Summary
في هذه المقالة، علينا أن نبرهن فحوصات لدراسة nociception الحرارية في
Abstract
في هذه المقالة، علينا أن نبرهن فحوصات لدراسة nociception الحرارية في يرقات ذبابة الفاكهة. واحد ينطوي على فحص التحفيز مكانيا المقيد (المحلية) من 1،2 nociceptors الحرارية في حين أن الثاني ينطوي على جملة (عالمي) تفعيل معظم أو كل هذه الخلايا العصبية 3. معا، وهذه التقنيات تسمح التصور وتقدير من وظائف الخلايا العصبية السلوكية لذبابة الفاكهة الحسية nociceptive.
اليرقة ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي لدراسة تأسيس nociception الحرارية، واستجابة حسية لدرجات الحرارة يمكن أن تكون ضارة التي يتم حفظها عبر تطويريا 1،2 الأنواع. مزايا ذبابة الفاكهة لمثل هذه الدراسات هي البساطة النسبية لنظامها العصبي ومدى تطور التقنيات الجينية التي يمكن استخدامها لشرح الأساس الجزيئي للبيولوجيا الأساسية 4-6 في ذبابة الفاكهة، كما هو الحال في جميع metazoans، على رده للمؤثرات الحرارية الضارة عموما ينطوي على "nocifensive" انسحاب مكره على التحفيز قدم 7. يتم الكشف عن مثل هذه المحفزات من خلال نهايات عصبية حرة أو nociceptors والسعة للاستجابة العضوي يعتمد على عدد من nociceptors تلقي الحوافز الضارة 8. في ذبابة الفاكهة، فإن الخلايا العصبية الجذعية الرابع تشجر فئة الحسية التي تكشف عن المنبهات الضارة الحرارية والميكانيكية 9 في إضافة إلى دورها اكتشفت مؤخرا كما مبصرات 10. هذه الخلايا العصبية، والتي تم دراستها بشكل جيد للغاية على الصعيد التنموي، arborize على ورقة حاجز البشرة، وإجراء اتصالات مع جميع خلايا البشرة 11،12 تقريبا. محور عصبي واحد من كل فئة مشاريع الخلايا العصبية في النخاع الرابع الاعصاب الاماميه من الجهاز العصبي المركزي 11 حيث قد وصل إلى الدرجة الثانية الخلايا العصبية التي المشروع الى الدماغ.
في ظل ظروف خط الأساس، والاعصاب الحسية nociceptiveوسوف يتم إطلاق نطاق حتى يتم التوصل إلى عتبة مرتفعة نسبيا. والمقايسات وصفها هنا السماح للمحقق لقياس الاستجابات السلوكية أو خط الأساس، ويفترض،. توعية تستتبعه التالية تلف الأنسجة كل فحص يثير متميزة ولكنها ذات صلة الاستجابات السلوكية locomotory للمؤثرات الحرارية الضارة ويسمح الباحث إلى تصور وقياس مختلف جوانب nociception الحرارية في يرقات ذبابة الفاكهة. يمكن تطبيق فحوصات على اليرقات من المورثات المطلوب أو إلى اليرقات التي أثيرت في ظل الظروف البيئية المختلفة التي قد تؤثر على nociception. منذ يتم حفظها nociception الحراري عبر الأنواع، فإن النتائج المستقاة من تشريح الجيني في ذبابة الفاكهة إبلاغ المرجح فهمنا للnociception الحرارية في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الفقاريات.
Protocol
ويرد مخطط نموذجي من الخطوات التجريبية لإعداد اليرقات العادية أو الأشعة فوق البنفسجية توعية من أجل فحوصات 2 nociception الحرارية في الشكل 1.
1. إعداد يرقات
- ويمكن اختبار من الذكور والإناث يرقات ذرية من النمط الجيني المطلوب مباشرة. بدلا من ذلك، يمكن تعيين عرضية الوراثية حتى الحصول على يرقات ذرية من النمط الجيني محددة من الفائدة. إعداد الصلبان في زجاجات تحتوي على المواد الغذائية الطاير باستخدام 20-30 الإناث والذكور العذراء 15-20.
- بعد 5 أيام البيض وضع، موسم الحصاد ونظيفة في وقت مبكر يرقات العمر الثالث من غرف الطعام ذبابة طري واجهاد بلطف مع المياه الجارية من خلال ميكرون 630 (حجم المسام) شبكة. نقل في وقت مبكر يرقات العمر الثالث (~ مم 3-4 في طول على طول المحور الأمامي الخلفي) على لوحة رطبة صغيرة من الطعام لمنع المجاعة وأصاب. إذا توعية nociceptive هو لفحصها، اتبع الخطوات اللاحقة 2،1-2،11. إذا كانت ليرقات يتم اختبارها في absenc(ه) من تلف الأنسجة، والانتقال مباشرة إلى الخطوة 3.1.
