Summary
यहाँ हम एक स्वयं कोडांतरण 3 आयामी संस्कृति पाड़ मानव तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन. हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान scaffolds से कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए बाद में जैसे प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया. इस प्रोटोकॉल के अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है mechanistically विस्तृत अध्ययन करते हैं.
Protocol
1. भाग 1: PuraMatrix में hNPCs की संस्कृति
- बिना एक laminin 0.25% की एक PuraMatrix एकाग्रता के साथ एक पाड़ की पीढ़ी के लिए अग्रिम करने के लिए निम्न समाधानों को तैयार करने की जरूरत है
- एक 20% sucrose और एक 10% बाँझ आसुत जल में भंग sucrose समाधान युक्त युक्त समाधान तैयार है.
- समाधान 1 20% एक 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 120 μl आसुत जल के साथ sucrose के समाधान के मिश्रण 120 μl के लिए.
- समाधान एक 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 20% sucrose के समाधान के 60 μl के साथ PuraMatrix समाधान के 2 मिश्रण 60 μl के लिए.
0.25% laminin (प्रति 100 μl मैट्रिक्स 8 μg) एक की जरूरत के साथ पूरक करने के लिए निम्न समाधानों को तैयार PuraMatrix एकाग्रता के साथ एक पाड़ की तैयारी के लिए.
- समाधान 20% sucrose के समाधान के 120 μl और एक 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 48 μl laminin के साथ आसुत पानी के एक मिश्रण 72 μl के लिए.
- समाधान 2 मिश्रण 20% एक 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में sucrose के समाधान के 60 μl के साथ 60 μl PuraMatrix समाधान के लिए.
- PuraMatrix में कक्षों की embedment 4 अच्छी तरह से एक सेल संस्कृति की थाली तैयार करने और दो कुओं में एक निष्फल ग्लास कवर पर्ची (व्यास 13 मिमी) जगह. बाद में उपयोग के लिए स्वच्छ बेंच में थाली स्टोर. ग्लास कवर फिसल जाता है केवल immunocytochemical अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है. यदि कोई immunocytochemical stainings इरादा कर रहे हैं, कदम को छोड़ दिया जा सकता है.
3 डी scaffolds एक में encapsulation के लिए hNPCs तैयार करने के लिए निम्न समाधानों को तैयार है. समाधान / trypsin EDTA में Benzonase पतला, एक 1:10.000 के कमजोर पड़ने कारक का उपयोग. एक Trypsin-Inhibitor/Benzonase समाधान के मिश्रण के लिए: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + trypsin अवरोध करनेवाला (0.5mg/ml).
- एक इनक्यूबेटर में 5 मिनट (37 ° सी, 5% सीओ 2) के लिए 500 μl समाधान / trypsin Benzonase और सेते जोड़कर कोशिकाओं को अलग. Trypsin-Inhibitor/Benzonase समाधान के साथ प्रतिक्रिया बंद करो. इसके बाद 3000 x जी पर 5 मिनट के लिए अलग कोशिकाओं अपकेंद्रित्र 5 मिलीलीटर 10% Sucrose समाधान के साथ कोशिकाओं को धो और फिर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- 10% sucrose के समाधान में कोशिकाओं Resuspend, अंतिम कक्ष समाधान 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल शामिल करना चाहिए.
अगले कदम, 1.8 से 1.11 के लिए, संभव के रूप में में उपवास के रूप में किया जाना चाहिए PuraMatrix समाधान है, जो कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है है के कम पीएच की वजह से.
- एक समाधान के साथ सेल निलंबन के 60 μl मिक्स.
- 1 समाधान के 120 μl जोड़ें, कोशिकाओं से युक्त समाधान के साथ 2 शंक्वाकार ट्यूब, और ध्यान से मिश्रण.
- जगह मिश्रण के 100 प्रत्येक कवर पर तुरंत μl 4 अच्छी तरह से थाली में बसता निकल जाता है.
