysiert und die cDNA amplifiziert unter Verwendung der reversen Transkription gefolgt von PCR. Die resultierende cDNA Qualität auf einem Agarose-Gel, wie die gezeigte bewertet. Nach der DNA-Leiter in der ersten Spur, zeigen die Spuren cDNA Abstriche von einzelnen Zellen (angedeutet durch die roten Klammern) im Wechsel mit Amplifikationsprodukte von Mediensteuerungen. Abstriche von dieser Qualität (rote Klammern) werden an Affymetrix Microarrays hybridisiert.

Abbildung 2. Bilder von den Nadeln und Ansaugrohr Anordnung. Einzelne Zellen isoliert werden unter Verwendung der Kapillarwirkung einesgezapftes Mikropipette (Innendurchmesser 0,5 mm, Außendurchmesser 1,04 mm) und durch den Druck der Blasen in die Saugvorrichtung übertragen. Es ist wichtig, dass die Ansaugrohr sowohl lang genug, um leicht zu manipulieren und kurz genug, um zuverlässig abgeleitet einzelnen Zellen. Eine Nahaufnahme der Kapillare in eine Nadel herausgezogen wird in B gezeigt

Abbildung 3. Repräsentative Beispiel für einzelne Zelle cDNA Abstriche und genspezifischen PCRs. Um die Qualität der einzelnen Zelle cDNA nach Amplifikation zu bestimmen, wurden 10 ul von jeder einzelnen Zelle Probe auf einem 1% Agarosegel mit einer negativen Kontrolle (A) ausgeführt. Ein Abstrich sollte zwischen 500-2000 bp erscheinen. Weitere PCR-Tests auf bestimmte Gene kann helfen, zu bestätigen / den Typ der Zelle isoliert wurde, und die Menge an Verunreinigung der Probe (B). Primern spezifisch für die retinalen Ganglienzellen Marker Brn3bPax6 und wurden getestet, um die Identität dieser Zellen (Zeilen 1 und 2) zu bestätigen. Um die Menge des Photorezeptors Verunreinigungen bei der Herstellung zu bewerten, wurden Primer, die spezifisch für den Photorezeptor Marker verwendet Crx (Zeile 3). Teilmengen von Ganglienzellen kann auch durch Screening auf Marker wie Tachykinin1 (Reihe 4) identifiziert werden.

Abbildung 4. Einzelzell-Expression von Markergenen. Die Mikroarray-Ergebnisse für ausgewählte Gene in 22 verschiedenen einzelnen Zellen exprimiert werden, in einer Heatmap Format angezeigt. Die Intensitäten der Signale Mikroarray skaliert worden sind, mit der Intensität der roten Farbe entsprechen. Schwarz bezeichnet die Abwesenheit eines Signals auf dem Mikroarray. Die retinalen Ganglienzellen (RGC) Vorstufen gezeigt sind, wurden aus embryonalen Zeitpunkten isoliert, während die anderen Zellen von ausgewachsenen Netzhaut isoliert wurden.

Discussion

Eine ständig wachsende Zahl von Studien belegen, robust Zell-zu-Zell-Variabilität in Populationen, die angeblich besser homogen hinsichtlich ihrer Genexpression ^6,8 wurden. In mindestens einem Fall wurde dieses Gen Expression "Rauschen" wurde gezeigt, dass ein biologischer spielen ^13. Die Genexpression Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen werden verdeckt auf traditionelle Ganzkörper-Gewebe-Methoden. In diesen Versuchen werden das Expressionsprofil von einem "durchschnittlichen" Zelle, die nicht repräsentativ sein kann ^14. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und Identifizierung der Genexpressionsmuster von einzelnen Zellen der Netzhaut. Die Untersuchung von einzelnen Zellen ermöglicht es den Forschern, die zellulären Heterogenität zugrunde liegenden komplexen Geweben, die kritisch für die Bestimmung unverwechselbaren Genexpressionsmuster von verschiedenen Zelltypen ist zu sondieren. Darüber hinaus können Single-Cell-Isolation Einblick in die Gen-Programme fahren die Aktivität der indiv. bietenidual Zellen in Zeitpunkten während der Entwicklung. Obwohl besonders nützlich bei der Untersuchung des Nervensystems, wo das Funktionieren der komplexen zellulären Netzwerken auf der einzigartigen Gen-Expression von seltenen Zelltypen abhängen kann, kann dieses Protokoll angepasst, um einzelne Zellen aus verschiedenen Geweben zu isolieren.

In den frühen entwickelnden Maus-Retina, sind Ganglienzellen, horizontalen Zellen, Kegel Sehzellen und Amakrinzellen alle in einem überlappenden Zeitfenster ¹⁵ erzeugt. Darüber hinaus ist jede Zelle, die den Zellzyklus verlassen hat in einer anderen Stufe der Reifung und diese Tatsache nur erhöht die Komplexität der Entwicklung von Netzhaut. Schließlich, für einige Arten von retinalen Neuronen, existieren zahlreiche verschiedene Morphologien (bis zu ~ 30 bei Amakrinzellen) in der reifen Retina ^16. Da die Netzhaut derart ist, ein Gemisch von Zelltypen, Mikroarray und serielle Analyse der Genexpression (SAGE) Studien ^17-19, die auf den Homogeni angeführtenation des gesamten Netzhaut sind nicht in der Lage Marker-Gene in seltenen Subtypen und nicht in der Lage, dynamische Genexpression Unterschiede zwischen Zelltypen zu lösen ausgedrückt aufzudecken, vor allem während der Entwicklung. Um zu beginnen, die Komplexität der verschiedenen Zelltypen sowohl in der proliferieren und während Entwicklung der Retina zu verstehen, haben die einzelnen Zelle Genexpressionsprofile von ~ 200 einzelne Zellen aus vielen verschiedenen Zeitpunkten wurde ^2-5,8 analysiert. Die resultierenden Daten wurde eine Vielzahl neuer Marker für die einzelnen Zelltypen zur Verfügung gestellt und stellte ein Fenster in wichtigen Übergängen in der Entwicklungs-Zeit, die bisher unbeachtet waren.