2. التخدير بالأثير والأشعة فوق البنفسجية
- بناء دائرة التخدير بالأثير.
- قطع الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- مع ملعقة معدنية ساخنة تذوب حافة قطع من أنبوب microcentrifuge.
- اللاحقه بشبكة غرامة على سطح أنبوب ذاب والسماح لتبرد. وأضاف أن الغرفة التخدير بالأثير السماح بدخول من أبخرة الأثير ولكن منع هروب اليرقات.
- استخدام ملقط أو فرشاة الطلاء لوضع بلطف 10 في وقت مبكر يرقات العمر 3 داخل غرفة التخدير بالأثير محلية الصنع.
- اليرقات مكان على طول الجزء الداخلي من الغطاء وثيق.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الخطوتين التاليتين في غطاء الدخان والأثير هو مادة كيميائية متفجرة والأبخرة لها يمكن تخدير من حقوق الإنسان، فضلا عن يرقة 1.
- وضع غرفة التخدير بالأثير تحتوي على اليرقات داخل جرة تحتوي على Coplin دورق 10 مل يحملالقطن الكرة غارقة مع 1.5 مل من ايثر ~.
- المسمار على الغطاء من جرة Coplin لفضح اليرقات إلى أبخرة الأثير لمدة 2 إلى 2.5 دقيقة. لاحظ أن أوقات أطول التخدير بالأثير قد يؤثر سلبا على سلوك اليرقات أو البقاء على قيد الحياة.
- بعد التخدير بالأثير، وإزالة غرفة التخدير بالأثير من Coplin جرة / كوب، وإعطاء بضع ثوان في غطاء محرك السيارة لأبخرة الأثير لتبدد. قد تحرك الآن من غطاء المحرك إلى المختبر.
- استخدام زجاجة بخ الماء لشطف بلطف اليرقات من غرفة التخدير بالأثير في طبق بيتري الصغيرة.
- استخدام ملقط وKimwipe ألف لطخة تخدير اليرقات الجافة ويضعوا لهم بلطف الجانب الظهري حتى على شريط لاصق شفاف من الوجهين مثبتة على 3 "س 1" شريحة ميكروسكوب زجاجية.
- وضع الشريحة على السطح السفلي من غرفة للاشعة فوق البنفسجية وفضح اليرقات للأشعة فوق البنفسجية لمدة 6 ثوان في 20 إم جي / سم 2 كثافة.
- تزج الشريحة في المياه لتعويم بلطف اليرقات الخروج من scotc على الوجهينح الشريط.
- استخدام ملقط أو الفرشاة بلطف لوضع اليرقات المشع في 15 × 45 ملم قارورة الدرهم ثقافة واحدة تحتوي على زجاج ~ 1.0 مل من المواد الغذائية ذبابة حيث يمكن استرداد لفترة من الزمن المتغير (8 -24 ساعة) عند 25 درجة مئوية أو غيرها من درجة الحرارة المطلوبة قبل الحصاد ثقافة إعادة لفحوصات nociception الحرارية.
3. محلي الفحص مسبار حراري
نحن تقديم الحوافز الضارة الحرارية لشريحة هيئة اليرقات الفردية باستخدام مسبار مبنية خصيصا الحرارية المصنعة من قبل ديف الموالية للهندسة (انظر الجدول المواد). على الرغم من أن هذا التحقيق لديها ميزات أفضل تصميم (تلميح معدنية صغيرة من 0.07 ~ منطقة 2 مم والقدرة على المحافظة على درجة حرارة نقطة على وجه التحديد مجموعة من 23 درجة مئوية إلى 65 درجة مئوية) من حيث المبدأ أي أداة مع طرف الصغيرة التي يمكن أن تكون ساخنة وينبغي على درجة حرارة محددة لفترة تصل إلى 20 ثانية تكفي. ويستخدم تلميح التحقيق في وقت مبكر لتحفيز 3 يرقات العمر الثالث وعلى وجه التحديد على dorsaل خط الوسط في الجزء A4 البطن (انظر الشكل 2). واستجابة لهذا التحفيز الحراري، وسوف تظهر اليرقات عموما سلوك انسحاب مكره من قبل المتداول أفقيا 360 درجة أو أكثر. هذا السلوك يختلف عن استجابتها لمسة خفيفة على التحقيق الذي تجريه غرفة غير ضارة معدن درجة الحرارة التي تشتمل بصورة عامة توقف قصير في 13 نشاطهم locomotory.