- धीरे धीरे 200 μl सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें प्रति अच्छी तरह से और 2-3 मिनट के बाद एक और 200 μl. इस मैट्रिक्स की आत्म विधानसभा आरंभ हो जाएगा.
- सेते ग37 पर ells डिग्री सेल्सियस, 1 के लिए एक गर्म थाली या अपनी साफ बेंच गरम क्षेत्र पर साफ बेंच में. जहाँ तक संभव हो प्लेट नहीं कदम के रूप में इस matrices के कोडांतरण नुकसान हो सकता है.
- मध्यम के सबसे निकालें, लेकिन सभी नहीं, matrices 1000 μl विंदुक के साथ सूखी गिरने से बचने के लिए. 10 मिनट के लिए matrices धोने माध्यम की 500 μl जोड़ें. अंत में मध्यम हटाने और 500 μl ताजा मध्यम जोड़ने और एक मशीन (37 °% 5 सी, सीओ 2) में संस्कृति की थाली जगह . के रूप में matrices के सदमे प्लेटें संभव के रूप में कम के रूप में स्थानांतरित किया जाना चाहिए और संग्रहीत एक अलग इनक्यूबेटर में, यदि संभव हो, संवेदनशील हैं.
- यहां इस्तेमाल किया hNPCs 7 दिनों के लिए 3 डी scaffolds में proliferated थे और भेदभाव विकास 13 कारकों की वापसी द्वारा शुरू किया गया था . मध्यम हर 2-3 दिन बदल गया था.
2. भाग 2: पूरे matrices के Immunocytochemical धुंधला हो जाना
- धुंधला हो जाना प्रक्रिया के लिए अग्रिम के लिए तैयार की जरूरत: अबलॉकिंग बफर 5% सामान्य बकरी सीरम और ट्राइटन X-100 (Pbs, एक 4% paraformaldehyde 0.1 एम PBS पर आधारित समाधान में भंग और अगर 4 के साथ एक समाधान ',6-Diamidin-2' phenylindoldihydrochlorid की जरूरत 0.3% से मिलकर समाधान DAPI एक नाभिक 100 एनजी DAPI / एमएल पीबीएस में भंग युक्त धुंधला के लिए). नमूने Mowiol और DABCO के एक मिश्रण के साथ घुड़सवार थे.
- धोने matrices 1000 μl विंदुक के साथ मध्यम हटाने और पीबीएस के साथ scaffolds के 5 मिनट के लिए एक बार धोने के लिए.
- ठीक scaffolds पीबीएस हटाने और एक अच्छी तरह से paraformaldehyde के 400 μl (0.1 एम पीबीएस में 4%) जोड़ सकते हैं और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए matrices सेते हैं. फिक्स्ड scaffolds पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है कई महीनों के लिए कई अप सप्ताह के लिए 0.02% 4 में 3 NaN ° C के साथ पूरक.
- पीबीएस के साथ धुंधला के अग्रिम में 5 मिनट के लिए scaffolds धोने.
- बफर समाधान अवरुद्ध में scaffolds सेते हैं. अवरुद्ध समाधान तीन बार हर 2-3 घंटे और subsequ बदल गया थाently scaffolds रात खत्म अवरुद्ध समाधान में incubated रहे थे 4 में डिग्री सेल्सियस
- अवरुद्ध बफर समाधान निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी पीबीएस में भंग 1% सामान्य बकरी सीरम के साथ पूरक जोड़ने और 4 पर matrices रात खत्म सेते सी. °
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और धोने रात से अधिक 2 घंटे के लिए 4 बार और बाद में 4 बजे ° scaffolds पीबीएस के साथ सी.
- पीबीएस निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ समाधान, पीबीएस में भंग जोड़ने के 1% सामान्य बकरी सीरम के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए पूरक.
- पीबीएस घंटे 1 और बाद में रात खत्म 4 ° C अंधेरे में के लिए 4-6 बार के साथ नमूनों धो लें.
- एक नाभिक धुंधला के लिए एक 30 मिनट के लिए DAPI समाधान के 400 μl जोड़ सकते हैं.
