Summary
Burada kendi kendine montaj 3-boyutlu iskele kültür insan nöral progenitör hücrelerin kullanımını tanımlamak. Biz flow sitometri ile analiz edilecek daha sonra örneğin iskeleleri hücreleri serbest bırakmak için bir protokol mevcut. Bu protokol detaylı mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için diğer hücre türlerine adapte olabilir.
Abstract
Büyümesi, çoğalması ve son olarak nöronal farklılaşma 3 boyutlu (3D) iskeleleri etkisi nörolojik bozukluklar ya da nörodejeneratif hastalıklar hücre tabanlı ve standart tedaviler için yeni yöntemler bulmak için büyük ilgi. 3 boyutlu yapıları, 2D kültürleri daha vivo durum çok daha yakın bir ortam sağlamak için bekleniyor . Rejeneratif tıp bağlamında, sinir kök ve progenitör hücreler ile biyomalzeme iskelelerde kombinasyon tedavi edici bir araç olarak büyük umut vaat ediyor. Üç boyutlu bir ortamda taklit 1-5 Kültür sistemleri ve farklı tipte kök çoğalma ve farklılaşmasını etkiler görülmüştür progenitör hücreler. Burada, 3D-microenviroment oluşumu ve fonksiyonelleştirilmesi gömülü hücrelerin hayatta kalma ve kaderi belirlemek için önemlidir. 6-8 Burada PuraMatrix 9,10 (RADA16 PM), peptid bazlı hidrojel iskele, ikinciiyi tanımlanmış ve farklı hücre tipleri üzerinde bir 3D-çevre etkisini incelemek için kullanılır. 7,11-14 PuraMatrix kolayca özelleştirilebilir ve nano liflerin sentetik imalat, yüksek güvenilirlik 3D-kültür sistemi, sağlar . Ayrıca xeno ücretsiz.
Yakın zamanda iskele oluşumu PM konsantrasyonunun etkisini inceledik. 13 Bu çalışmada kullanılan PM konsantrasyonları atomik kuvvet mikroskobu ile gösterilmiştir 3D yapısı, oluşumu üzerinde doğrudan bir etkisi vardı. HNPCs hayatta ve farklılaşma bir sonraki analiz gömülü hücreler kaderi PM konsantrasyonlarının etkisi saptandı. Ancak, immünofloresan teknikleri sahip bazı engeller sayesinde hayatta kalma ya da nöronal farklılaşma analizi. Güvenilir veri elde etmek için, bir örneğin göreli sayısını elde etmek için bir matris içinde hücrelerin toplam sayısını belirlemek için. βIII-tubulin tarafından işaretlenmiş nöronal hücrelerin. Bu önkoşulları, 3-boyutlu olarak iskeleler numune z-yığınları alabilmesi için floresan mikroskoplar gibi bir konfokal mikroskop ya da karşılaştırılabilir bir teknik analiz etmek için bir tekniktir. Ayrıca bu tür bir analiz son derece zaman alıcı.
Burada flow sitometri ile daha sonra analiz için, örneğin 3D-iskeleler hücreleri serbest bırakmak için bir yöntem göstermektedir. Bu protokol ReNcell VM hücre hattı insan nöral progenitör hücrelerin (hNPCs) (Millipore ABD) kültür ve laminin (PML) ile desteklenmiş PuraMatrix (PM) veya PuraMatrix oluşan 3D-iskeleler ayırt. Bizim ellerde% 0.25 ve PM konsantrasyon ancak konsantrasyonu diğer hücre türlerine adapte olabilir. 12 hücreleri 13 ekimi için en uygun, serbest hücreler flow sitometri örneğin immünositokimyasal çalışmaları için kullanılan ve daha sonra analiz edilebilir . Analiz ve mo hızlandırırverilerin güvenilirliğini geliştirmek, daha geniş bir taban üzerine, elde edilen veri geri kalanı bitti.