بروتوكول لفحص حرارة التحقيق:
- والمطلوب قبل مجموعة درجة الحرارة من المسبار الحراري نقطة التحديد.
- استخدام الفرشاة أو ملقط لنقل بلطف 1 يرقة فرد في الصعود إلى منصة مسطحة (التي نستخدمها عادة قطعة صغيرة من قطع من الفينيل الموثق) الذي سيتم اليرقات حفزت لاحقا. يجب تغطية اليرقة بواسطة طبقة رقيقة من الماء قبل الاتصال مع المسبار الحراري. وينبغي أن الفيلم من المياه التي تغطي يرقة تكون أقل قدر ممكن، وتغطي تماما اليرقة، مع ضمان أن يرقة لم يجف عندما لمس الفينيل.
- اضغط بلطف تلميح التحقيق ضد يرقة في A4 قطعة الضغط الخفيف مع طرف في زاوية قدرها 45 درجة عن بين لجنة التحقيق وعلى سطح يرقة (انظر الشكل 2). ينبغي أن يؤدي إلى الضغط تسنن طفيف على السطح من اليرقة وعادة ما تكون كافية لمنع تحرك. إذا كان يرقة يواصل التحرك، والضغط أكثر قليلا، وسوف تتوقف عادة. لا تسجيل البيانات من اليرقات التي لا يمكن أن تتحرك أبعد من مجال الرؤية أو التي دائم الاتصال التحقيق حتى يمكن تحقيق استجابة أو قطع ال 20 ق.
- مواصلة تحفيز يرقة حتى يتم عرضها على رد انسحاب أو حتى يتم الوصول إلى قطع 20 ثانية، أيهما أسبق. الاستجابة اليرقات عادة تظهر لأول مرة سلوك أولي لرفع الرأس والذيل. وعادة ما يعقب ذلك من خلال سلوك الانسحاب من المتداول على الأقل 360 درجة. ويسجل سوى لفة كاملة 360 درجة كما سلوك nocifensive (في هيئة التعليم العالي الأوليةد أو رفع ذيل ليست).
- بمجرد أن يتم البدء في سلوك انسحاب الاتصال الإفراج مع التحقيق وتسجيل الكمون أو الوقت للانسحاب. إذا تم ملاحظة أي سلوك الانسحاب في غضون 20 ثانية، ثم اليرقة هو عدم الرد. ويمكن أن المستجيبين مقسمة الى مزيد من فئات 2. إذا يظهر سلوك الانسحاب في غضون 5 ثوان، ثم اليرقة هو سريع في الرد. إذا يظهر سلوك الانسحاب بين 5-20 ثانية، ثم اليرقة هو الرد بطيئة (انظر الشكل 1 في بابكوك، وآخرون. 2009) 1.
4. الحرارة العالمية الفحص بلايت
تم تصميم لوحة الفحص لقياس حرارة nociception الحرارية في يرقات ذبابة الفاكهة عندما يواجه حيوان كامل مع الحافز الحرارية الضارة. وضعت الفرد في منتصف 3 يرقات العمر الثالث في انخفاض 80 ميكرولتر من المياه على 60 × 15 مم طبق بيتري - انظر الشكل 3 لالتخطيطي والصور من مجموعة مقايسةيصل. ثم يتم وضع طبق بيتري على كتلة التدفئة الصلبة (المشار إليها باسم "لوحة الحرارة"). كما أن درجة الحرارة في ارتفاع قطرة ماء، يسلك يرقة سلسلة من خمسة السلوكيات النمطية نسميه ثراش رئيس، لفة، والسوط، والاستيلاء، والشلل. إذ أن هذه السلوكيات هي إلى حد ما وظيفة من درجة الحرارة setpoint من لوحة الحرارة وكمية المياه التي اليرقة مغمورة نقدم هنا ما وجدناه أن تكون الظروف المثلى (95 درجة مئوية حرارة لوحة، و 80 قطرة ميكرولتر من الماء) لمراقبة كل 5 من السلوكيات مع الحد الأدنى من التداخل بينهما.
بروتوكول لفحص لوحة الحرارة:
- وضع الألياف البصرية ضوء أدلة على ضمان عدم وجود اضاءة كافية التباين العالي للعرض اليرقة. استخدام يرقة اختبار إذا لزم الأمر. يجب أن يكون على ضوء قوة منخفضة لتفادي حرارة الجو المحيط على يرقة لفحصها.
