単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

Summary

単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。

Abstract

細胞の高度に専門化が、非常に小さな集団が多くの組織で重要な役割を果たしている。非常にまれな細胞サブセットの細胞型特異的マーカーと遺伝子発現プログラムの識別は、標準的な全体の組織のアプローチを使用して挑戦されています。個々の細胞の遺伝子発現プロファイリングは、全組織^1-7のわずかな割合を構成する細胞の種類に前例のないアクセスを可能にします。さらに、この手法は、一時的に⁸の動的発達遷移中に細胞の小さな数字で表現される遺伝子発現のプログラムを調べるために使用することができます。

携帯電話の多様性のこの問題は、ニューロンの接続が非常に多様な細胞が⁹との間に発生する可能性があり、中枢神経系（CNS）で繰り返し発生します。異なる種類の細胞の正確な数は正確に知られていないですが、それは皮質私のように多くの1000などの異なるタイプが存在する可能性があることと推定されているtself ^10。複雑な神経回路の機能（s）はまれな神経細胞の種類とそれらが発現する遺伝子の一部に依存する場合があります。新しいマーカーを同定し、分子の異なるニューロンを分類するために助けることによって、単一セルのアプローチは、神経系の細胞型の解析に特に有用である。それはまた、神経前駆開発の初期段階で示差的に発現する遺伝子や遺伝子経路を識別することによって、神経発生のメカニズムを解明するのに役立つ可能性があります。

かなりの神経細胞の多様性を持つ単純な、簡単にアクセス組織として、脊椎動物の網膜は、細胞の開発、神経分化と神経多様化のプロセスを研究するための優れたモデルシステムです。しかし、中枢神経系の他の部分のように、この細胞の多様性は、特に桿体は、MAを作ることを考えると、特定の細胞の運命を採用する網膜前駆細胞を駆動する遺伝的経路を決定するための問題を提示することができ合計網膜細胞集団¹¹のjority。ここでは、単一網膜細胞（ 図1）で表される転写産物を同定するための方法を報告します。単一細胞のプロファイリング技術は、網膜^2,4,5,12の異なる細胞集団内の異質性の存在量の評価が可能になります。さらに、このメソッドは、細胞の運命は、網膜前駆細胞のサブセット⁸で発生するプロセスを意思決定の役割（複数可）を果たす可能性がある新たな候補遺伝子の宿主を明らかにした。プロトコルにはいくつかの簡単な調整で、このテクニックは、多くの異なる組織および細胞型に利用することができる。