Protocol
1. Bölüm 1: PuraMatrix içinde hNPCs Kültür
- Laminin biri olmadan% 0.25 PuraMatrix konsantrasyon ile bir iskele nesil öncesinde aşağıdaki çözümleri hazırlamak için gereken
- % 20 sakaroz ve steril distile su içinde çözünmüş% 10 sakaroz içeren bir çözüm içeren bir solüsyon hazırlanır.
- 120 ul, 1.5 ml konik tüp distile su ile% 20 sakaroz çözeltisini çözüm 1 mix 120 ul.
- 1,5 ml konik tüp% 20 sakaroz çözeltisini 60 ul PuraMatrix çözüm çözümü 2 mix 60 ul.
% 0.25, aşağıdaki çözümleri hazırlamak için laminin (100 ul Matrix başına 8 mikrogram) bir ihtiyacı ile desteklenmiş bir PuraMatrix konsantrasyon ile bir iskele Hazırlanması için.
- 120 ul% 20 sükroz çözeltisi ve 1.5 ml konik tüp içinde 48 ul laminin ile distile su solüsyonu 1 mix 72 ul.
- Çözüm 2 karışımı 1.5 ml konik tüp içinde% 20 sakaroz çözeltisini 60 ul ile 60 ul PuraMatrix çözüm.
- PuraMatrix hücrelerin gömme, 4-iyi bir hücre kültürü plakası hazırlamak ve steril bir cam kapak kayma (çap 13 mm) iki kuyu yeri için. Daha sonra kullanmak üzere temiz tezgah plaka saklayın. Cam kapak fişleri sadece immünositokimyasal çalışmaları için kullanılmaktadır. Immünositokimyasal renklendirmeler amaçlanan ise, adım atlanabilir.
3D iskeleleri bir kapsülleme hNPCs hazırlamak için aşağıdaki çözümleri hazırlamak zorundadır. Seyreltme faktörü 1:10.000 kullanarak, tripsin / EDTA çözeltisi Benzonase sulandırınız. Trypsin-Inhibitor/Benzonase bir çözüm karışımı için: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl +% 1 HSA + tripsin inhibitörü (0.5mg/ml).
- Bir kuluçka 5 dakika (37 ° C,% 5 CO 2) 500 ul tripsin / Benzonase çözüm ve inkübe ekleyerek hücreleri Ayır. Trypsin-Inhibitor/Benzonase çözeltisi ile reaksiyonu durdurun. Daha sonra 5 dakika boyunca 3000 x g. müstakil hücreler santrifüj 5 ml% 10 Sakkaroz çözüm hücreleri yıkayın ve tekrar santrifüj. Süpernatantı atın.
- % 10 sakaroz çözeltisini hücrelerin yeniden süspanse edin, son hücre çözümü 1x10 6 hücre / ml içermelidir.
Bir sonraki adım, 1.8 1.11, çünkü hücreler için zararlı olabilir PuraMatrix çözüm, düşük pH, mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapılabilir olmalıdır.
- Çözüm 1 ile hücre süspansiyonu 60 ul karıştırın.
- Çözüm 1, 120 ul çözüm 2 ile konik tüp hücreleri içeren ve iyice karıştırın.
- Hemen her kapağı karışımı Yeri 100 ul 4 plaka ikamet sığar.
- Yavaş yavaş 200 ul hücre kültür ortamı için iyi ve 2-3 dakika sonra başka bir 200 ul ekleyin. Bu matrisin öz-montaj başlatacaktır.
- Inkübe c37 ° arşın ° C, ısıtma plakası veya ısıtılmış temiz tezgah alanı temiz tezgah 1s. Bu matrisler montajı zarar verebileceği için mümkün olduğunca plakasını hareket etmiyor.
- Çoğu orta çıkarın ama hepsini değil, matrisler 1000 ul pipet, kuru düşmesini önlemek için. 10 dakika matrisler yıkamak için orta 500 ul ekleyin. Sonunda orta kaldırmak ve 500 ul taze orta ekleyin ve bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2) kültür plakası yerleştirin. Matrisler plakalar ayrı bir inkübatör, mümkünse, daha az mümkün olduğu kadar hareket ve saklanan olmalıdır şok duyarlıdır.