- وضع حجر التدفئة في لوحة الحرارة مع سطح مستو أعلى ووضع لوحة على حرارةالمجهر قاعدة. بدوره على لوحة الحرارة إلى موقف "عالية"، والسماح حوالي 15 دقيقة لدرجة الحرارة لتحقيق الاستقرار، وضبط وفقا لذلك لتحقيق درجة حرارة سطح الأرض من 95 درجة مئوية.
- قياس 80 ميكروليتر من الماء المقطر ووضع قطرة ماء في منتصف 60 × 15 مم طبق بيتري البوليسترين مع micropipettor.
- استخدام ملقط لوضع بلطف نظيفة منتصف 3 يرقة الطور الثالث في وسط انخفاض المياه. في محاولة لنقل اليرقة مع حجم أدنى حد ممكن من المياه بحيث تراجع إلى أن يسخن يبقى أقرب ما يمكن إلى 80 ميكروليتر الأصلي.
- وضع بلطف طبق بتري تحتوي على قطرة الماء ويرقات على كتلة صلبة التدفئة على لوحة الحرارة. ضبط بسرعة مكان طبق وبالتالي فإن يرقة كامل وقطرة ماء في الرأي. انظر الشكل 3 ومقاطع الفيديو 1-6.
- بدء موقت في لحظة يتم وضع طبق بيتري على كتلة صلبة من التدفئة لوحة الحرارة وسجلالوقت من بداية كل سلوك. إذا رغبت، ويمكن أيضا أن تكون السلوكيات الفيديو المسجل - انظر الفيديو 1-5 للحصول على أمثلة ممثل عن كل سلوك. وكانت كاميرا لايكا قرار تم استخدام برنامج الإصدار 3.7 لتسجيل الأفلام، ووضع التسجيل كان "مستمر"، 3 ميغا بكسل (كنا 0.63x التكبير مع دقة وضوح الصورة التي هو محسوب 10 ميكرون / بكسل) وأطر / ثانية وكان 44.5.
5. ممثل النتائج
محلي الفحص الحرارة دقق:
بناء على اتصال مع لجنة التحقيق الحرارية، وهي يرقة يظهر عادة على السلوك الأولي من رفع رأسه وذيله. وعادة ما ينظر الى رفع الرأس أولا تليها رفع الذيل. بعد ثوان قليلة من هذا السلوك الأولي اليرقة وعادة ما يبدأ المتداول أفقيا التي نشير إليها باسم "سلوك انسحاب مكره". ربما يكون الوقت بعد الذي يظهر في سلوك الأولية أو سلوك انسحاب تختلف حسب درجة الحرارة أو جنرال الكتريكالمغنطيسية الخلفية. في دراستنا الأولية قمنا بقياس نسبة اليرقات واظهار مكره انسحاب في مختلف درجات الحرارة في تحقيق نقطة التحديد، ووجدت أن 48 درجة مئوية وادنى درجة الحرارة التي وردت جميع اليرقات بسرعة (<5 ق). هنا، ونحن التقرير أن هناك سقف للاستجابة nociception الحرارية اليرقات الشكل (4A). ويلاحظ المستجيبين 100٪ بسرعة تصل إلى درجة حرارة مسبار من 52 درجة مئوية. ومع ذلك، في 54 درجة مئوية والتعليم العالي، 90٪ أو أكثر من اليرقات لا تستجيب حتى بعد 20 S الاتصال. هذه اليرقات لا تزال تتحرك بعد قطع ال 20 ق.
كما لوحظ سابقا 1، يمكن رسم فئات من السلوك انسحاب في كل درجة الحرارة ومقارنتها إحصائيا. نظرا إلى أن هذا هو فحص السلوكية هناك بعض التباين من يرقة إلى يرقة وبين المستخدمين الفرديين. لتفسير هذا نقيس عادة 3 مجموعات من 30 يرقات لكل حالة اختبار. بالإضافة إلى تصنيف بسيط وايالكمون thdrawal أننا قد ذكرت سابقا، ونحن التقرير هنا أن يمكن أيضا أن السعة (عدد لفات أو الوقت الذي يقضيه في سلوك انسحاب مكره) يمكن قياسها (انظر الشكل 4). من المستغرب، يبدو أن هناك علاقة عكسية بين درجة الحرارة المدخلات والشدة في استجابة لانخفاض درجات الحرارة ويبدو أن تثير عددا أكبر من لفات (الشكل 4B) وأكثر من الوقت الذي يقضيه في انسحاب مكره (لا تظهر البيانات). قد يشير هذا إلى أن مدة التعرض لدرجة الحرارة ضارة قد تكون العامل الرئيسي الذي يحدد من قوة.