Protocol

1。細胞解離

1. 示されているプロトコルをまとめたフローチャートは、 図1である。このプロトコルを通して使用される特定の試薬 ​​のカタログ番号については、 表1を参照してください。 PBS浴中の網膜を分析。解剖中には、網膜が解離を阻害することができ、それらを維持するので、硝子体、レンズを取り外すことをお勧めします。網膜色素上皮（RPE）のすべてを削除するには、いくつかのインスタンスでは、それが完全にそれを削除することは不可能かもしれませんが常に非常に重要なことではありません。しかし、視細胞の単一細胞のプロファイリング実験のために、RPEを削除する必要があります。 RPEを削除に失敗すると、RPEに発現遺伝子を持つロッドセル·プロファイルの汚染につながる可能性があります。これは、おそらく感光体とRPEとの間の接続によるものです。
   解離については、全体の大人のマウスの網膜は、20を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに10分間37℃でインキュベートするμlの活性化パパイン、5mMのEDTAの20μlの25mMのシステイン、および10mM HEPESを添加した360μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）。フィルター付きピペットチップは、潜在的な汚染を最小限に抑えるためのプロトコル全体のすべての手順を実行するために使用されます。パパイン濃度とインキュベーション時間は、年齢や組織の性質に応じて異なります。たとえば、生後0日（P0）で分離された網膜を開発して解離し、10μlの活性パパイン、5mMのEDTAの10μlの25mMのシステイン、および10mM HEPESを添加した380μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）で網膜をインキュベート37℃で10分間異なる種からの網膜もわずかに異なる条件が必要になります。鶏の網膜は、開発のほとんどの段階で、マウスの網膜よりも薄いです。 10μlの活性化パパイン、5mMのEDTAの10μlの25mMのシステイン、および37℃で5分間、10mMのHEPESを添加した380μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）°Cを使用すると、tを解離するのに十分であるhese網膜。
2. 穏やかに、任意の和解の細胞を取り除くために、チューブをタップして、P1000ピペットで軽く10〜20倍粉薬。 37℃でさらに10分間インキュベート°C組織の大きな塊が10〜20倍を保持して再粉薬の場合。
3. DNアーゼI（10 U /μl）を5μlを加え、室温で5分間インキュベートする。 P1000ピペットで軽くひいて粉にする。回数の正確な数は経験的に決定する必要がありますが、一般的に10から20の間にあるでしょう。
4. 3分間3000rpmでテーブルトップ遠心機で遠心分離し下部に液体の100〜200μlの溶液を残し、上清を取り除き、ペレットを取り除くために、チューブをタップします。 HBSS 1 mLを加え、穏やかな粉砕でペレットを再懸濁します。チューブをタップすると、単に網膜の細胞の多くを溶解してペレットを再懸濁し、ここが重要です。これが大人のマウスの網膜に特に当てはまります。
5. 3分間3000rpmで遠心分離し、慎重に含むPBS 450μlの上清と再懸濁しを削除するる0.1％BSA。それは、将来の反応を阻害することができた解離から溶解した細胞とされた製品からのmRNAの存在を最小限に抑えるためにできるだけ多くの上清を除去することが重要です。

2。単一細胞を収穫

1. 0.1％BSAを添加した5mlのPBSを含む2つの6 cmの皿を準備します。皿一皿の上に解離細胞と細胞が少なくとも5分のために解決することができます。使用される細胞密度は、プロファイルされ、単一の細胞の性質に大きく依存します。例えば、蛍光マーカーのようなGFPで標識された非常に希少な細胞のために、全体の解離網膜は、単一の6cmのディッシュ上に播種されています。やや豊富に存在する細胞については、より少ない細胞が最初にそれが簡単に第一マイクロピペットで1（または1に非常に近い）は、細胞を収穫できるようにメッキされています。
2. 倒立顕微鏡上に解離された細胞のプレートを置きます。我々は、オリンパスからIMT-2モデルを使用しています。 fiに描かれているマイクロピペットを用いてNEの先端（内径0.5ミリメートル、外径1.04ミリメートル）（ 図2）と一緒に吸引管とは、単一のセルを収穫。細胞は容易にそれが皿の上に近くに配置されているマイクロピペットを入力してください。それは吸引チューブが長すぎたり、倒立顕微鏡（私たちは倒立顕微鏡で使用する吸引チューブは38.1 cmの長さです）に関連付けられているステージまでの距離が短すぎるものでもないことが重要です。チューブが長すぎる場合、細胞をコレクションチューブにマイクロピペットから効率的に追放することはできません。我々は古いIMT-2モデル倒立顕微鏡を使用して主な理由は、我々はそれが私たちの吸引器アセンブリ管のステージに理想的な距離を持って発見したことである。マイクロピペットを入力した後、セル（またはセル）がただ一つの細胞が遺伝子発現プロファイリングのために採取されていることを確認する2番目の板（洗濯板）に追放されています。第二の板の上には、新しいマイクロピペットで余分な細胞を除去することがしばしば必要です。または、単一のセルはマイクロピペットに入ることを確認するために別の場所に興味のあるセルを移動します。
3. 個々の細胞が完全に隣接する細胞から単離されたとき、2.2節のように、目的の細胞を吸引するための新しいマイクロピペットを使用し、4.5μlのCell Lysis緩衝液を含む0.2ミリリットルのPCRチューブに直接排出します。セルは、チューブにマイクロピペットの先端を断つないように注意しながら、チューブの側に排出されます。サンプルは溶解バッファーで細胞を浸すためにベンチトップ遠心で簡単にスピンすることができます。この回転は、通常、単一細胞の分離の期間中に氷上で保存すべきである5回ごとにセルの後、再度溶解緩衝液中の単一細胞を含むcollection.Tubesの終わりに行われます。最適な結果を得るためには、単一の細胞は2時間のウィンドウをポスト解離内で収集されます。この時間が経過した後に追加の時間がobservされているので、それは逆転写のステップに進むために最適ですRNAの分解の可能性を高めるためにED。