- नमूने एक खुर्दबीन स्लाइड की जरूरत है माउंट. खुर्दबीन स्लाइड पर 50 μl Mowiol / Dabco जोड़ें. 4 अच्छी तरह से थाली से कवर फिसल जाता निकालें और उन्हें बढ़ते माध्यम पर ध्यान रखा.
- यहाँ हम एक Biozero 8000 इस्तेमाल कियामाइक्रोस्कोप (KEYENCE, जर्मनी, कार्लज़ूए) एकल micrographs और z-ढेर प्राप्त करने के लिए. प्रत्येक ढेर 1-2 सुक्ष्ममापी की दूरी के साथ 30 एकल चित्रों शामिल हैं. इसी विश्लेषक सॉफ्टवेयर का प्रयोग प्रतिदीप्ति निहित कलंक Z-ढेर उत्पादित थे पूर्ण अनुमानों से पहले हटा दिया गया था.
3. भाग 3: hNPCs के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए scaffolds से रिलीज
- Scaffolds से कोशिकाओं की रिहाई के लिए अग्रिम में 500 μl HBSS साथ scaffolds धो लो.
- 1000 एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार युक्त ट्यूब सेल संस्कृति माध्यम μl विंदुक के माध्यम से scaffolds के स्थानांतरण.
- Scaffolds को बाधित करने के लिए सेल समाधान यंत्रवत् एक 1000 μl विंदुक के साथ कई बार resuspend और बाद में 5 मिनट के लिए 3000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र.
- एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, trypsin / Benzonase समाधान के 500 μl जोड़ने और सेल गोली कई बार resuspend.
- 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते37 पर ° समाधान / trypsin Benzonase में सी. रोक के लिए प्रतिक्रिया 1 मिलीलीटर Trypsin-inhibitor/Benzonase समाधान जोड़ने और विंदुक ऊपर और नीचे कई बार.
- सेल निलंबन 3000 XG पर 5 मिनट अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने और 2 मिलीलीटर HBSS बफर के साथ कोशिकाओं को धोने. इस कदम को दो बार दोहराएँ. यह प्रक्रिया मैट्रिक्स मलबे को हटा देगा.
- सेल निलंबन समाधान गर्त एक सेल (ताकना आकार 70 सुक्ष्ममापी) झरनी समुच्चय को हटाने और सेल संस्कृति माध्यम से कोशिकाओं को इकट्ठा दर्रा. प्राप्त कोशिकाओं वरीयता प्राप्त पैच दबाना या fluometric माप के रूप में कार्यात्मक अध्ययन के लिए कवर फिसल जाता है पर फिर जैसे कर सकते हैं. प्रवाह cytometry के लिए कोशिकाओं की प्रक्रिया करने के लिए, कोशिकाओं को तुरंत ठीक (4.1 देखें).
4. भाग 4: प्रवाह cytometry द्वारा βIII ट्यूबिलिन सकारात्मक कोशिकाओं की मात्रा
- जारी 3.7 चरण में 1% पीएफए के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्राप्त कोशिकाओं को ठीक करें.
- 3000 XG और remov में 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्रसतह पर तैरनेवाला ई. यदि आवश्यक हो, कोशिकाओं को 4 ° बाद में विश्लेषण के लिए सी में संग्रहीत होने के लिए तैयार किया जा सकता है है. इसलिए धोने बफर (पीबीएस में 0.5% BSA और 0.02% ना के azide के साथ पूरक) में resuspend कोशिकाओं.
- प्रवाह cytometry के लिए तैयारी के साथ आगे बढ़ना करने के लिए, 350 XG पर 10 मिनट के लिए सेल निलंबन, अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागने और एंटीबॉडी समाधान के 25 μl में कोशिकाओं resuspend. इसलिए पहली एंटीबॉडी सैपोनिन बफर के साथ एक एकाग्रता 1:100 जैसे βIII - ट्यूबिलिन में मिलाया जाता है. सैपोनिन बफर 0.5% की एक सैपोनिन एकाग्रता, 0.5% की एक BSA एकाग्रता और 0.02% की एक ना-azide एकाग्रता के साथ पीबीएस के होते हैं.
- एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए पहली एंटीबॉडी के साथ सेल निलंबन सेते हैं. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पहली एंटीबॉडी के बिना एक नमूना तैयार करते हैं.
- पहली धोने के कदम के लिए 300 μl सैपोनिन बफर कोशिकाओं को सीधे जोड़ने. 5 मिनट के लिए 350 x जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र दूसरी धोने कदम के लिए त्यागें,सतह पर तैरनेवाला, 300 μl बफर जोड़ने और 5 मिनट के लिए 350 x जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और 25 μl माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे Alexa 647 Fluor, 1:1000, सैपोनिन बफर में भंग) युक्त समाधान जोड़ें. कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी अंधेरे में 1 के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
- पहली धोने के कदम के लिए 300 μl सैपोनिन बफर कोशिकाओं को सीधे जोड़ने. 5 मिनट के लिए 350 x जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र दूसरी धोने कदम के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागने, 300 μl बफर जोड़ने और 5 मिनट के लिए 350 x जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए 500 μl धो बफर में कोशिकाओं resuspend.
5. प्रतिनिधि परिणाम
स्वयं कोडांतरण hydrogel पाड़ PuraMatrix में सभ्य hNPCs का एक उदाहरण संख्या 1 में दिखाया गया है. hNPCs असंशोधित PM गोलाकार संरचनाओं की तरह में बढ़ता है. इस संस्कृति हालत मेंएस कोशिकाओं, एक संचरण प्रकाश में शायद ही मान्यता प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि क्षेत्रों के बीच प्रक्रियाओं के बंडलों (अंजीर 1 ए) दिखाई दे रहे हैं. प्रयुक्त कोशिका प्रकार की संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता है, मैट्रिक्स laminin जोड़कर उदाहरण संशोधित कर सकते हैं. HNPC सेल लाइन के लिए ReNcell VM laminin (Millipore) कम घने समुच्चय के साथ एक वृद्धि पैटर्न लेकिन कक्षों की एक और अधिक सजातीय वितरण (अंजीर 1B) पैदा करने के लिए आवश्यक है. संशोधनों के स्वतंत्र, मैट्रिक्स जैसे neuronal भेदभाव अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 1C neuronal मार्कर βIII - ट्यूबिलिन के लिए hNPCs के एक धुंधला हो जाना प्रस्तुत करता है. इस उदाहरण में कोशिकाओं मैट्रिक्स में 7 दिनों के लिए बड़े हो रहे थे और बाद में 4 दिन, जहां भेदभाव वृद्धि कारक EGF और 13 bFGF. सेल निकायों की वापसी और कोशिकाओं द्वारा निर्मित प्रक्रियाओं के एक घने नेटवर्क द्वारा प्रेरित किया गया था के लिए विभेदित किया जा सकता है आसानी से पहचाना. हालांकि, यह स्पष्ट है कि सेल संख्या की एक मात्रा का ठहराव की एक बड़ी संख्या के रूप में समय लगता हैमैट्रिक्स के विभिन्न क्षेत्रों के चित्रों के लिए विश्लेषण किया है, एक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक विश्वसनीय डेटा बेस प्राप्त है. अंजीर 1D में एक मैट्रिक्स से जारी है और बाद में कवर फिसल जाता है पर platted कोशिकाओं का एक उदाहरण देख सकते हैं. इन कोशिकाओं कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
3 डी scaffolds से कोशिकाओं की रिहाई के लिए मार्कर प्रोटीन या AnnexinV / पीआई धुंधला हो जाना या एक TUNEL के परख द्वारा कोशिकाओं के जीवित रहने की दर की अभिव्यक्ति की तरह विभिन्न मापदंडों का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करता है. चित्रा 2 βIII - ट्यूबिलिन + कोशिकाओं के प्रतिशत के प्रवाह cytometry विश्लेषण का एक उदाहरण दिखाता है. नकारात्मक नियंत्रण (कोशिकाओं βIII - ट्यूबिलिन लिए चिह्नित नहीं है) आंकड़ा 2A में दिखाया गया है. इन नियंत्रणों के लिए βIII - ट्यूबिलिन + कोशिकाओं (अंजीर 2B) के बाद पता लगाने के लिए फाटक निर्धारित किया जाता है. कक्षों की एक पुस्तिका गिनती और प्रवाह cytometry द्वारा एक विश्लेषण की तुलना आंकड़ा 2C में दिखाया गया है. βIII ट्यूबिलिन + कोशिकाओं का प्रतिशत determ थाकुल सेल नंबर (परमाणु DAPI धुंधला के माध्यम से) और प्रतिदीप्ति तस्वीरों में βIII - ट्यूबिलिन + कोशिकाओं की संख्या की गणना के द्वारा ined.
