Summary
Qui si descrive l'uso di un auto-assemblaggio 3-dimensionale patibolo alla cultura cellule umane progenitrici neurali. Vi presentiamo un protocollo per liberare le cellule dai ponteggi da analizzare successivamente, ad esempio mediante citometria di flusso. Questo protocollo potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule per effettuare studi dettagliati meccanicisticamente.
Abstract
L'influenza di 3 dimensioni (3D) ponteggi sulla differenziazione della crescita, la proliferazione neuronale e, infine, è di grande interesse al fine di trovare nuovi metodi per le terapie basate sulle cellule e standardizzati a disturbi neurologici o malattie neurodegenerative. Strutture 3D sono tenuti a fornire un ambiente molto più vicino alla situazione in vivo di culture 2D. Nel contesto della medicina rigenerativa, la combinazione di ponteggi biomateriale con staminali neurali e cellule progenitrici promette grandi come strumento terapeutico. 1-5 sistemi di cultura che emula un ambiente di tre dimensioni hanno dimostrato di influenzare la proliferazione e la differenziazione in diversi tipi di staminali e cellule progenitrici. Qui, la formazione e la funzionalizzazione del 3D-microenviroment è importante determinare la sopravvivenza e il destino delle cellule incorporato. 6-8 Qui abbiamo usato PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un peptide idrogel a base patibolo,che è ben descritto e usato per studiare l'influenza di un ambiente 3D su diversi tipi di cellule. 7,11-14 PuraMatrix possono essere personalizzati in modo semplice e sintetico la realizzazione di nano-fibre fornisce una 3D-cultura sistema di alta affidabilità, che in aggiunta xeno-free.
Recentemente abbiamo studiato l'influenza della concentrazione di PM-sulla formazione del patibolo. 13 In questo studio le concentrazioni di PM utilizzato ha avuto un impatto diretto sulla formazione della struttura 3D, che è stato dimostrato dalla microscopia a forza atomica. Una successiva analisi della sopravvivenza e della differenziazione dei hNPCs rivelato un'influenza delle concentrazioni di PM utilizzate sul destino delle cellule incorporato. Tuttavia, l'analisi di sopravvivenza o la differenziazione neuronale mediante tecniche di immunofluorescenza possiede alcuni ostacoli. Per ottenere dati attendibili, si deve determinare il numero totale di celle all'interno di una matrice per ottenere il numero relativo di esempio. cellule neuronali segnato da βIII-tubulina. Questi prerequisiti di una tecnica per analizzare i ponteggi in tutte le 3-Dimensioni da un microscopio confocale o una tecnica paragonabile come microscopi a fluorescenza in grado di prendere z-stack del campione. Inoltre questo tipo di analisi è estremamente tempo.
Qui mostriamo un metodo per rilasciare le cellule dal 3D-scaffold per l'esempio, una successiva analisi in citometria a flusso. In questo protocollo umani le cellule progenitrici neurali (hNPCs) della linea cellulare ReNcell VM (Millipore USA) sono state coltivate e differenziati in 3D ponteggi costituito da PuraMatrix (PM) o PuraMatrix integrato con laminina (PML). Nelle nostre mani un PM concentrazione dello 0,25% è stato ottimale per la coltivazione delle cellule 13, tuttavia la concentrazione potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule. 12 Le cellule rilasciato può essere utilizzato ad esempio per studi immunocitochimiche e successivamente analizzate mediante citometria a flusso. Questo accelera l'analisi e more oltre, il resto i dati ottenuti su una base più larga, migliorando l'affidabilità dei dati.
Protocol
1. Parte 1: Cultura della hNPCs in PuraMatrix
- In anticipo per la generazione di un ponteggio con una concentrazione PuraMatrix del 0,25% senza laminina si ha la necessità di preparare le seguenti soluzioni
- Preparare una soluzione contenente 20% di saccarosio e una soluzione contenente il 10% di saccarosio disciolto in acqua distillata sterile.
- Per la soluzione 1 mix 120 ml di soluzione di saccarosio al 20% con 120 ml di acqua distillata in una provetta da 1,5 ml.
- Per la soluzione 2 mescolare 60 ml di soluzione PuraMatrix con 60 ml di soluzione di saccarosio al 20% in un tubo di 1,5 ml.
Per la preparazione di un ponteggio con una concentrazione di 0,25% PuraMatrix integrato con laminina (8 mg per 100 microlitri Matrix) si ha la necessità di preparare le seguenti soluzioni.