- Burada kullanılan hNPCs 3D-iskeleler 7 gün boyunca çoğaldı ve farklılaşma, büyüme faktörleri 13 geri çekilmesi tarafından başlatılmıştır . Orta 2-3 günde bir değiştirildi.
2. Bölüm 2: tüm matrisler İmmünositokimyasal boyama
- Boyama işlemi öncesinde gerekli hazırlıkları yapması gerekmektedir: ab% 5 normal keçi serumu ve% 0.3 Triton X-100, 0.1 M PBS göre% 4 paraformaldehid çözüm PBS içinde çözünmüş ve 4 ile bir çözüm ',6-Diamidin-2' phenylindoldihydrochlorid gerekirse (oluşan tampon çözelti kilitleme DAPI) PBS içinde çözünmüş 100 ng DAPI / ml içeren bir çekirdeklerinin boyanma. Örnekleri Mowiol ve DABCO bir karışımı ile monte edilmiştir.
- Matrisler 1000 ul pipet ile orta kaldırmak ve 5 dakika boyunca bir kez PBS ile iskeleler yıkama yıkamak için.
- PBS iskeleleri kaldırmak ve her kuyuya 400 ul paraformaldehid (0,1 M PBS içinde% 4) ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında matrisler inkübe düzeltmek için. Sabit Yapı iskeleleri, birkaç hafta ile birkaç ay için% 0,02 NaN 3, 4 ° C ile desteklenmiş PBS içinde saklanabilir .
- Iskeleleri bir boyama öncesinde 5 dakika PBS ile yıkayın.
- Tampon çözelti engelleme iskeleleri inkübe edin. Engelleme çözüm her üç kez 2-3 saat ve subsequ değiştirildikardiak defekt, iskeleler, 4 gece boyunca bloke çözüm inkübe edildi ° C
- Engelleme tampon çözelti çıkarın ve% 1 normal keçi serumu ile takviye PBS içinde çözünmüş primer antikor ekleyin ve 4 gece boyunca matrisler inkübe ° C
- Birincil antikor çözümü çıkarın ve yıkama 4 4 2 saat boyunca bir kez ve daha sonra gece boyunca iskele ° C PBS ile.
- PBS çıkarın ve PBS içinde çözünmüş ikincil antikor ile çözüm ekleyebilir, karanlıkta, oda sıcaklığında 4 saat boyunca,% 1 normal keçi serumu ile desteklenmiş.
- Örnekleri 1 saat, 4 gece boyunca ve daha sonra ° C karanlıkta PBS 4-6 kez yıkayın.
- Çekirdeklerin boyama için bir, 30 dakika için DAPI çözüm 400 ul ekleyebilirsiniz.
- Bir mikroskop lamı ihtiyacı örnekleri monte etmek için. Mikroskop lamı 50 ul Mowiol / Dabco ekleyin. 4-plaka kapağını fişleri montaj orta dikkatlice çıkarın ve onları koymak.
- Burada Biozero 8000mikroskobu (Keyence, Almanya, Karlsruhe) tek mikrograflar ve z-yığınları elde etmek. Her bir yığın 1-2 mm mesafe ile 30 tek resimleri içerir. Ilgili analizörü yazılımı kullanarak floresan doğasında bulanıklık z yığınları üretildi tam projeksiyonları önce kaldırıldı.
3. Bölüm 3: flow sitometri analizi için iskeleler hNPCs Release
- Iskeleler hücreleri serbest bırakılması öncesinde 500 ul HBSS iskeleleri yıkayın.
- Hücre kültür ortamı içeren 15 ml konik boru 1000 ul pipet yardımıyla iskeleleri aktarın.
- 1000 ul pipet ile iskeleler bozmak için mekanik hücre çözümü birkaç kez tekrar süspansiyon ve daha sonra 5 dakika boyunca 3000 xg çözüm santrifüj.