चित्रा 1. hNPCs स्वयं कोडांतरण पेप्टाइड hydrogel PuraMatrix में सभ्य ए) PuraMatrix में समझाया hNPCs (प्रधानमंत्री) गोलाकार, घने पैक संरचनाओं में बढ़ती है, जहां क्षेत्रों के व्यास कई सौ सुक्ष्ममापी जा सकता है.. क्षेत्रों के बीच में एक कोशिकाओं (तीर) द्वारा निर्मित प्रक्रियाओं के बंडलों को पहचान सकते हैं. बी) PuraMatrix में समझाया कक्ष laminin (पीएमएल) के कम घना ढांचे में विकसित, अधिक homogenously वितरित के साथ पूरक. पूरक एक मैट्रिक्स कम घने क्षेत्रों (तीर) में एकल कक्षों की पहचान कर सकते हैं laminin में, लेकिन यह शायद ही संभव है कोशिकाओं की संख्या यों. सी) hNPCs βIII - ट्यूबिलिन (हरा) की तरह पीएमएल व्यक्त neuronal मार्कर में 4 दिनों के लिए विभेदित. Evalua करने के लिएते सकारात्मक कोशिकाओं एक DAPI (नीला) की तरह एक नाभिक धुंधला द्वारा कुल सेल नंबर निर्धारित प्रतिशत. माइक्रो फोटोग्राफ Biozero-8000 खुर्दबीन के साथ लिए गए चित्रों का एक z-ढेर से भरा प्रक्षेपण प्रस्तुत करता है. डी) मैट्रिक्स से जारी कक्ष जैसे आगे कार्यात्मक अध्ययन के लिए कवर फिसल जाता है पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है. माइक्रो फोटोग्राफ 3 डी के लिए सभ्य कोशिकाओं, बाद में रिलीज प्रक्रिया से पता चलता है. βIII - ट्यूबिलिन के लिए धुंधला हो जाना (लाल) 3D पाड़ में होस्ट की कोशिकाओं के लिए एक तुलनीय आकारिकी पता चलता है.
चित्रा 2. प्रवाह cytometry विश्लेषण कोशिकाओं PuraMatrix से जारी करने के लिए समय लेने microphotographs हम एक प्रोटोकॉल का इस्तेमाल PuraMatrix प्रवाह cytometry द्वारा तेजी से विश्लेषण करने के लिए पहुँच देने में संवर्धित कोशिकाओं जारी की मात्रा का ठहराव पर काबू पाने के लिए.. एक) बेदाग कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया, बाद में विश्लेषण के लिए गेट (काले फ्रेम) सेटजैसे βIII ट्यूबिलिन कोशिकाओं की. बी) + βIII ट्यूबिलिन कोशिकाओं का प्रतिशत एक ही गेट, नकारात्मक नियंत्रण में सेट इस्तेमाल किया गया था यों. सकारात्मक कोशिकाओं को x-अक्ष (बिंदीदार फ्रेम) जहां भी एक मध्यवर्ती आबादी में मनाया गया, सबसे अधिक संभावना का प्रतिनिधित्व सेल मलबे के दाएँ भाग में दिखाई देते हैं. सी) पुस्तिका गिना कोशिकाओं और कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा गिना की तुलना सकारात्मक कोशिकाओं के एक बहुत उच्च अनुपात है, जहां समय निर्भरता + βIII - ट्यूबिलिन की संख्या के बराबर था, प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता का संकेत का पता चला.