- Per la soluzione 1 miscelare 72 ml di acqua distillata con 120 ml di soluzione di saccarosio al 20% e 48 microlitri laminina in un tubo di 1,5 ml.
- Per la soluzione 2 mescolare 60 microlitri PuraMatrix soluzione con 60 ml di soluzione di saccarosio al 20% in una provetta da 1,5 ml.
- Per il radicamento di cellule nel PuraMatrix preparare un 4-ben piastra di coltura cellulare e mettere un coperchio di vetro sterilizzati antiscivolo (diametro 13 mm) in due pozzi. Conservare la piastrina in panchina pulita per l'uso in seguito. Scivola copertura in vetro vengono utilizzati solo per gli studi di immunocitochimica. Se non colorazioni immunocitochimiche sono destinati, il passo può essere saltato.
Per preparare il hNPCs per l'incapsulamento in 3D uno ponteggi deve preparare le seguenti soluzioni. Diluire il benzonasi nel tripsina / EDTA soluzione, utilizzando un fattore di diluizione di 1:10.000. Per un mix soluzione Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + benzonasi 25U/μl + 1% + Tripsina HSA-inibitore (0.5mg/ml).
- Staccare le cellule aggiungendo 500 microlitri tripsina / benzonasi soluzione e incubare per 5 minuti in un incubatore (37 ° C, 5% di CO 2). Arrestare la reazione con la soluzione Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Successivamente le cellule centrifuga staccato per 5 min a 3000 x g. Lavare le cellule con 5 ml di soluzione di saccarosio al 10% e centrifugare nuovamente. Scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in soluzione di saccarosio al 10%, la soluzione finale deve contenere cellule 1x10 6 cellule / ml.
I prossimi passi, da 1,8 a 1,11, dovrebbe essere fatto il più velocemente possibile, a causa del basso pH della soluzione PuraMatrix, che potrebbe essere dannosa per le cellule.
- Mescolare 60 ml di sospensione cellulare con la soluzione 1.
- Aggiungere 120 ml di soluzione 1, contenente le cellule, per il tubo conico con la soluzione 2 e mescolare con cura.
- Posto 100 ul della miscela immediatamente su ogni copertina scivola risiedeva nel 4-pozzetti.
- Aggiungere lentamente 200 ul terreno di coltura cellulare per bene e dopo 2-3 minuti, un altro 200 ul. Questo avvierà l'auto-assemblaggio della matrice.
- Incubare cells a 37 ° C, per 1 ora in panchina pulita su una piastra di riscaldamento o l'area riscaldata del banco pulito. Per quanto possibile, non si muovono la piastra in quanto ciò potrebbe danneggiare l'assemblaggio delle matrici.
- Rimuovere la maggior parte del mezzo, ma non tutti, per evitare le matrici cadere a secco, con una pipetta 1000 ml. Aggiungere 500 l di media a lavare matrici per 10 minuti. Infine rimuovere il supporto e aggiungere 500 microlitri di medie posto fresco e la piastra di coltura in un incubatore (37 ° C CO, 5% 2). Poiché le matrici sono sensibili agli urti i piatti dovrebbe essere spostato il meno possibile e conservarli, se possibile, in un apposito incubatore.
- Il hNPCs qui utilizzate sono state moltiplicate per 7 giorni nel 3D-scaffold e la differenziazione è stata avviata con il ritiro dei fattori di crescita 13. Medio è stato cambiato ogni 2-3 giorni.
2. Parte 2: colorazione immunocitochimica delle matrici intere
- In anticipo per la procedura di colorazione bisogna preparare: abSoluzione tampone di bloccaggio composto da 5% di siero normale di capra e lo 0,3% di Triton X-100 (sciolto in PBS, una soluzione di paraformaldeide al 4% sulla base di 0,1 M PBS e se aveva bisogno di una soluzione con 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid DAPI) per la colorazione dei nuclei DAPI contenente 100 ng / ml sciolto in PBS. I campioni sono stati montati con un misto di Mowiol e DABCO.
- Per lavare le matrici di rimuovere il terreno con una pipetta 1000 ml e lavare i ponteggi una volta con PBS per 5 minuti.
