Summary
在这篇文章中，我们展示了实验研究热痛觉
Abstract
在这篇文章中，我们展示了实验，以研究在果蝇幼虫的热痛觉。一个实验涉及到空间受限的（本地）1,2热感受器的刺激，而第二个涉及批发（全球）激活大多数或所有3个这样的神经元。总之，这些技术让果蝇伤害性感觉神经元的行为功能的可视化和量化。
果蝇幼虫是一个既定的模型系统研究热痛觉潜在的有害的进化保守的跨物种1,2温度，感官反应。这些研究对果蝇的优点是相对简单的神经系统和复杂的基因技术，可以用来解剖的基础生物学4-6在果蝇的分子基础，在所有的多细胞动物的反应作者e以有毒热刺激，一般涉及“nocifensive”提出的刺激7厌恶撤出。这种刺激是免费的神经末梢感受器，通过检测的有机体反应的幅度取决于接收8伤害性刺激感受器的数量。在果蝇中，它是IV级树突状树枝状检测，除了他们最近发现的作用作为感光10 9有害的热和机械刺激感觉神经元。这些神经元，这已经非常好，发育水平的研究，arborize在表皮屏障表，并与几乎所有11,12表皮细胞接触。每个IV类神经元的项目，他们可能会连接到二阶神经元轴突进入中枢神经系统的11腹神经索项目的大脑。
在基准条件下，伤害性感觉神经NS将不会触发，直至达到一个相对高门槛。这里所描述的实验，让研究者量化基线的行为反应，据推测，致敏，随之而来的下列组织损伤。每个检测有害的热刺激引起不同但相关的运动器官的行为反应，并允许研究人员在果蝇幼虫各方面的热痛觉可视化和量化。检测可应用于幼虫所需的基因型或不同环境条件下，可能影响痛觉提出幼虫。由于热痛觉跨物种保守，在果蝇的遗传解剖，从收集到的结果可能会告知在其他物种的热伤害性的认识，包括脊椎动物。
Protocol
一个典型的提纲准备两个热痛觉检测正常或紫外光敏幼虫的实验步骤如图1所示。
1。幼虫的制备
- 男性和女性的理想基因型的后代幼虫可直接测试。另外，可以建立一种遗传交叉，以获取利益的定义基因型的后代幼虫。成立于含瓶飞食品使用20-30处女的女性和15-20男性十字架。
- 鸡蛋打好后5天内，收获和清洁年初三龄幼虫糊状飞食品舀出，轻轻使劲水通过630微米（孔径）网运行。早期的三龄幼虫（长度3-4毫米，沿前后轴）转让小潮湿的食物垫防止饥饿和dessication的的。如果要测试痛觉过敏，按照后续步骤2.1-2.11。如果幼虫被测试在absenc组织损伤E，直接进行步骤3.1。
2。醚化和紫外线照射
- 构建醚化室。
- 削减了1.5毫升的离心管的底部。
- 用热金属锅铲融化离心管切缘。
- 贴上细网融化管表面，并允许降温。醚化室将允许醚烟雾进入，但防止幼虫逃生。
- 使用镊子或油漆刷轻轻放置在一个自制的醚化室10月初第三龄幼虫。
- 沿里面的盖子和密切的地方幼虫。
注：接下来的两个步骤，应在通风橱中进行，乙醚是一个潜在的爆炸性的化学品，其烟雾能麻痹一个人，以及幼虫。
- 将醚化室含幼虫含有10毫升的烧杯，背着一个罐子内Coplin〜1.5毫升乙醚的棉球浸泡。
- 螺丝帽上的Coplin壶幼虫暴露为2至2.5分钟醚烟雾。请注意，醚化时间较长，可能产生的不利影响幼虫的行为或生存。
- 醚化之后，从Coplin JAR /烧杯中删除醚化室，乙醚烟雾消散在引擎盖几秒钟。你现在可以回到实验室从引擎盖。
- 使用水喷瓶，轻轻冲洗幼虫从醚化室变成一个小型的培养皿。
- 使用镊子和Kimwipe涂抹麻醉幼虫干燥，轻轻贴上他们背侧带固定3“×1”玻璃显微镜幻灯片上双面胶带。
- 将幻灯片上的紫外线照射室的底面和6秒的幼虫暴露在紫外线照射下，在20兆焦耳/厘米2强度。
- 浸泡在水中的幻灯片，轻轻漂浮幼虫的双面scotc的关Ĥ磁带。