حرارة اللوحة الفحص:
ويلاحظ وخمسة السلوكيات النمطية locomotory على نقل اليرقة مغمورة في الماء إلى لوحة الحرارة. يتم وصف هذه أدناه، ويظهر في الفيديو مع سلوك locomotory نموذجي ليرقة غير مدفأة في الماء. وسيتم عرض متوسط في الاختفاء التي لوحظت هذه السلوكيات في الشكل (5)A، كما هي قطرة ماء متوسط درجات الحرارة تقاس كل كمون. في ظل الظروف المثلى فحص المقدمة هنا وتراوحت نسبة اليرقات تظهر كل سلوك متميز 77-100٪ (الشكل 5B) على الرغم من أن بعض الأحيان يتم حذف السلوكيات المتداول والجلد، والتداخل، أو تحدث في ترتيب عكسي. السلوكيات لوحظ، في الترتيب الزمني، وصفها على النحو التالي، ويمكن أن يشاهد في الفيديو في الأوقات المبينة أدناه:
- حركة طبيعية في غياب الحرارة: تحرك تحوي يرافقه تبحث حركات الرأس. انظر الفيديو من 6:27.
- ثراش رئيس: التحركات اليرقة يتوجه بسرعة في حركة إلى الأمام أو الجانبي. هذا الاقتراح هو مماثل لتحرك بشكل طبيعي في الماء (انظر الفيديو 1) ولكنه يحدث أكثر بتقفز ومثابرة. انظر الفيديو من 6:40.
- لفة: اليرقة تتحرك أفقيا ما لا يقل عن 360 درجة كاملة. انظر الفيديو من 6:50. وهذا يمكن أن يحدثعدد متغير من مرة، وأحيانا ينطوي على القوائم غير مكتملة. لأغراض بتسجيله سلوك نعتمد فقط لفات كاملة 360 درجة. هذا السلوك هو الأكثر مماثلة لتلك التي شهدت مع التطبيق المحلي للمسبار الحرارة.
- سوط: اليرقة المعارض السريع الانكماش الافراج عن تحركات على طول المحور الأمامي الخلفي الذي جعل رئيس لفترة وجيزة جدا على مقربة من ذيل. انظر الفيديو من 7:11. ويلاحظ في كثير من الأحيان الجلد في تعاقب سريع على أو في نفس الوقت الذي المتداول.
- مصادرة: اليرقة وتمتد على طول محور الأمامي الخلفي وهي تظهر ارتفاع وتيرة كامل الجسم سلوك اهتزاز دون الانحناء. انظر الفيديو من 7:25.
- شلل: اليرقة توقف حركة. في بعض اليرقات وهذا هو دائم حين أن البعض الآخر يحمل بعد ذلك التردد المنخفض نبض الحركة. انظر الفيديو من 7:36.
هذه المعطيات تشير إلى أن درجة حرارة المياه وانخفاض الكمون وإلى بداية شار 5ترتبط بشدة السلوكيات acteristic لوحظ عند التسخين العالمي للانخفاض يرقة / المياه.
الشكل 1. الخطوط العريضة للخطوات تجريبية لإعداد والفحص من اليرقات. قبل يعاير nociception مع التحقيق حرارة أو لوحة الحرارة، ويتم حصاد اليرقات مستمدة من مخزون معين أو عبر الوراثية وتنظيفها من المواد الغذائية. إذا توعية nociceptive (على العكس من nociception خط الأساس) هو على أن يقسم، ويعقب الحصاد بواسطة التخدير بالأثير (التعرض لالأثير)، تصاعد مستمر، والأشعة فوق البنفسجية، وفترة الاسترداد على الغذاء ذبابة. وتتعرض ثم اليرقات التي تحصد أو استردادها لدرجات حرارة الاختبار الضارة إما باستخدام مسبار الحرارة (المحلي) أو لوحة الحرارة (العالمي) فحص. تشير الأرقام إلى مقاطع من نص الأساليب التي تصف الخطوة (ق) هو مبين.
الارقام ..ه 2. مجموعة تجريبية للحصول على فحص حرارة المحلية التحقيق. يتم التحكم في الحرارة عن طريق تحقيق وحدة التحكم الحراري والذي يستخدم لوضع والحفاظ على درجة الحرارة من المسبار. يقام التحقيق عمودي على محور الأمامي الخلفي وتستخدم لتحفيز يرقة بزاوية 45 درجة على الأفقي. يتم تحقيق الاتصال على وجه التحديد A4 قطعة كما هو موضح في البطن. يجب على المستخدم الحفاظ على هذا الاتصال مع ضغط لطيف حتى على قطع 20 ثانية أو حتى سلوك المتداول تبدأ. إذا ما نظر في درجة الحرارة والضارة، فإن اليرقة تظهر سلوك انسحاب مكره تتميز لفة واحدة على الأقل 360 درجة. يمكن لعدد من لفات تكون مفردة أو متعددة (انظر الشكل 4B).
