Summary
I denne artikel, udviser vi analyser for at studere termisk nociception i
Abstract
I denne artikel, udviser vi analyser for at studere termisk nociception i Drosophila larver. En analyse involverer rumligt begrænset (lokale) stimulering af termisk nociceptorer 1,2, mens den anden involverer en gros (global) aktivering af de fleste eller alle disse neuroner 3. Sammen disse teknikker tillader visualisering og kvantificering af de adfærdsmæssige funktioner Drosophila nociceptive sensoriske neuroner.
Drosophila larver er en etableret modelsystem til undersøgelse termisk nociception, en sensorisk reaktion potentielt skadelige temperaturer, der er evolutionært konserverede på tværs af arter 1,2. Fordelene ved Drosophila for sådanne undersøgelser er den relative enkelhed af nervesystemet og sofistikerede de genetiske teknikker, der kan anvendes til at dissekere den molekylære basis for den underliggende biologiske 4-6 Drosophila, som i alle metazoans de response til skadelige termiske stimuli generelt indebærer et "nocifensive" aversiv tilbagetrækning til den præsenterede stimulus 7. Sådanne stimuli detekteres ved frie nerveender eller nociceptorer og amplituden af organismal respons afhænger af antallet af nociceptorer modtager skadelig stimulus 8. I Drosophila, er det klasse IV dendritiske arborization sensoriske neuroner, der registrerer skadelige termiske og mekaniske stimuli 9 i tillæg til deres nyligt opdaget rolle som fotoreceptorer 10. Disse neuroner, der er blevet rigtig godt studeret på det udviklingsmæssige niveau, arborize over barrieren epidermisarket og skabe kontakt med næsten alle epidermale celler 11,12. Den enkelte axon af hver klasse IV neuron projekter i den ventrale nerve ledningen af det centrale nervesystem 11, hvor de kan forbinde til anden ordens neuroner dette projekt til hjernen.
Under baseline forhold, nociceptive sensorisk neurons vil ikke fyre, indtil en relativt høj tærskel er nået. Analyserne beskrevet her tillader investigator at kvantificere baseline adfærdsmæssige reaktioner eller, formentlig, den overfølsomhed, som indledes efter vævsskade. Hver analyse provokerer forskellige, men beslægtede bevægelsesmæssigt adfærdsmæssige reaktioner på skadelige termiske stimuli og tillader forskeren at visualisere og kvantificere forskellige aspekter af termisk nociception i Drosophila larver. De assays kan anvendes til larver af ønskede genotyper eller larver hævet under forskellige miljøforhold, der kan påvirke nociception. Da termisk nociception er bevaret på tværs af arter, vil resultaterne hentet fra genetisk dissektion i Drosophila sandsynligt informere vores forståelse af termisk nociception i andre arter, herunder hvirveldyr.
Protocol
En typisk oversigt over de eksperimentelle trin til fremstilling af normale eller UV-sensibiliseret larver på de to termiske nociception assays er vist i fig 1.
1. Fremstillinq af Larver
- Mandlige og kvindelige afkom larver af en ønsket genotype kan testes direkte. Alternativt kan en genetisk tværs sættes op til at opnå afkom larver af en defineret genotype af interesse. Opsætning kors i flasker indeholdende fly fødevarer med 20-30 jomfruelige hunner og 15-20 mænd.
- 5 dage efter æglægning, høst og rene tidligt tredje stadie larver ved øse ud af grødet flyve mad og forsigtigt presser med rindende vand gennem en 630 um (porestørrelse) mesh. Overfører den tidlige tredje stadie-larver (~ 3-4 mm i længden langs anteroposteriore akse) til et lille fugtig pude af fødevarer for at forhindre sult og udtørring. Hvis nociceptive sensibilisering skal testes, skal du følge de efterfølgende trin 2,1-2.11. Hvis larver, der skal testes i absence af vævsskader, gå direkte til trin 3,1.
2. Etherisering og UV-bestråling
- Konstruer en etherisering kammer.
- Skære bunden fra en 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Med et varmt metalspatel smelte den skårne kant af mikrocentrifugerør.
- Anbringe en finmasket til den smeltede røroverfladen og afkøles. Den etherisering kammer vil tillade indførsel af ether røg, men at forhindre larver flugt.
- Brug pincet eller pensel til forsigtigt at placere 10 tidligt tredje stadie larver inde i en hjemmelavet etherisering kammer.
- Sted larver langs indersiden af låget og tæt.
Note: De næste to trin skal udføres i et stinkskab, som ether er et potentielt eksplosivt kemikalie og dets dampe kan bedøver et menneske såvel som en larve.
- Anbring etherisering kammer indeholdende larver i en Coplin beholder indeholdende et 10 ml bægerglas, der bærer envat gennemvædet med ~ 1,5 ml diethylether.
- Skru hætten af Coplin krukken at udsætte larverne til ether dampe i 2 til 2,5 minutter. Bemærk, at længere etherisering gange negativt kan påvirke larvernes adfærd eller overlevelse.