- Bir pipet yardımıyla süpernatantı 500 ul, tripsin / Benzonase çözüm ekleyin ve hücre pelletini birkaç kez tekrar süspansiyon haline getirin.
- 5 dakika boyunca hücreler inkübe37 ° C tripsin / Benzonase çözüm. Reaksiyon, 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase çözeltisi ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipet ve durdurmak için.
- Hücre süspansiyonu 3000 xg'de 5 dakika santrifüj, süpernatantı kaldırmak ve hücreleri 2 ml HBSS tamponu ile yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Bu işlem matris pislikleri temizleyin.
- Pass hücre süspansiyonu çözümü çukur, agrega kaldırmak ve hücre kültürü ortamında hücreleri toplamak için bir hücre süzgeç (gözenek büyüklüğü 70 mikron). Elde edilen hücrelerin tekrar yama kelepçe veya fluometric ölçümleri gibi fonksiyonel çalışmalar için kapak bordroları gibi seribaşı olabilir. Flow sitometri hücreleri işlemek için, (4.1) hücrelerin hemen düzeltmek.
4. Bölüm 4: flow sitometri βIII-tubulin pozitif hücrelerin Niceleme
- Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 1 PFA adım 3.7 'de elde edilen serbest hücreleri sabitleyin.
- 5 dakika boyunca 3000 xg ve remov hücre süspansiyonu Santrifüje süpernatant. Gerekirse, hücreler, daha sonra analiz için 4 ° C de saklanır etmeye hazır olabilir. Bu nedenle tekrar süspansiyon hücreleri yıkama tamponu (PBS,% 0.5 BSA ve% 0.02 Na-azid ile desteklenmiş).
- Flow sitometri hazırlık ile devam etmek için, 350 xg'de hücre süspansiyonu 10 dakika santrifüj süpernatantı atmak ve antikor çözüm 25 ul hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Bu nedenle ilk antikor konsantrasyonu 1:100 örneğin βIII-tubulin saponin tamponu ile karıştırılır. Saponin tampon,% 0,5 saponin konsantrasyon, BSA konsantrasyonu% 0.5 ve% 0.02 Na-azid konsantrasyon ile PBS oluşur.
- Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 2 saat süreyle ilk antikor hücre süspansiyonu ile inkübe edin. Negatif kontrol olarak ilk antikor olmayan bir örnek hazırlayın.
- Ilk çamaşır adım için hücrelere doğrudan 300 ul saponin tampon ekleyin. 5 dakika boyunca 350 x g. hücre süspansiyonu Santrifüj Ikinci yıkama adım atın.süpernatantı, 300 ul tampon ekleyin ve 5 dakika boyunca 350 x g. hücre süspansiyonu santrifüj
- Süpernatantı ve ikincil antikor içeren (örneğin, Alexa Fluor 647, 1:1000, saponin tampon içinde çözünmüş) 25 ul çözüm ekleyin. Hücreler karanlıkta oda sıcaklığında, ikincil antikor 1s ile inkübe edin.