الشكل 3. التجريبية انشاء لفحص لوحة الحرارة. (A) كارتون من وجهة نظر الأفقي لل60 × 15 مم طبق بتري تحتوي على واحد في منتصف 3 الثالثة فييرقة نجم في قطرة ماء ميكرولتر 80. (ب) وضعت الكرتون من وجهة نظر العلوي من يرقة في وسط انخفاض المياه ينظر من خلال المجهر. (ج) من تصوير نظرة أفقية من محطة العمل لهذا الفحص. (D) صورة لليرقة ينظر إليها على أنها من خلال المجهر.
الشكل 4. الكمي للاستجابة السلوكية باستخدام مقايسة مسبار الحرارة. (A) قطعة في المئة من المستجيبين الذين ينتمون إلى كل فئة (سريع، بطيء، وغير المستجيبين) مقابل درجة الحرارة. (ب) قطعة من الكمون إلى سلوك الانسحاب مكره مقابل عدد لفات كل يرقة عرضت في أربع درجات حرارة مختلفة من الإيذاء اختبار زيادة (42 درجة مئوية و 44 درجة مئوية و 46 درجة مئوية و 48 درجة مئوية و 50 درجة مئوية، و 52 درجة مئوية).
الشكل 5. حرارة فحص اللوحة: الكمون ودرجة الحرارة بيه مقابلavior. (A) الكمون ومتوسط درجة الحرارة قطرة ماء على كل ردة الفعل السلوكية في ظل ظروف مثلى من 95 درجة مئوية (درجة حرارة سطح صفيحة ساخنة) و 80 قطرة ميكرولتر من المياه (ن = 150). لاحظ أن يحتفل كل سلوك ضمن فترة زمنية معينة. تم قياس درجات الحرارة في الانخفاض المياه باستخدام الحرارية إدراجها في الأعلى أو الأسفل للانخفاض (ن = 10 قطرات لكل موقع)، وهذه القياسات وبلغ متوسط. (ب) النسبة المئوية لليرقات واظهار كل ردة الفعل السلوكية في ظل ظروف الفحص الأمثل. ويلاحظ وسحق ومصادرة، وشلل ما يقرب من 100٪ من الوقت في حين المتداول والجلد ويلاحظ 77 و 80٪ من الوقت، على التوالي. في أدنى درجة حرارة سطح استيلاء مجموعة نقاط والشلل لا تراعى في حدود 200 ق، وعلى نقاط أعلى مجموعة المتداول والجلد ويمكن أن تخطي أو قد تحدث في وقت واحد. ن = 150. (ج) النسبة المئوية من اليرقات التي تعيش بدء التالية للسلوك الشلل. وزادت سخونة اليرقات حتى تكونشلل حلج ثم إزالة لظروف ثقافة معيار لاسترداد. استقبل وهمية المعالجة يرقات معاملة أي ما يعادل باستثناء التعرض للحرارة. وتم قياس كمية تشكيل الكبار الشرانق وقابلة للحياة في أيام 7-13. ن = 120.
الشكل 6. التعطيل من الخلايا العصبية الحسية اليرقات nociceptive يزيد الاختفاء استجابة سلوكية. مؤامرة من الكمون إلى كل سلوك لالمورثات المشار إليه: دبليو 1118، Gal4 109 (2) 80 = MD-Gal4 / +، UAS Ork1.Δ-C-/ +، UAS-Ork1.Δ-NC / +، MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C، وmd-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. MD-Gal4 التعبير محركات من UAS التنظيم الجينات المحورة في جميع الفئات الأربع من الخلايا العصبية الحسية multidendritic المحيطية، UAS-Ork1.Δ-C 14 يعبر عن نسخة معدلة من ذبابة الفاكهة مفتوحة مقوم قناة + K المطلوبة للانتقال متشابك، و U AS-NC-14 Ork1.Δ عن نسخة معدلة من مزيد من هذه القناة نفسها التي لا تتداخل مع انتقال متشابك. لاحظ أن اليرقات فقط تحمل كل من سائق MD-Gal4 (6) والجينات المحورة UAS-Ork1.Δ-C إظهار اختفاء زادت عن أربعة من السلوكيات 5 المرصودة (ثراش، لفة، ومصادرة، والشلل). لاحظ أيضا أنه نظرا لزيادة الكمون إلى المتداول هذه جلد الحيوانات قبل بدء التنفيذ. النجمة ترمز P <0.05 من قبل الطلاب لاختبار t. ن = 30 اليرقات في التركيب الوراثي.