- 使用镊子或画笔，轻轻地放置在辐照幼虫1 15×45毫米的一个DRAM玻璃文化小瓶含〜1.0毫升苍蝇的食物，他们可以为可变的时间期限（8 -24小时）恢复25°C或其他所需的热痛觉实验前重新收获的培养温度。
3。本地热探针法
我们提供一个有害的热刺激，个别幼虫体内部分使用定制的专业开发工程（见材料表）生产的热探头。虽然这种探头优化设计功能（〜.07毫米2区的小金属尖，能精确保持设定温度从23°C至65°C）的原则，任何一个小技巧，可以加热的工具到了一段长达20秒的定义温度应该足够了。探头尖端的手背上被用来刺激早期第三龄幼虫，正是升中线在腹段A4（ 见图2）。在这种热刺激反应，幼虫通常会表现出厌恶的退出行为，一个由360度或以上的横向滚动。这种行为是有别于他们的光触摸响应非有害室温金属探测器一般涉及短暂的停顿，在其运动器官的活动13。
热探针法的协议：
- 热探针预先设定的温度所需的设定点。
- 使用画笔或镊子轻轻地转移到一个平面平台（我们通常使用的粘结剂的乙烯切小块）的幼虫，随后将刺激个人幼虫。幼虫应与热探针接触前一水薄膜覆盖。水薄膜覆盖幼虫应该尽可能少，并完全覆盖，幼虫，同时确保未干时，幼虫接触乙烯。
- 对A4在段与尖端的光压力，在大约45°之间的角度探头和表面的幼虫（ 见图2）申请的幼虫轻轻按下探头尖端。压力应引起幼虫表面轻微压痕，通常是足够的，以防止运动。如果幼虫继续移动，适用于稍多的压力，它通常会停止。不记录数据，直到响应或20秒截止实现超越的观点或领域不断探针接触的举动不能从幼虫。
- 继续刺激幼虫展示或达到，直到20秒截止，直到戒断反应，以先到为准。响应幼虫通常先显示一个抬起的头部和尾部的初步行为。这通常是随后撤出至少有360度的滚动行为。只有360度的完整的辊取得为nocifensive行为（HEA初步的d或尾巴加薪是不是）。
- 退缩行为一旦开始释放探头接触和记录延迟或退出的时间。如果没有退缩行为的观察，然后在20秒内的幼虫是一个非应答。进一步的反应可以分为两类。如果在5秒钟内撤出行为，然后幼虫是一个快速响应。如果取款行为是显示5-20秒之间，然后幼虫是一个缓慢的应答（ 见图1巴布科克等人，2009年）1。
4。全球热板试验
热板法测量热痛觉在果蝇幼虫时，整个动物面临着与有害的热刺激。个人中旬第三龄幼虫放置在一个60×15毫米培养皿水80μL滴-原理和实验组照片见图3起来。培养皿中，然后放置到一个坚实的加热块（被称为“热板”）。作为一滴水上升的温度，幼虫表现出了一系列五刻板的行为，我们称之为头部捶打，轧辊，鞭，扣押和瘫痪。作为这些行为一定程度上热板设定温度和水量的功能，幼虫浸入我们在座的，我们已经找到了什么是最佳条件下（95℃热板，80μL下降水），观察它们之间的最小重叠的所有行为。
热板法的协议：
- 放置光纤光导，以确保观看幼虫有足够的高对比度照明。如有必要，使用的测试幼虫。应该是光功率低，被测试的幼虫，以避免环境热。
- 放入热板加热块平坦的表面，并放在热盘上显微镜的基础。热板转到“高”的位置，允许约15分钟的温度稳定，并作出相应调整，表面温度达到95°C
- 80μl蒸馏水的测量，并将在60×15毫米的聚苯乙烯1移液器的Petri菜中的一滴水。
- 使用镊子轻轻一滴水中放入一个干净中旬第三龄幼虫。尝试转移可能的水体积最小的幼虫，使被加热的下降，保持尽可能接近原来的80μL。
- 轻轻的固体加热块放置到培养皿中含有水滴和幼虫对热板。迅速调整菜的位置，所以整个幼虫和看法是一滴水。 见图3和视频1-6。