- Per fissare i ponteggi togliere il PBS e aggiungere 400 ml di paraformaldeide (4% di 0,1 M PBS) in ogni pozzetto e incubare le matrici per 30 minuti a temperatura ambiente. Ponteggi fissi possono essere memorizzati in PBS integrato con 0,02% NaN 3 a 4 ° C per diverse settimane fino a diversi mesi.
- Prima di una colorazione lavare i ponteggi con PBS per 5 minuti.
- Incubare i ponteggi in blocco soluzione tampone. Soluzione bloccante è stata cambiata tre volte ogni 2-3 ore ed esercizi successividipendentemente ponteggi sono stati incubati in soluzione il blocco durante la notte a 4 ° C.
- Rimuovere la soluzione tampone di bloccaggio e aggiungere l'anticorpo primario sciolto in PBS integrato con 1% di siero normale di capra e incubare le matrici per tutta la notte a 4 ° C.
- Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e lavare ponteggi 4 volte per 2 ore e successivamente per tutta la notte a 4 ° C con PBS.
- Rimuovere la PBS e aggiungere la soluzione con l'anticorpo secondario, sciolto in PBS integrato con 1% di siero di capra normale, per 4 ore a temperatura ambiente al buio.
- Lavare i campioni con PBS 4-6 volte per 1 ora e successivamente per tutta la notte a 4 ° C al buio.
- Per una colorazione nuclei si possono aggiungere 400 microlitri della soluzione DAPI per 30 min.
- Per montare i campioni si ha la necessità vetrini da microscopio. Aggiungere 50 microlitri Mowiol / DABCO sui vetrini da microscopio. Togliere il coperchio scivola dal 4-pozzetti e metterli attenzione sul supporto di montaggio.
- Qui abbiamo usato un 8000 Biozeromicroscopio (Keyence, Germania, Karlsruhe) per ottenere micrografie singolo e z-stack. Ogni stack contiene 30 singole immagini con una distanza di 1-2 micron. Utilizzando il software corrispondente analizzatore la sfocatura inerente alla fluorescenza è stato rimosso prima proiezione completa del z-stack sono stati prodotti.
3. Parte 3: Rilascio di hNPCs dalle impalcature per l'analisi di citometria a flusso
- In anticipo per il rilascio delle cellule dal ponteggi lavare i ponteggi HBSS con 500 microlitri.
- Trasferire i ponteggi per mezzo di una pipetta 1000 ml in una provetta da 15 ml contenenti terreno di coltura cellulare.
- Per disturbare i ponteggi meccanicamente risospendere la soluzione delle cellule più volte con una pipetta 1000 ml e, successivamente, centrifugare la soluzione a 3000 xg per 5 min.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta, aggiungere 500 ml di tripsina / benzonasi soluzione e risospendere il pellet di cellule diverse volte.
- Incubare le cellule per 5 minutia 37 ° C in tripsina / benzonasi soluzione. Per fermare la reazione aggiungere 1 ml di soluzione Trypsin-inhibitor/Benzonase e pipettare su e giù diverse volte.
- Centrifugare la sospensione cellulare 5 min a 3000 xg, rimuovere il surnatante e lavare le cellule con 2 ml di tampone HBSS. Ripetere questa operazione due volte. Questa procedura rimuovere i detriti matrice.
- Passare attraverso la sospensione di cellule soluzione un filtro cella (dimensione dei pori 70 micron) per rimuovere inerti e raccogliere le cellule in terreno di coltura cellulare. Le cellule ottenute possono essere seminati di nuovo ad esempio su vetrini coprioggetto per studi funzionali come patch clamp o misure fluometric. Per elaborare le cellule per citometria a flusso, fissare le cellule immediatamente (vedi 4.1).
4. Parte 4: Quantificazione βIII-tubulina cellule positive mediante citometria di flusso
- Fissare le cellule rilasciato ottenuto nel passaggio 3,7% PFA con 1 per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 3000 xg di age il surnatante. Se necessario, le cellule possono essere preparato per essere conservato a 4 ° C per la successiva analisi. Quindi risospendere le cellule in tampone di lavaggio (PBS integrata con 0,5% di BSA e 0,02% Na-azide).
- Per procedere con la preparazione per la citometria a flusso, centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 350 xg, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 25 microlitri della soluzione di anticorpi. Pertanto il primo anticorpo è mescolato con tampone saponina ad una concentrazione 1:100 per esempio βIII-tubulina. Il buffer è costituito da saponina PBS con una concentrazione di saponina dello 0,5%, una concentrazione di BSA 0,5% e una Na-azide concentrazione del 0,02%.