تكميلية الفيديو 1. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
تكميلية فيديو 2. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
تكميلية فيديو 3."الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.
تكميلية فيديو 4. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
تكميلية 5 فيديو. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
تكميلية فيديو 6. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
Discussion
يمكن استخدام المقايسات وصفها هنا لنوعيا وكميا تقييم اليرقات من المورثات مختلفة للاستجابة للمؤثرات الحرارية الضارة. والسمة الرئيسية للحرارة فحص التحقيق هو أن يتم إعطاء الحوافز فقط في مكان واحد. وهذا يؤدي على الارجح لاطلاق النار من مجموعة فرعية صغيرة فقط من الصف الرابع منها الخلايا العصبية في الجزء اتصلت به لجنة التحقيق، وربما تلك الموجودة في قطاعات فورا المجاورة 11. بسبب تحفيز المحلية، وفحص مسبار الحرارة يحاكي تجربة مشتركة للكشف الحسي حافزا الضارة التي يتم ترجمتها إلى هيئة خاصة مثل المنطقة من ناحية الاتصال موقد ساخن. والعيب من الحرارة فحص التحقيق هو أن لديها بعض التقلبات المستخدم إلى المستخدم الذي يمكن من المحتمل أن يعزى إلى ثلاثة عوامل هي: ط) مع الضغط الذي ينطبق على المستخدم لجنة التحقيق إلى يرقة، والثاني) والموقع الدقيق للمسبار على يرقة نسبة إلى الخلايا العصبية في nociceptive الكامنة، والثالث) وانج دقيقةجنيه مصري في لجنة التحقيق التي اتصالات سطح يرقة.
ذكرنا سابقا استراتيجية كمية من اليرقات في تصنيف غير المستجيبين، المستجيبين بطيئة، والمستجيبين بسرعة على أساس الكمون انسحابها إلى درجة حرارة معينة 1. نحن هنا تقريرا عن استجابة اليرقات لدرجات حرارة أعلى من ذلك. ومن المثير للاهتمام، نجد أن هناك سقف للاستجابات اليرقات nociceptive الحرارية وأن هذا السقف تقع بين 52 و 54 درجة مئوية. قد يشير هذا إلى أن اليرقات لا تمتلك مستقبلات محتملة عابرة (الحزب) قادر على قناة المعزولة في درجات حرارة أعلى من 52 درجة مئوية. بدلا من ذلك، يمكن أن تشير إلى أن الخلايا العصبية أو العضلات المستخدمة لبدء أو تنفيذ استجابة محرك تتلف قبل أن يتمكنوا من أداء وظائفها حتى في انسحاب مكره. نحن التقرير أيضا تحليلا مختلفة من السعة للانسحاب من الاستجابة باستخدام عدد لفات كمؤشر على "متانة" للاستجابة. بسذاجة، واحدأتوقع أن هذه المعايير من شأنه أن يزيد مع زيادة درجة الحرارة أو وقت من التحفيز. من المستغرب أن نجد أن هذا ليس هو الحال. اليرقات حفز لفترة أطول في درجات حرارة منخفضة في نهاية نطاق الضارة (42 درجة مئوية) تظهر أكثر وأكثر لفات الوقت الذي يقضيه المتداول من اليرقات وبحث في ارتفاع درجات الحرارة (48-52 درجة مئوية). هذا يشير إلى أن درجة الحرارة داخل نافذة الضارة هو في المقام الأول على مدة التعرض الذي يحدد السعة للاستجابة. منذ اليرقات تتعرض لدرجات حرارة عالية الضارة (48-52 درجة مئوية) في المتوسط تستجيب بشكل سريع جدا، فهي لا تظهر كما فات العديد من اليرقات تتعرض لدرجة حرارة أقل الضارة لفترة أطول فترة من الوقت. تحليل مدى استجابة ذكرت هنا يضيف بعدا آخر على طول الكمية التي يمكن مقارنتها المورثات مختلفة أو التلاعب البيئية.