- 此刻开始定时器被放置在培养皿中的固体加热块加热板和记录每个行为的发病时间。的行为，如果需要的话，也可以是视频录制- 视频1-5为每个行为的有代表性的例子。徕卡软件版本3.7被用来记录电影，录像模式是“连续”，相机的分辨率为300万像素（我们使用0.63x放大计算的图像分辨率为10微米/像素），并分别为44.5帧/秒。
5。代表结果
当地热探针法：
热探针接触后，幼虫通常显示的解除其头部和尾部的初步行为。通常情况下，解除头部被看作第一其次尾巴抬起。几秒钟后，这个初步的行为通常幼虫开始横向滚动，我们称之为“厌恶退缩行为。”后，初步行为或退缩行为显示的时间可能会有所不同温度或GE遗传背景。在我们最初的研究中，我们测量了幼虫参展厌恶撤出探头在不同的设定点温度的百分比，结果发现，48℃，最低气温在所有幼虫响应速度快（<5秒）。在这里，我们报告说，有一个上限，以幼虫热痛觉反应（ 图4A）。 100％的快速反应，观察到探头温度52°C。然而，在54°C和更高，90％或更多的幼虫不能回应，即使经过20小号接触。这些幼虫20小号截止后继续移动。
正如先前1，在每个温度下的退缩行为的类别，可以绘制和统计比较。鉴于这是一种行为检测，有一些从幼虫，幼虫和个人用户之间的变异。考虑到这一点，我们通常测量3套30％的试验条件下幼虫。除了简单的Wi分类我们先前报道的thdrawal延迟，我们在这里报告，也可以测量振幅（卷筒或厌恶退缩行为所花费的时间）（ 见图4）。令人惊讶的是，似乎是逆输入温度和响应的鲁棒性之间的关系，因为较低的温度下出现较多挑起辊（ 图4B）和更多的时间在厌恶撤出花（数据未显示）。这可能表明，接触有害的温度的持续时间可能是鲁棒性的主要因素。
热板实验：
五千篇一律的运动器官的行为被发现后，浸泡在水中的幼虫转移到热板。这些措施说明如下，并显示在视频一起典型的水加热幼虫的运动器官的行为。这些行为观察的平均潜伏期如图5所示一，平均一滴水，每延迟测量温度。这里介绍的最佳实验条件下显示每个不同的行为幼虫的比例介于77至100％（ 图5B），虽然偶尔滚动和鞭打行为被省略，重叠，或以相反的顺序发生。观察到的行为，按时间顺序，介绍如下，可以在观看视频在下面显示的时间：
- 在热的情况下的正常蠕动运动：运动伴随着搜索头部运动。从6:27看到视频。
- 头痛击：幼虫移动迅速朝正向或横向运动。这项议案是其在水中的正常运动（ 视频1）类似，但更颠簸摇晃，持续发生。从6:40看到视频。
- 辊：幼虫滚动横向至少一个完整的360°。从6:50看到视频。这可能发生一个时代的变量有时涉及不完整的轧辊。对于得分的行为，我们只能算完整的360°辊的目的。这种行为是与本地应用程序的热探头看到，最相似的。
- 鞭：幼虫展品沿前后轴的快速释放收缩运动，使头部很简单的接近尾。从7:11看到视频。经常观察在快速继承或作为滚动的同时鞭打。
- 劫持：的幼虫延伸出沿前后轴，并表现出高频率全身颤抖的行为，无弯曲。从7:25看到视频。
- 瘫痪：幼虫停止运动。在一些幼虫，这是永久性的，而其他人则表现出低频脉动运动。从7:36看到视频。
这些数据表明，一滴水和延迟发病的5个字符的温度幼虫/一滴水全球加热后观察acteristic行为是高度相关的。
图1。纲要的编制和幼虫的检测实验步骤 。化验痛觉与热探头或热板前，来自某只股票或遗传交叉幼虫的粮食收获和清洗。如果痛觉过敏（反对基线痛觉）进行评估，收获后由醚化（接触乙醚），安装，紫外线照射，一段时间恢复对飞食品。收获或回收幼虫，然后用热探头（本地）或热板（全球）检测有害的测试温度。数字是指方法的文字描述步骤（S）所示的部分。