- Ilk çamaşır adım için hücrelere doğrudan 300 ul saponin tampon ekleyin. 5 dakika boyunca 350 x g. hücre süspansiyonu Santrifüj Ikinci yıkama adım için, süpernatantı atmak, 300 ul tampon ekleyin ve 5 dakika boyunca 350 x g. hücre süspansiyonu santrifüj
- Süpernatantı atın ve hücreler flow sitometri analizi için 500 ul yıkama tamponu tekrar süspansiyon.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Kendinden montaj hidrojel iskele PuraMatrix kültür hNPCs bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. HNPCs değiştirilmemiş PM sferik gibi yapılar büyür. Bu kültür durumdalar, hücreler küreler arasındaki süreçleri demetleri (Şekil 1A) görünür olmasına rağmen pek bir iletim ışık kabul edilebilir. Kullanılan hücre tipi kültür koşullarına bağlı olarak, matris laminin ekleyerek örneğin değiştirilmiş olabilir. HNPC hücre hattı için ReNcell VM (Millipore) laminin, daha az yoğun agrega ile bir büyüme modeli ancak hücrelerin daha homojen bir dağılım (Şekil 1B) ikna etmek için gereklidir. Bağımsız değişiklikler, matris, örneğin nöronal farklılaşma çalışma kullanılabilir. Şekil 1C, nöronal belirteç βIII-tubulin hNPCs boyama sunar. Bu örnekte matris 7 gün süreyle yetiştirilen hücreler ve daha sonra 4 gün, farklılaşma, büyüme faktörleri EGF ve bFGF. 13 Hücre organları çekilmesi ve hücreler tarafından inşa süreçleri yoğun bir ağ ile indüklenen ayırt edilebilir kolayca tanınır. Ancak, hücre sayısının belirlenmesi büyük bir sayı olarak, zaman alıcı olduğu açıktırmatris farklı bölgelerinde resimleri istatistiksel analiz için güvenilir bir veri tabanı elde etmek için, analiz edilecek. Incir 1D bir matris serbest ve daha sonra kapak bordroları platted hücrelerinin bir örnek görebilirsiniz. Bu hücreler fonksiyonel çalışmalar için kullanılmış olabilir.
3D-iskeleler hücrelerin serbest protein işaretleyicileri ifade veya AnnexinV / PI boyama veya TUNEL assay hücrelerin hayatta kalma oranı gibi farklı parametreleri analiz etmek imkanı sunar. Şekil 2 βIII-tubulin + hücrelerin yüzdesi bir akış sitometri analizi bir örnek gösterir. Şekil 2A negatif kontrol (hücreler βIII-tubulin için işaretlenmemiş) gösterilir. Bu kontroller βIII-tubulin + hücreler daha sonra algılama (şekil 2B) kapısı belirlemek için kullanılır. Bir hücre manuel sayım ve flow sitometri analizi bir karşılaştırma Şekil 2C gösterilmiştir. ΒIII-tubulin + hücrelerinin yüzde determtoplam hücre sayısı (nükleer DAPI boyama yoluyla) ve floresan resimler βIII-tubulin + hücrelerinin sayısı sayarak incelendiği.
Şekil 1. hNPCs kendinden montaj peptid hidrojel PuraMatrix kültüre küre çapı birkaç yüz mikron kadar olabilir PuraMatrix kapsüllenmiş) hNPCs (PM), sferik, yoğun paketlenmiş yapıları büyür. Küreler arasındaki tek hücreleri (oklar) tarafından inşa süreçlerinin demetleri tanıyabilirsiniz. B) PuraMatrix kapsüllenmiş Hücreler laminin (PML), daha homojen dağıtılmış, daha az yoğun yapılarda büyüme ile desteklenmiştir. Matris tek tek hücreleri (oklar) daha az yoğun alanlarda tanıyabilirsiniz desteklenmiş laminin, ancak bu hücrelerin sayısını ölçmek için pek mümkündür. C) hNPCs βIII-tubulin (yeşil) gibi PML ifade nöronal belirteç 4 gün farklılaşmış. Değerlendirilmesinde içinte bir DAPI (mavi) gibi bir çekirdekleri boyama ile total hücre sayısını belirlemek için pozitif hücrelerin yüzdesi. Microphotograph Biozero-8000 mikroskop ile çekilen resimleri z-yığınının tam bir izdüşümü sunmaktadır. D) matrisi salınan hücreler daha fazla fonksiyonel çalışmalar örneğin kapak bordroları numaralı seribaşı olabilir. Microphotograph 3d için kültür hücreleri daha sonra serbest bırakma işlemleri gösterir. ΒIII-tubulin için boyama (kırmızı) 3D iskele barındırılan hücrelere karşılaştırılabilir bir morfoloji ortaya koymaktadır.