3。逆転写

1. 簡単にすべての単一の細胞は、細胞溶解緩衝液に浸漬されるようにベンチminicentrifugeでサンプルをスピン。細胞溶解を促進するために、90秒、70℃でサンプルをインキュベートする。サーモインチすぐに戻って氷の上にチューブを配置します。
2. 2分間氷上でチューブを残します。すべての試薬の追加については、汚染を防止するフィルタチップピペットチップを使用しています。逆転写を行うために、0.33μlを上付き文字III（200 U /μl）を、0.05μlのRNaseインヒビター（40 U /μl）を0.07μlのT4遺伝子32タンパク質を追加します。 50℃50分℃でサーモに反応混合物をインキュベートします。氷上で15分、場所を70°C、酵素を不活性化する。
3. 無料のプライマーを除去するために、0.1μlのエキソヌクレアーゼバッファー（10X）、0.8μlののdH ₂ 0（分子生物学グレード）、0.1μlのエキソヌクレアーゼを追加するI（20 U /μl）を。で30分間37℃でインキュベートサーモ。 25分間80°Cで反応をインキュベートし、氷上でチューブを配置することによって酵素を不活性化する。

4。テーリングとシングルセルPCR

1. テーリング反応混合物の6μlを加え、10分間、20分間、70℃、37℃でサンプルをインキュベートするためにサーモを使用して、4℃で保持°C
2. PCR反応混合物につかれた試料の10μlを追加し、次の条件を使用して第二鎖の合成とPCR増幅を行います。
   1. 2分間95°C
   2. 5分間37°C
   3. 16分72°C
   4. 40秒で93°C
   5. 1分間67°C
   6. サイクルあたり6秒を追加し6分間72℃、
   7. 4 34回に進みます
   8. 10分間72℃
   9. 4℃で保持°C

5。アフィメトリクスチップのラベリング

1. cDNAのラベル10から20μgの（増幅したcDNAの結果の濃度単一のセルからるは、通常、Affymetrix社のマイクロアレイ上で堅牢なハイブリダイゼーションを取得する）は1μg/μlを〜です。最初に、断片液80に8μlの1XワンPhor - すべてのバッファおよび希釈液1μl（1Xで1:10ワンPhor - すべてのバッファ）DNaseIにより、単一細胞cDNAの10から20μlを加えることによってcDNAを反応。 37℃で13分間サーマルサイクラーでインキュベート℃の100°Cと氷の上の場所で15分間のDNase Iを失活さ。
2. 20μlの5倍のTDTのバッファー、2.5μlのビオチンN6-ddATP（エンツォバイオサイエンス）、1μLTdTとの（TDTバッファーで1:8に希釈）を追加します。
3. 65℃、5分間℃、37℃で90分間インキュベート-20℃で保存またはアフィメトリクスマイクロアレイにすぐにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、標準Affymetrix社のプロトコルを使用して実行されます。

6。代表的な結果

評価するために、cDNAサンプルのcDNAを、10μlの品質は、1％アガロースゲル上にロードされています。 cDNAは、主にサイズの範囲（500から2000塩基対）によって判断されるcDNAのスメアのと強度（ 図1および図3a）。図1に示したゲルでは、他のすべてのレーンはE16.5を単離した網膜細胞からのcDNAスメアを示しています。の間のレーンは針に吸引し、PCRチューブに堆積され、メディアのみ生じるスミアが表示されます。これらのレーンは、かすかな汚れを完全に欠いていることは決してありませんが、遺伝子特異的PCRプライマーは、それらの遺伝子を増幅するために使用されている場合、彼らはすべての結果が表示されません。さらに、cDNAのスメアの強度は、（ 図1および図3aを比較）多少異なる場合があります。レーンA、B、C、D、Eはかなり少ない堅牢ている間、図3aのレーンでは、f、g、およびhは、堅牢なcDNAのスメアが含まれています。