figurE 2。实验设立本地热探针法。热探头热控制单元用于设置和保持探头的温度控制。探头举行前后轴垂直，用来刺激幼虫在45°角的水平。探针接触是在腹段A4，具体如下所示。用户必须保持接触与温和的压力，直到20秒截止或直到滚动行为开始。如果温度被认为有毒，幼虫会显示特点是至少有一个360°辊厌恶的退出行为。轧辊的数量可为单个或多个（ 见图4B）。
图3。热板法实验设置 。 （一）含有一个60×15毫米培养皿横看卡通中旬第三明星幼虫在80μL一滴水。 （二）卡通顶视图的幼虫放置在中间通过显微镜观察一滴水。 （三）此法工作站的水平视图照片。 （四）幼虫的照片通过显微镜观看。
图4。量化使用热探针法的行为反应。（一）剧情％的应答者属于每个类别（快，慢，无反应）与温度。 （二）潜伏期厌恶与轧辊的数量增加毒性的四种不同的测试温度（42℃，44°，46°，48°，50°，和52表现出每个幼虫在退缩行为的剧情℃）。
图5。热板法：延迟时间和温度与BEHavior。（一）每个95的最佳条件下的行为反应延迟和水平均下降温度°C间（热板表面温度）和80μL的水压降（N = 150）。请注意，每个行为是一个特定的时间间隔内观察。一滴水温度测量用的热电偶插入到顶部或底部的下降（N = 10滴为每个位置）和这些测量取平均值。 （二）幼虫的百分比参展每个最佳实验条件下的行为反应。颠簸，抓住和瘫痪几乎100％的时间，同时观察观察分别为77和80％的时间，滚动和鞭打。在较低的表面温度设定点检和瘫痪在200秒内，在更高的设定点，滚动和鞭笞可以跳过或可能发生的同时不遵守。 N = 150。 （三）幼虫的百分比生存以下开始瘫痪行为。幼虫被加热，直至被轧花瘫痪，然后删除恢复到标准的文化条件。模拟处理的幼虫除热暴露同等待遇。形成蛹和可行的成年人进行了量化的7-13天。 N = 120。
图6。灭活幼虫伤害性感觉神经元增加的行为反应延迟 。情节延迟到每个行为指定的基因型：W 1118 Gal4的109（2）80 = MD-Gal4的/ +无人机的Ork1.Δ - C / +无人机的Ork1.Δ - NC / +，MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C，和md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC的。 MD-Gal4的驱动器在所有四个类multidendritic周边感觉神经元无人机调节的转基因表达的UAS-Ork1.Δ-14表达了果蝇开放整流钾离子通道的突触传递所需的修改后的版本， 和 U AS-Ork1.Δ-14数控表达了同样的通道进一步修改后的版本，不干扰突触传递。请注意，只有的幼虫轴承MD-Gal4的驱动程序6和无人机，Ork1.Δ-C的转基因显示为四个五个观察到的行为（捶打，轧辊，扣押，瘫痪）增加延迟。还要注意的是，因为滚动这些动物鞭之前，他们推出的延迟增加。星号表示，学生的t检验P <0.05。 N = 30％基因型幼虫。
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Discussion
这里描述的检测可用于定性和定量评估有害的热刺激的反应不同基因型的幼虫。热探针法的一个主要特点是，刺激只在一个单一的轨迹。这大概只有一小部分，IV类神经元段由探头接触的可能立即11个相邻节段的射击。由于局部刺激，模仿的热探针法检测定位到一个特定区域，如手接触热炉身体有害刺激的感官体验。热探针法的缺点是，它有一些用户到用户的变化，可能可以归因于三个因素：一）与用户应用的探头幼虫的压力，二）探针的精确位置对幼虫相对底层的痛觉神经元，，三）精确昂乐在探头接触表面的幼虫。