- Efter etherisering, den etherisering kammeret fjernes fra Coplin glasset / bægeret, hvilket giver et par sekunder i emhætten til ether røg at sprede. Du kan nu flytte fra hætten tilbage til laboratoriet.
- Anvende en vand sprøjteflaske til forsigtigt skylle larver fra etherisering kammeret i en lille petriskål.
- Pincet og en Kimwipe at rense bedøvet larver tørt og forsigtigt anbringer dem dorsalsiden op på en strimmel af dobbeltsidet tape fastgjort til en 3 "x 1" objektglas.
- Placér på bundfladen af en UV-bestråling kammer og udsættes larverne for UV-lys i 6 sekunder ved 20 mJ / cm 2 intensitet.
- Fordyb slæden i vand til forsigtigt at flyde larverne ud af dobbeltsidede scotch tape.
- Pincet eller pensel til anbring forsigtigt bestrålede larver i en 15 x 45 mm en dram glas kultur hætteglas indeholdende ~ 1,0 ml af fly fødevarer, hvor de kan restituere i en variabel periode (8 -24 timer) ved 25 ° C eller andre ønskede kultur temperatur, før re-høst for termiske nociception analyser.
3. Lokal varme Probe Assay
Vi leverer en skadelig termisk stimulus til en enkelt larve kropssegment ved hjælp af en specialbygget termisk sonde fremstillet af Pro-Dev Engineering (se tabel af materialer). Selvom denne probe har optimale designtræk (en lille metal spids ~ 0,07 mm2 areal og evnen til præcist at opretholde en indstillede temperatur fra 23 ° C til 65 ° C) i princippet ethvert værktøj med en lille spids, der kan opvarmes til en defineret temperatur i en periode på op til 20 sekunder være tilstrækkeligt. Sondespidsen anvendes til at stimulere tidlig 3. stadiums larver præcist på dorsal midterlinjen på abdominal segment A4 (se figur 2). Som svar på denne termiske stimulus, vil larverne udviser generelt et afskrækningsmiddel tilbagetrækning adfærd rullende sideværts 360 grader eller mere. Denne adfærd er forskellig fra deres let tryk reaktion på en ikke-skadelig stuetemperatur metal sonden, som generelt indebærer en kort pause i deres motorisk aktivitet 13.
Protokol for varmen sonde analysen:
- Forudindstillede temperatur af den termiske proben til den ønskede indstillede punkt.
- Brug en pensel eller en pincet til forsigtigt at overføre en enkelt larve på en flad platform (man plejer at bruge et lille stykke vinyl skåret fra et bindemiddel), som larverne efterfølgende vil blive stimuleret. Larve bør være dækket af en tynd film af vand før kontakt med den termiske proben. Den vandfilm, der dækker larve bør være så lille som muligt og fuldstændigt dække larve, samtidig med at larven ikke er tør ved berøring af vinyl.
- Forsigtigt tryk sondespidsen mod larve i segmentet A4 med et let tryk med spidsen på omkring en 45 ° vinkel mellem proben og overfladen af larve (se figur 2). Trykket bør forårsage en lille fordybning i overfladen af larver og vil normalt være tilstrækkelig til at forhindre bevægelse. Hvis larve fortsætter med at bevæge anvende lidt større tryk, og det vil normalt stoppe. Må ikke registrere data fra larver, der bevæger sig uden for synsfelt, eller som konstant sonde kontakt ikke kan opnås, indtil respons eller 20 s cutoff.
- Fortsæt med at stimulere larve, indtil en tilbagetrækning respons er udstillet eller indtil 20 sekunder cutoff er nået, hvis dette sker først. Som svar larver typisk først viser en foreløbig adfærd løfte hoved og hale. Dette er normalt efterfulgt af tilbagetrækning adfærd rullende mindst 360 grader. Kun en komplet rulle 360 grader scores som nocifensive adfærd (den foreløbige HEAd eller hale raise er ikke).
- Når tilbagetrækning opførsel initieres frigivelse kontakt med proben og optage latenstiden eller tid til tilbagetrækning. Hvis ingen tilbagetrækning adfærd observeres inden for 20 sekunder, hvorefter larve er en non-responder. De responderende kan yderligere opdeles i 2 grupper. Hvis tilbagetrækningen adfærd er vist inden for 5 sekunder, så larve er en hurtig-responder. Hvis tilbagetrækningen adfærd er vist mellem 5-20 sekunder, hvorefter larve er en langsom-responder (se figur 1 i Babcock, et al. 2009) 1.
4. Global varmepladen Assay
Varmen pladeassayen blev designet til at måle termisk nociception i Drosophila larver, hvor hele dyret står over for en skadelig termisk stimulus. Individuel midten 3. stadiums larver anbringes i en 80 ul dråbe vand på en 60 x 15 mm petriskål - se figur 3 for skematisk og billeder af assayet sættetop. Petriskålen anbringes derefter på en fast varmeblok (benævnt "varme plade"). Da temperaturen af vanddråben stiger udviser larve en serie på fem stereotype adfærd, vi har kaldt hoved thrash, roll, pisk, beslaglæggelse, og lammelse. Da disse adfærdsmønstre til dels en funktion af sætpunkt temperaturen af den varme plade og den mængde vand, hvori larve er nedsænket præsenteres her, hvad vi har fundet at være de optimale betingelser (95 ° C varme plade, 80 pi dråbe vand) til iagttagelse alle fem af de problemer med minimal overlapning mellem dem.