遺伝子特異的PCRを用いて、単一細胞からのcDNAの質の二次スクリーニングとして使用されます。 図3のcDNAを蛍光網膜神経節細胞から単離し、それらはtesteあったdは、網膜神経節細胞マーカーBrn3bとPax6のためのPCRプライマーを使用します。このアッセイでは、cDNAを1μlのは30サイクルのPCRを行った。リアルタイム定量PCRアッセイが望ましいであろうが、それは法外に高価であると単にcDNAの品質を評価する必要はありませんができます。単一細胞の全8 Pax6の（ 図3b）のうち8 Brn3bと6の陽性反応を示した。 Brn3bとPax6のために以下の堅牢な生産バンドであったとしてもcDNAのスメア。これらのPCRの結果にもかかわらず、そのようなレーンA、B、C、D、およびEにあるようなcDNAのスメアは、Affymetrix社のアレイ上で堅牢なハイブリダイゼーションを生むとは限らないと一般的に回避されるという我々の経験である。光受容体マーカーCRXのための遺伝子特異的PCRは、単一細胞cDNAを（ 図3b）の汚染レベルを決定するために使用されていました。これらの細胞は網膜の大半（約70％）を構成し、したがって、発生した細胞溶解が最も可能性の高いロッドフォトレジストを含んでしまうため、感光体マーカーが選ばれましたceptors。 CRX存在のかすかな量があっても、PCRの30サイクル後、これらのcDNAの調製のみであった。最後に、このPCRベースの画面がcDNAは完全なマイクロアレイプロファイリングにそれらを施す前から派生した特定の細胞型のどのサブセットを決定するために開始するために使用することができます。これは、このプロセスの中で最も高価なステップであるように、プロファイルされたセルの優先順位付けに役立てることができます。たとえば、我々は遺伝子Tachykinin1（ 図3b）の存在のためにそれらをスクリーニングすることによって、網膜神経節細胞のサブセットを同定した。

小型のPCRベースの画面から、特定の単一のセルが選択され、そのcDNAは、Affymetrix社のマイクロアレイにハイブリダイズした。マイクロアレイデータが比較され、パターンは、標準的なクラスタリングアルゴリズムを使用して発見することができます。このような図4のようにヒートマップは、データをグラフィカルに表現するために生成されます。 図中の単一細胞のプロファイリングデータに関する2つの主要な結論があります4。単一細胞のプロトコルが実行された後、最初に特定の細胞型で発現される遺伝子は、これらの細胞型でほとんど独占的に発見された。 1つの細胞型のマーカー遺伝子は双極細胞は第二の細胞型で、この式は容易にその場でいずれかの方法で確認され、低いレベルでいくつかの"ロッド"の遺伝子を発現するような観察 ​​第二の細胞型でも発見されたほとんどのインスタンスでハイブリダイゼーションまたは抗体染色。第二に、より多様なアマクリンおよび神経節細胞プロファイル内で、遺伝子発現の不均一性は直ちに明らかである。 Nr4a2とScube2が異なるアマクリン細胞で均一に発現される遺伝子の2つの例である一方Pou4f1にのみ、開発神経節細胞の約1/4で表されます。数百の遺伝子が開発神経節細胞のマーカーとして、あるいは^{2,4 -}アマクリン細胞の異なる集団のマーカーとして同定され、確認されているとして、実際には、ヒートマップに示される遺伝子は、小さなサンプルです。