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Discussion
-3D scaffolds के प्रयोग के लिए एक सेल संस्कृति की स्थिति में करीब vivo स्थिति में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विकास का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है. हालांकि, जैसे neuronal भेदभाव या कार्यात्मक अध्ययन एक के लिए कुछ बाधाओं पर काबू पाने के लिए सेल प्रकार के जैसे मात्रा का ठहराव के लिए विश्वसनीय डेटा हासिल है के विश्लेषण के बारे में.
यहाँ हम पेप्टाइड पाड़ PuraMatrix FACS या कार्यात्मक assays के रूप में उपकरण के लिए एक आसान पहुँच प्रदान एक 2d स्थिति में अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं के बाद रिलीज आधारित hydrogel में hNPCs की संस्कृति वर्णित है. हाल ही में हम परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी और अस्तित्व और कोशिकाओं की भिन्नता पर प्रभाव 3D-पाड़ के गठन पर PuraMatrix एकाग्रता के प्रभाव का प्रदर्शन 13 हालांकि, एक को ध्यान में रखना है कि प्रत्येक कोशिका प्रकार अलग संस्कृति की आवश्यकता हो सकती है. शर्तों या अन्य सामग्री शामिल matrices जैसे matrigएल या कोलेजन.
कोशिकाओं को रिलीज प्रोटोकॉल 18 निर्माता द्वारा उपलब्ध कराई प्रोटोकॉल पर आधारित है और जैसे प्राथमिक neuronal संस्कृतियों जहां कोशिकाओं के यांत्रिक अलगाव एंजाइमों द्वारा सामग्री आसपास के पाचन द्वारा पीछा किया जाता है तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के साथ तुलनीय है. कोशिकाओं को इस प्रक्रिया को और बर्दाश्त महत्वपूर्ण और प्रक्रियाओं बनाया रहने और βIII - ट्यूबिलिन तरह neuronal मार्कर व्यक्त, एक बार वे फिर से एक laminin लेपित सतह पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. यहाँ हम जारी कोशिकाओं के साथ प्रवाह cytometry अध्ययन का प्रदर्शन βIII ट्यूबिलिन + कोशिकाओं की राशि यों. एक "मैन्युअल" micrographs में कक्षों की गणना के द्वारा किया परिमाणन की तुलना βIII - ट्यूबिलिन + कोशिकाओं का एक बहुत उच्च अनुपात का पता चला. यह मैनुअल विश्लेषण की तुलना में प्रवाह (50.000 जांच प्रति) कोशिकामापी (जांच प्रति कई सौ) द्वारा गिना कोशिकाओं की उच्च संख्या के कारण सबसे अधिक संभावना है. हालांकि, बिस्तर और की संख्या के कैनेटीक्सएटा,-III ट्यूबिलिन + कोशिकाओं दोनों नमूनों में एक ही पैटर्न है, जहां हम समय पर βIII - ट्यूबिलिन + कोशिकाओं की कमी का पता लगाने के बाद. यह ReNcell VM कोशिकाओं का उपयोग अध्ययन के अनुसार 15-17 अन्य बाधाओं के लिए एक मैनुअल विश्लेषण के दौरान काबू पाने. Matrices है जो शायद ही विश्लेषण किया जा सकता है या मैट्रिक्स सामग्री के उच्च पृष्ठभूमि "असली" का एक मूल्यवान समझना में जिसके परिणामस्वरूप का बहुत घने क्षेत्रों हैं सेल नंबर. हम आश्वस्त हैं कि इस प्रोटोकॉल अन्य सेल प्रकार एक तेज और विश्वसनीय विधि प्रसार, भेदभाव, या कोशिकाओं के अस्तित्व के कई पहलुओं यों प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए अपनी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए नॉर्मन क्रूगर धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
References
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