- Incubare la sospensione cellulare con il primo anticorpo per 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Come controllo negativo preparare un campione senza il primo anticorpo.
- Per la prima fase di lavaggio aggiungere 300 microlitri di buffer saponina direttamente alle cellule. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. Per la fase di lavaggio secondo, scartareil surnatante, aggiungere 300 microlitri di buffer e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 25 ul di soluzione contenente l'anticorpo secondario (per esempio Alexa Fluor 647, 1:1000, disciolto in tampone saponina). Incubare le cellule con l'anticorpo secondario 1h a temperatura ambiente, al buio.
- Per la prima fase di lavaggio aggiungere 300 microlitri di buffer saponina direttamente alle cellule. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. Per la fase di lavaggio secondo, scartare il surnatante, aggiungere 300 microlitri di buffer e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g.
- Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lavaggio per l'analisi di citometria a flusso.
5. Rappresentante Risultati
Un esempio di hNPCs coltivate in auto-assemblaggio idrogel impalcatura PuraMatrix è mostrato in figura 1. Il hNPCs crescere in strutture sferica come in PM non modificato. In questa condizione la culturas, le cellule possono difficilmente essere riconosciuta in una trasmissione della luce, anche se fasci di processi tra le sfere sono visibili (fig. 1A). A seconda delle condizioni di coltura del tipo di cellule, la matrice può essere modificato ad esempio con l'aggiunta di laminina. Per la linea cellulare hNPC ReNcell VM (Millipore) laminina è necessario per indurre un modello di crescita con aggregati meno denso, ma una distribuzione più omogenea delle cellule (fig 1B). Indipendente di modifiche, la matrice può essere utilizzato per studiare ad esempio la differenziazione neuronale. Figura 1C presenta una colorazione della hNPCs per il marcatore neuronale βIII-tubulina. In questo esempio, le cellule sono state coltivate per 7 giorni nella matrice e successivamente differenziati per 4 giorni, in cui è stata indotta la differenziazione con il ritiro dei fattori di crescita EGF e bFGF. 13 corpi cellulari e una fitta rete di processi costruiti dalle cellule possono essere riconosciuto facilmente. Tuttavia, è evidente che una quantificazione del numero delle cellule è molto tempo, come un gran numero dile immagini di diverse regioni della matrice deve essere analizzato, per ottenere una base di dati affidabile per una analisi statistica. In 1D fico si può vedere un esempio di cellule rilasciati dalla matrice e successivamente intrecciata su coprioggetto. Queste cellule potrebbero essere utilizzate per studi funzionali.
Il rilascio delle cellule dal 3D-scaffold offre la possibilità di analizzare diversi parametri come espressione di proteine marker o il tasso di sopravvivenza delle cellule da parte AnnexinV / PI colorazione o un saggio TUNEL. La Figura 2 mostra un esempio di analisi di citometria a flusso della percentuale di βIII-tubulina cellule +. Il controllo negativo (cellule non contrassegnati per βIII-tubulina) è mostrato in figura 2A. Questi controlli vengono utilizzati per determinare la porta per la rilevazione successiva βIII-tubulina + cellule (Fig. 2b). Un confronto di un conteggio manuale delle cellule e l'analisi in citometria a flusso è mostrato nella figura 2C. La percentuale di βIII-tubulina cellule + è stato determINED contando il numero totale di cellule (per mezzo di una colorazione nucleare DAPI) e il numero di cellule tubulina βIII-+ nelle immagini a fluorescenza.
Figura 1. hNPCs coltivate in auto-assemblaggio PuraMatrix peptide idrogel. A) hNPCs incapsulati in PuraMatrix (PM) crescono in sferica, strutture dense confezionato, in cui il diametro delle sfere può arrivare a diverse centinaia di micron. Tra le sfere si può riconoscere fasci di processi costruiti dalle cellule (frecce). B) Le cellule incapsulate in PuraMatrix integrato con laminina (PML) crescono in strutture meno denso, più omogeneamente distribuita. Nel laminina integrata matrice si può riconoscere singole cellule in aree meno dense (frecce), tuttavia è quasi impossibile quantificare il numero di cellule. C) hNPCs differenziato per 4 giorni in contrassegno PML esprimere neuronali come βIII-tubulina (verde). Di valutazionete la percentuale di cellule positive si deve determinare il numero totale delle cellule da una colorazione nuclei come DAPI (blu). Il Microfotografia presenta la proiezione completa di un z-pila di foto scattate con Biozero-8000 microscopio. D) Le cellule rilasciati dalla matrice possono essere seminati su vetrini coprioggetto per esempio per ulteriori studi funzionali. Il Microfotografia mostra cellule in coltura per il 3D, successivamente alla procedura di rilascio. La colorazione per βIII-tubulina (rosso) rivela una morfologia comparabile alle cellule ospitato nel patibolo 3D.