図1。単一細胞のプロファイリング方法のフローチャート。まず網膜を単離し、パパインを使用して、個々の細胞に解離する。第二に、単一の細胞が引っ張らガラス針で採取し、PCRチューブに堆積される。細胞を溶解し、cDNAをPCRに続いて逆転写を用いて増幅されています。得られたcDNAの品質は、当該示すようなアガロースゲル上で評価される。最初のレーンでDNAラダーの後、レーンには、メディアコントロールからの増幅産物と交互に（赤い括弧で示される）単一細胞からcDNAスメアを示しています。この品質の塗抹標本（赤括弧）はAffymetrix社のマイクロアレイにハイブリダイズされています。

図2。針や吸引チューブアセンブリの写真。単一細胞の毛細管現象を用いて分離されているガラスマイクロピペットを（内径0.5ミリメートル、外径1.04ミリメートル）引っ張られ、アスピレーターに吹くの圧力によって転送されます。それは吸引チューブが簡単に操作することは十分に長いと確実に個々のセルを放電するのに十分短いの両方であることが重要である。針に引き込ま毛細管のクローズアップビューがBに示されている

図3。単一細胞cDNAスメアと遺伝子特異的PCRの代表的な例を示します。増幅後のcDNAを単セルの品質を決定するためには、各単セルのサンプル10μlのネガティブコントロール（）と一緒に1％アガロースゲル上で実行されました。塗抹標本では、500から2000塩基対の間に表示されます。特定の遺伝子の追加のPCRベースのスクリーニングは、単離された細胞の種類とサンプル（B）に存在する汚染の量を識別する/確認することができます。網膜神経節細胞に特異的なプライマーは、Brn3bマーカーとPax6のは、これらの細胞（行1および2）の身元を確認するためにテストされました。準備中、感光体汚染の量を評価するために、感光体マーカーCRXに特異的なプライマーは、（行3）を使用した。神経節細胞のサブセットはまた、Tachykinin1（行4）などのマーカーのスクリーニングによって同定することができる。

図4。マーカー遺伝子の単セルの式22の異なる単一細胞で発現し、選択した遺伝子のマイクロアレイ結果をヒートマップ形式で表示されます。マイクロアレイ信号から強度が赤色の強度に対応するようにスケーリングされています。黒は、マイクロアレイ上の信号の有無を示しています。他の細胞は成人の網膜から単離した間に示すように網膜神経節細胞（RGC）の前駆体は、胚の時点から単離した。

Discussion

研究の拡大を続ける数は、その遺伝子発現^6,8に関してより均一であると考えられていた集団での強固な細胞間の変動を明らかにしています。少なくとも一つのインスタンスで、この遺伝子発現の"ノイズ"が重要な生物学的機能^13を果たすことが示されている。個々の細胞間の遺伝子発現の違いは、伝統的な全体の組織の方法を使用して隠されている。これらの実験は、代表的な¹⁴ないかもしれない"平均的な"細胞の発現プロファイルを生成します。ここでは、単一網膜細胞からの遺伝子発現パターンの単離および同定するための手法を提案する。個々の細胞の研究は、研究者が種々の細胞型の特徴的な遺伝子発現パターンを決定するために重要である複雑な組織の根底にある細胞の不均質性を調べることができます。さらに、シングルセル分離は、枚ずつの活動を駆動する遺伝子プログラムの洞察を提供することができます開発全体の時点でidual細胞。複雑な細胞ネットワークの機能は珍しい種類の細胞のユニークな遺伝子発現に依存することができる神経系を研究する上で特に有用ですが、このプロトコルは、様々な組織から個々の細胞を単離するために適応させることができます。

早期に発展したマウス網膜では、神経節細胞、水平細胞、錐体視細胞とアマクリン細胞はすべての時間¹⁵のオーバーラップウィンドウに生成されます。さらに、細胞周期を終了した各セルは成熟の異なる段階にあり、この事実は、唯一の開発網膜の複雑さに追加されます。最後に、網膜神経細胞の種類によっては、成熟した網膜¹⁶の多数の異なる形態（最大〜30までアマクリン細胞の場合）が存在する。網膜はhomogenizに頼って細胞の種類、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続分析（SAGE）ベースの研究^17-19このような混合物であるので、全体の網膜の評価作業を容易に、特に開発時には、細胞型の間のダイナミックな遺伝子発現の相違を解決することができない稀な亜型で発現させ、マーカー遺伝子を明らかにすることはできません。成人の網膜と網膜の開発時に両方の異なる細胞型の複雑さを理解するために開始するには、多くの異なった時点から約200個々の細胞の単一細胞の遺伝子発現プロファイルは^2-5,8を分析しています。得られたデータは、個々の細胞型の新しいマーカーのホストを提供し、以前に正しく評価した開発時に重要なトランジションにウィンドウを提供しています。