Şekil 2. Flow sitometri analizi hücreleri PuraMatrix yayımladı. PuraMatrix flow sitometri ile daha hızlı analiz erişim sağlayan kültür hücreleri serbest bırakmak için bir protokol microphotographs zaman alıcı kantifikasyon üstesinden gelmek için . A) lekesiz hücreler daha sonra analiz için kapı (siyah çerçeve) ayarlamak için, negatif kontrol olarak kullanılmıştır.örneğin βIII tubulin hücreleri. B) negatif kontrol, aynı kapı, kullanılan βIII-tubulin + hücrelerinin yüzdesini ölçmek için. Pozitif hücreler aynı zamanda bir ara nüfus gözlendi x-ekseni, (noktalı çerçeve), büyük olasılıkla temsil eden hücre artıkları sağ parçası olarak görünür. C), flow sitometri ile sayılan elle sayılır hücre ve hücreler karşılaştırılması βIII-tubulin sayısının zaman bağımlılığı + flow sitometri protokol güvenilirliğini gösteren, karşılaştırılabilir pozitif hücreler çok daha yüksek oranda saptandı .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D iskele kullanımı, daha yakın bir hücre kültürü durum in vivo durumun farklı hücre tiplerinin geliştirilmesi çalışma fırsatı sunuyor . Ancak, örneğin nöronal farklılaşma ya da bir hücre tipleri örneğin ölçümü için güvenilir bir veri elde etmek için bazı engelleri aşmak için fonksiyonel çalışmalar analizi ile ilgili.
Burada peptid hidrojel tabanlı iskele PuraMatrix ve FACS veya fonksiyonel testleri gibi araçlara kolay erişim sağlayan bir 2D durum çalışmaları için kullanılmak üzere hücrelerin daha sonra serbest hNPCs kültür nitelendirdi. Yakın zamanda, atomik kuvvet mikroskobu ve hayatta kalma ve hücrelerin farklılaşması etkisi 3D-iskele oluşumu PuraMatrix konsantrasyon etkisi gösterilmiştir. [13] Ancak, her bir hücre tipi, farklı bir kültürü gerekebilir akılda tutmak zorunda diğer malzemeler oluşan koşullar ya da matrisler matrig örneğinEl veya kollajen.
18 üretici tarafından sağlanan bir protokol dayalı ve hücreleri serbest bırakmak için protokol hücrelerin mekanik bir izolasyon, bir sindirim enzimleri tarafından malzeme çevreleyen tarafından takip örneğin birincil nöronal kültürlerin hazırlamak için kullanılan protokolleri ile karşılaştırılabilir . Hücreler bu yordamı tahammül ve hayati ve süreçleri inşa kalmak ve bir kez onlar laminin kaplı bir yüzeye tekrar numaralı seribaşı βIII tubulin gibi nöronal belirteç ifade. Burada βIII-tubulin + hücre miktarını ölçmek için serbest hücreler flow sitometri çalışma yapılmamıştır. Mikrograflar hücrelerin sayarak "elle" yapılan bir niceliği karşılaştırma βIII-tubulin + hücreler çok daha yüksek oranda saptandı. Bu manuel analizine göre akış sitometresi (prob ortalama 50.000) (prob ortalama birkaç yüz) tarafından sayılan hücrelerin daha fazla sayıda nedeniyle büyük olasılıkla. Ancak, & b sayısı kinetiğieta; III-tubulin + hücreler, zaman içinde βIII-tubulin + hücreler bir azalma tespit her iki numunenin de aynı model, takip eder . Bu çalışmalar ReNcell VM hücreleri kullanarak doğrultusunda 15-17 Diğer engelli manuel analizi sırasında üstesinden gelmek için pek analiz edilebilir matrisler veya "gerçek" bir küçümsenmesi sonucu matris malzemesi yüksek arka plan çok yoğun alanlarda hücre sayısı. Biz bu protokolü, hücrelerin çoğalması, farklılaşması veya hayatta kalma çeşitli yönlerini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem sağlayan diğer hücre türlerine adapte edilebilir eminiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Norman Krüger onun mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
References
- Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
- Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
- Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
- Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
- Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
- Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
- Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
- Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
- Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
- Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
- Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
- Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).
- Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
- Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
- Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
- PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, BD. (2006).