Die einzelnen Zelle Expressionsprofile haben beträchtliche Unterschiede in der Genexpression in Amakrinzellen ^4, wobei erwartet wurde, offenbart, und in Müller Gliazellen, wo es war unerwartet ^5. Während eine Untersuchung der einzelnen Amakrinzell Daten ergab mehr als 450 Gene, die in Amacrin ausgedrückt wurdenZellen und ausgeschlossen aus anderen retinalen Zelltypen wurden keines dieser Gene in allen Amakrinzellen ⁴ ausgedrückt. Diese Ergebnisse wahrscheinlich ergeben sich aus der Tatsache, dass die Amakrinzell Klasse äußerst vielfältig und die darunter liegende Heterogenität ist ein Spiegelbild der verschiedenen Funktionen dieser Zellen. Diese Erkenntnisse wären nicht möglich gewesen, mit ganzen Gewebe-basierte Ansätze. Schließlich erscheint Radfahren retinalen Vorläuferzellen (RPCs) den höchsten Grad an Heterogenität in der Genexpression eines der retinalen Zelltypen profilierten ^8. Transkriptionsfaktoren waren die Klasse von Genen, die mit dem höchsten Grad der Heterogenität bei den Vorläuferzellen, was darauf hindeutet, dass die dynamische Genexpressionsmuster könnte eine wichtige Rolle in der Entwicklung der verschiedenen retinalen Zelltypen ⁸ spielen. Wieder würden diese Ergebnisse nicht ohne die Verwendung der einzelnen Zelle Genexpressions-Technik möglich gewesen.

Einzel-Zell-Transkriptom-Studienkann auch genutzt werden, um Einblick in Krankheitsmechanismen zu gewinnen. Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich degenerativer Netzhauterkrankungen, sterben einige Neuronen, während die benachbarten Neuronen ²⁰ überleben. Das Verständnis, warum manche Zellen Apoptose erfordert die Identifikation von Genen oder Gen-Programme, die in einzelnen Zellen in diesen Modellen Krankheit verändert werden. Ganzkörper-Gewebe-Modelle werden wieder potenziell verdunkeln die Änderungen seit Zellen oft nicht zur gleichen Zeit sterben, und daher zu einem gegebenen Zeitpunkt das Gewebe ein Gemisch von sterbenden und überlebenden Zellen ist. Zusätzlich wird für viele Krebsarten die Zelle des Ursprungs ist eine offene Frage. Dies ist insbesondere der Fall bei der Kindheit Augentumor Retinoblastom. Kürzlich mit der einzelnen Zelle Profilierung Protokoll hier detailliert, wurde gezeigt, dass einzelne Zellen aus Retinoblastomen Genexpression von mehreren Zelltypen ^{21 weisen.} Es scheint, dass diese Zellen Hybriden von undifferenzierten Vorläuferzellen und Neuronen ² sind1. Diese Experimente benötigt eine Analyse auf der Ebene einzelner Zellen und wäre nicht mit ganzen Gewebe Ansätzen möglich gewesen.

Alternative Ansätze

Lineare Amplifikation ist eine Alternative zu dem PCR-basierten Amplifikationsprotokoll hier detailliert. Während die PCR-basierte Amplifikation wird angenommen, dass in einer Schiefstellung des Überflusses Beziehungen führen, wird eine lineare Verstärkung gedacht, um diese Beziehungen zu pflegen ^22. Die Technik der linearen Verstärkung verwendet wurde, um ein Profil mehreren neuronalen Typen ^23. Allerdings sind direkte Vergleiche zwischen den beiden Methoden zeigten, dass die lineare Verstärkung Technik mit einer hohen Rate falsch negativer ^24,25 zugeordnet werden kann. Wir bevorzugen die PCR-basierte Verfahren in diesem Bericht detailliert aus zwei Gründen. Zuerst in unseren Experimenten konzentrieren wir uns auf Gene, die mit robusten Ausdruck Unterschiede zwischen den Zellen. Zweitens haben wir eine sehr gute Korrelation zwischen unseren einzelnen Zelle Microarray-Profi gefundenEinreichung Experimenten und in situ-Hybridisierung für die gleichen Gene. In der Tat, bis heute haben wir in situ Hybridisierungen für Hunderte von Genen durchgeführt und haben beobachtet, mindestens 75% entsprechen den vorhergesagten Muster aus den Microarrays. Dies ist wahrscheinlich eine konservative Schätzung, da der häufigste Grund für eine Diskrepanz besteht ein Mangel an Signal von der in situ-Sonde.