単一細胞の発現プロファイルは、それが期待されていたアマクリン細胞^4、で、それが⁵予想外だったミュラーグリア細胞で遺伝子発現のかなりの異質性を明らかにした。単一のアマクリン細胞のデータの検査はアマクリンで発現させた450以上の遺伝子を明らかにしながら、細胞および他の網膜細胞の種類から除外し、これらの遺伝子のどれもがすべてのアマクリン細胞⁴に発現させた。これらの結果は、ほとんどのアマクリン細胞クラスは非常に多様であり、基礎となる不均一性は、これらの細胞の異なる機能の反映であるという事実から生じる。これらの知見は、全体の組織ベースのアプローチを使用して不可能だったでしょう。最後に、サイクリング網膜前駆細胞（RPC）の⁸プロファイル網膜細胞の種類のいずれかの遺伝子発現の不均一性の高い学位を取得し表示されます。転写因子は、動的な遺伝子発現パターンが異なる網膜細胞のタイプ⁸の開発で主要な役割を果たすことができることを示唆し、前駆細胞間の異質性度の高い遺伝子のクラスでした。再び、これらの結果は、単一細胞の遺伝子発現プロファイリング技術を使用せずに不可能だったでしょう。

単一細胞トランスクリプトーム研究また、病気のメカニズムへの洞察を得るために利用することができます。隣接するニューロンが^20を存続しながら網膜変性疾患を含む多くの神経変性疾患では、いくつかのニューロンが死ぬ。いくつかの細胞がアポトーシスを受ける理由を理解すると、これらの疾患モデル内の個々の細胞内で変更される遺伝子または遺伝子プログラムの識別を必要とします。全体の組織モデルは、再び潜在的に細胞から頻繁に変更される任意の時点で組織は細胞を死に、生き残ったの混合物であるため、同時に死ぬとはありませんが不明瞭になります。さらに、多くのがんの起源の細胞が開いている質問です。これは、特に小児眼腫瘍網膜芽細胞腫の場合と同様です。最近ここで詳述単一細胞のプロファイリング·プロトコルを使用して、それが網膜芽から個々の細胞が複数の細胞型²¹の遺伝子発現プログラムを持つことが示された。それはこれらの細胞は未分化な前駆細胞およびニューロン²のハイブリッドであることが表示されます。1。これらの実験は、単一細胞レベルでの分析を必要とし、全体の組織のアプローチでは不可能でした。

代替的なアプローチ

線形増幅は、ここでは詳述しPCRベースの増幅プロトコルに代わるものです。 PCRベースの増幅が豊富関係の偏りに起因すると考えられている一方で、線形増幅が、これらの関係^22を維持するために考えられています。線形増幅の技術は^、23いくつかの神経細胞の種類をプロファイルするために使用されています。しかし、2つの方法の間の直接比較は線形増幅技術は高い偽陰性率^24,25に関連付けることができることが示されている。我々は2つ​​の理由から、この報告書で詳述PCRベースの方法を好む。まず、我々の実験で我々は、細胞間の強固な表現の違いが遺伝子に焦点を当てています。第二に、我々は単一細胞マイクロアレイプロの間で非常に良好な相関関係を発見した実験を提出して、同じ遺伝子のin situハイブリダイゼーションの研究で。実際には、これまでに我々は、遺伝子の何百ものインサイチュハイブリダイゼーションで行われており、少なくとも75％はマイクロアレイからの予測パターンと一致して観察した。不一致のもっとも一般的な理由は、 その場プローブでの信号の不足であるので、これはほとんどの控えめな見積もりである。