Figura 2. Analisi di citometria a flusso delle cellule liberato dalla PuraMatrix. Per superare la quantificazione in termini di tempo di microfotografie abbiamo utilizzato un protocollo di rilasciare cellule in coltura in PuraMatrix che danno accesso alle più veloce analisi di citometria a flusso. A) le cellule non colorati sono state usate come controllo negativo, per impostare la porta (cornice nera) per la successiva analisiper esempio di βIII-tubulina cellule. B) Per quantificare la percentuale di βIII-tubulina + cellule è stata utilizzata la porta stessa, ambientato nel controllo negativo,. Cellule positive appaiono nella parte destra l'asse x, dove inoltre è stata osservata una popolazione intermedia (telaio tratteggiata), molto probabilmente detriti cellulari che rappresentano. C) Il confronto del manuale cellule contate e le cellule contate mediante citometria a flusso ha evidenziato una più alta proporzione di cellule positive, dove la dipendenza dal tempo del numero di βIII-tubulina + era paragonabile, indicando l'affidabilità del protocollo di citometria a flusso.
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Discussion
L'uso del 3D-scaffold offre l'opportunità di studiare lo sviluppo di diversi tipi di cellule in una situazione di coltura cellulare più vicino alla situazione in vivo. Per quanto riguarda invece l'analisi di esempio differenziamento neuronale o studi funzionali si deve superare alcuni ostacoli per ottenere dati affidabili per la quantificazione esempio di tipi di cellule.
Qui abbiamo descritto la cultura del hNPCs in idrogel a base di peptidi patibolo PuraMatrix e il conseguente rilascio delle cellule da utilizzare per gli studi in una situazione in 2D che fornisce un facile accesso a strumenti come FACS o test funzionali. Recentemente abbiamo dimostrato l'influenza della concentrazione PuraMatrix sulla formazione del 3D-patibolo con la microscopia a forza atomica e l'influenza sulla sopravvivenza e la differenziazione delle cellule. 13 Tuttavia, si deve tenere presente che ogni tipo di cellula può avere bisogno cultura diversa condizioni o matrici composto di altri materiali ad es matrigel o collagene.
Il protocollo per rilasciare le cellule si basa su un protocollo fornito dal produttore 18 ed è comparabile con i protocolli utilizzati per preparare ad esempio, colture primarie neuronali in cui è seguito un isolamento meccanico delle celle da una digestione di materiale circostante da parte degli enzimi. Le cellule tollerare questa procedura e rimanere vitale e costruito processi ed esprimono marcatori neuronali come βIII-tubulina, una volta che sono seminati di nuovo su una superficie rivestita laminina. Qui abbiamo effettuato studi di citometria a flusso con le cellule rilasciato per quantificare la quantità di βIII-tubulina cellule +. Il confronto per una quantificazione fatta "manualmente" contando le cellule al microscopio ha rivelato una più alta proporzione di βIII-tubulina cellule +. Ciò è probabilmente dovuto al maggior numero di cellule contate dal citofluorimetro (50.000 per sonda) rispetto all'analisi manuale (diverse centinaia per sonda). Tuttavia, la cinetica del numero di & bdell'ETA, III-tubulina + cellule segue lo stesso schema in entrambi i campioni, dove si rileva una diminuzione di βIII-tubulina + cellule nel tempo. Questo è in accordo con studi che utilizzano le cellule VM ReNcell. 15-17 ostacoli da superare altri nel corso di una analisi manuale sono aree molto dense di matrici che difficilmente può essere analizzato o di fondo di materiale a matrice con conseguente sottovalutazione del "reale" numero di cellule. Siamo convinti che questo protocollo può essere adattato per altri tipi di cellule fornendo un metodo veloce e affidabile per quantificare alcuni aspetti di proliferazione, differenziamento e la sopravvivenza delle cellule.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Norman Krüger per il suo eccellente supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
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