والسمة الرئيسية للحرارة لوحة الفحص هو أنه ينطوي على التعرض العالمي للالضارةالحرارة. على هذا النحو، هو أقرب إلى الحيوان يجلس في مرجل التدفئة من لمس موقد ساخن. على الرغم من أنه ليس واضحا عندما اليرقة قد تواجه حافزا الضارة على مستوى العالم في البرية، في المختبر الاستجابات السلوكية لهذا التعرض العالمية هي أكثر تعقيدا من تلك التي لوحظت على التحفيز المحلية. وقوة من الحرارة فحص لوحة، لاحظت أيضا من قبل الآخرين 3، هو أنه لا يملك الا القليل من قبل المستخدم إلى المستخدم تقلب منذ لمس يرقة ليست عنصرا من البروتوكول. الفرق الوحيد الكبير ويبدو أن في تحديد متى تبدأ كل سلوك ويمكن التقليل من هذا مع عرض المتكرر / ألفة. فرق مثيرة للاهتمام بين المقايسات هو في درجات الحرارة التي تبدأ السلوكيات مكره. وهذه هي أقل من ذلك بكثير في حرارة فحص لوحة من لجنة التحقيق مع الحرارة. قد يكون سلوك الأولية التي أظهرتها اليرقات اتصلت مع التحقيق الحرارة (رئيس ورفع الذيل) تكون متطابقة للرئيس الحالي لوحظ في ~ 27 درجة مئوية في حرارة بلاته فحص. فمن الممكن أن هذا الرد يعكس "عدم الراحة" أكثر من "الألم". نحن لم وحظ وجود ربط من الجلد، والاستيلاء، والشلل حتى في عالية (تصل إلى 48 درجة مئوية) قد تصل درجات الحرارة في حرارة الفحص والتحقيق أن يكون كتلة حرجة من الخلايا العصبية الحسية اطلاق النار من أكثر من منطقة واحدة من الجسم هناك حاجة لتحقيق في هذه السلوكيات. ومن المثير للاهتمام، ويلاحظ والسلوكيات مصادرة والشلل في درجات الحرارة (~ 34-37 درجة مئوية) تحت نهاية الجزء السفلي من عتبة nociceptive وحظ مع التحقيق الحرارة مشيرا إلى أن التحفيز العالمية قد تنطوي على جمع من الاستجابات العصبية التي هي غير كافية لتحريك السلوك مع المحلية تطبيق مسبار الحرارة. ويدعم ذلك وينظر في الواقع درجات الحرارة هذه الضارة على اليرقات بواسطة ملاحظة أن اليرقات التي تبدأ في سلوك الشلل ويسمح بعد ذلك لاسترداد على الغذاء لا يطير في معظم الحالات البقاء على قيد الحياة (الشكل 5C). مواصلة دعم الحجة القائلة بأن حرارة PLفحص يأكلون وتلا ردود nociceptive هو حقيقة أن منع انتقال متشابك في الخلايا العصبية الحسية المعروفة nociceptive يزيد من الكمون لمعظم السلوكيات الملاحظة (الشكل 6). ملاحظة أنه لا توجد زيادة في الكمون لسلوك ارتفاع درجة حرارة الجلد تشير إلى أن قد يكون مطلوبا الخلايا العصبية الحسية الأخرى التي لا تعبر عن MD-Gal4 لهذا السلوك.
وخلاصة القول، على حد سواء المقايسات تنطوي على تعريض 1 يرقة الفردية لخطة التحفيز الحراري الضارة من درجة حرارة محددة - قمة ساخنة لمجس معدني صغير في فحص المحلية والانغماس في قطرة ماء بسرعة التدفئة في فحص عالمي. الاستجابات السلوكية لليرقات ذبابة الفاكهة من مختلف الخلفيات الوراثية و / أو تعرضوا لاختلاف الظروف البيئية (على سبيل المثال زائد أو ناقص تلف الأنسجة)، يمكن دراستها وكميا باستخدام هذه المقايسات. في نهاية المطاف، وسوف ينتج عن هذه المقايسات تساعدنا على فهم أفضل الشبكات الجينية السيطرة على المؤسسة الوطنية للنفطiception في ذبابة الفاكهة والأنواع الأخرى ذات الصلة.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر المسيحي لاندري لتصميم مسبار الحرارة، ودانيال بابكوك لتطوير مسبار الحرارة اليرقات فحص، شون سويني ليشير الى ان لوحة فحص الحرارة، ومركز بلومنغتون سهم ذبابة الفاكهة للأسهم ذبابة، وأعضاء Galko مختبر لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 NS069828 على MJG ومارك المعاهد الوطنية للصحة تحت ستار تدريب جرانت (T34GM079088 الى جامعة أكاديمية علماء هيوستن، وسط المدينة) للوصول إلى أقلية وظائف البحث (AVG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors--noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