我们以前报道分类幼虫的定量策略到无反应，反应缓慢，快速反应撤军延迟到一个给定的温度1。在这里，我们报告幼虫的反应，以更高的温度。有趣的是，我们发现幼虫热痛反应，有一个上限，这个上限之间52和54°C。这可能表明，幼虫不具备瞬时受体电位（TRP）通道门能够在温度超过52°C。另外，它可以建议使用的神经细胞或肌肉开始或进行损坏电机的响应之前，他们甚至可以运作厌恶撤出。我们还报告分析不同的撤军幅度响应为响应“鲁棒性”指标使用的轧辊。天真，希望，这些参数会随着温度的升高或刺激时间增加。令人惊讶的是，我们发现，这种情况并非如此。幼虫在低端的有毒的范围（42℃）的温度较长时间的刺激表现出更多的面包和花费更多的时间滚动比幼虫探讨在较高的温度（48-52℃）。这表明，在有毒的温度窗口，它主要是时间曝光，决定响应的幅度。由于幼虫暴露于高度有毒的温度（48-52°）平均响应速度非常快，他们没有表现出许多轧辊的幼虫暴露的时间长，温度减少有害。响应振幅分析报告增加了另一个维度沿不同的基因型或环境操作可以比较定量。
热板法的一个主要特点是，它涉及一个全球性的接触到有毒热。正因为如此，它更像是坐在比触摸热炉加热釜的动物。虽然这是不明确时，幼虫可能会遇到在野外的全球有害的刺激，在实验室对这一全球性曝光的行为反应是较局部刺激后观察到的复杂。热板法的强度，还指出，其他3是因为接触幼虫是不是该协议的一个组成部分，它有小的用户到用户的变异。唯一实质性的差异，似乎是在确定每个行为开始时，这可以反复观看/熟悉的最小化。一个有趣的差异之间的化验是令人厌恶的行为开始时的温度。这些都是远低于热探头在热板法。幼虫接触与热探针（头部和尾部加注）展出了初步的行为可能是一个关联的观察〜27°C的热平台的头部捶打é检测。这是可能的响应，这反映了“不适”比“痛”。我们没有观察到因素的相关鞭打，扣押，即使在高温和麻痹（高达48°C）温度在热探针法，它可能是发射的身体从多个地区的感觉神经元的临界质量需要对这些行为带来的。有趣的是，癫痫和瘫痪的行为观察温度（〜34 - 37℃）以下的观察表明，全球刺激可能涉及神经元的反应是不够的总结，与当地的行为触发探头与热的痛觉阈值的底热探针的应用。这些温度实际上是为有毒的幼虫认为是支持的观察，幼虫开始瘫痪的行为，并随后获准恢复对飞食品，在大多数情况下生存（图5C）。进一步支持的论点，热PL吃检测读出伤害性反应，是一个事实，即阻断已知的伤害性感觉神经元的突触传递，大部分观测到的行为（图6）增加了延迟。更高温度鞭打行为，有没有延迟增加的观察表明，其他感觉神经元不表达MD-Gal4的可能需要这种行为。
总之，这两个实验涉及个别幼虫暴露定义温度 - 一个小的金属探测器，在当地的下降在全球试验中迅速加热水浸泡法和热尖有害的热刺激。不同的遗传背景和/或暴露于不同环境条件（例如加号或减号组织损伤）的果蝇幼虫的行为反应，可以使用这些实验研究和量化。最终，从这些实验结果将有助于我们更好地了解基因网络控制NOCiception在果蝇和其他相关物种。
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢基督教兰德里热探针的设计，发展批判性阅读的手稿表明热板法，布卢明顿果蝇库存中心飞股票，并Galko实验室成员幼虫热探针法，肖恩·斯威尼丹尼尔·巴布科克。这项工作是由NIH支持以R01 NS069828 MJG和一个国家卫生研究院MARC U型明星训练津贴（T34GM079088休斯敦市中心学者学院大学）研究事业（平均值）为少数获得。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
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