Protokollen for varme plade-assay:
- Placer fiberoptiske lysledere for at sikre, at der er tilstrækkelig høj kontrast belysning til visning af larve. Anvendes en test larve om nødvendigt. Lyseffekten bør være lav for at undgå omgivende varme på larven, der skal testes.
- Placere varmeblokken til varme plade med flad overflade op og placerer den varme plade påmikroskopet base. Tænde varmepladen til "høj" position tillader cirka 15 minutter til temperaturen for at stabilisere og justeres i overensstemmelse hermed for at opnå en overfladetemperatur på 95 ° C.
- Måle 80 ul destilleret vand og anbringes vanddråbe i midten af 60 x 15 mm polystyren petriskål med en mikropipette.
- Pincet for anbring forsigtigt ren mid 3. stadiums larver i midten af vanddråben. Forsøger at overføre larve med den mindst mulige mængde vand, således at dråben, der skal opvarmes forbliver så tæt som muligt til den oprindelige 80 ul.
- Anbring forsigtigt petriskål indeholdende vanddråben og larve på den faste varmeblokken på varmepladen. Hurtigt justere placeringen af skålen, således at hele larve og vanddråbe i sigt. Se figur 3 og videoer 1-6.
- At starte timeren på det tidspunkt, petriskålen placeres på den faste varmeblokken af varme plade og posttidspunktet for indtræden af hver adfærd. Hvis det ønskes, kan adfærd også være optaget på video - se videoer 1-5 for repræsentative eksempler på hver adfærd. Leica software version 3,7 blev anvendt til registrering af de film, optagelsestilstand var "Kontinuerlig", var kamera opløsning 3 Megapixel (vi brugte 0.63x zoom, som den beregnede billedopløsningen er 10 um / pixel) og billeder / sekund var 44,5.
5. Repræsentative resultater
Lokal varme Probe assay:
Ved kontakt med den termiske probe, typisk en larve viser en indledende adfærd løfte sit hoved og hale. Typisk ophævelsen af hovedet ses først, efterfulgt af løft af halen. Et par sekunder efter den indledende adfærd larven normalt begynder at rulle til siden, som vi refererer til som "aversiv tilbagetrækning adfærd." Den tid, hvorefter den indledende adfærd eller tilbagetrækning opførsel er vist kan variere afhængigt af temperatur eller GEtisk baggrund. I vores indledende undersøgelse har vi målte procentdel af larver aversiv tilbagetrækning forskellige probesæt punkt temperaturer, og fandt, at 48 ° C var den laveste temperatur, ved hvilken alle larver reagerede hurtigt (<5 s). Her rapporterer vi, at der er et loft på larvestadiet termiske nociception respons (Figur 4A). 100% hurtige respons observeres op til en probe temperatur på 52 ° C. Imidlertid, ved 54 ° C og højere, 90% eller mere af larverne ikke reagerer selv efter 20 s i kontakt. Disse larver ikke fortsætter med at bevæge efter 20 s cutoff.
Som tidligere nævnt 1, kan de kategorier af tilbagetrækning adfærd ved hver temperatur afsættes og sammenlignet statistisk. Da dette er en adfærdsmæssig analyse der er en vis variation fra larve til larve og mellem de enkelte brugere. For at tage højde for dette, vi normalt måler 3 sæt af 30 larver per test tilstand. Ud over den simple kategoriseringen af withdrawal latens, som vi tidligere har beskrevet, Vi rapporterer her, at amplituden (antal ruller eller tid tilbragt i aversiv tilbagetrækning adfærd) kan også måles (se figur 4). Overraskende synes der at være et omvendt forhold mellem input temperatur og robustheden af reaktionen, da lavere temperaturer synes at fremkalde et større antal ruller (figur 4B) og mere tid tilbragt i aversiv tilbagetrækning (data ikke vist). Dette kan indikere, at varigheden af udsættelse for en skadelig temperatur kan være den vigtigste faktor for robusthed.
Varmepladen Assay:
Fem stereotype bevægelsesmæssigt adfærd observeres efter overførsel af larve neddyppet i vand til den varme plade. Disse er beskrevet nedenfor og vist i videoen sammen med typiske bevægelsesadfærd af en uopvarmet larver i vand. De gennemsnitlige ventetid ved hvilken disse adfærd observeres, er vist i figur 5A, er de gennemsnitlige vanddråben temperatur målt for hvert latens. Under de optimale assaybetingelser præsenteret her procentdelen af larver, der udviser hver forskellig adfærd varierede fra 77 til 100% (fig. 5B), selv lejlighedsvis de rullende og piskning adfærd er udeladt, overlapning eller forekommer i omvendt rækkefølge. De observerede adfærd, i kronologisk rækkefølge, beskrevet, som følger, og kan ses i videoen på de nedenfor angivne tidspunkter:
- Normal bevægelse i fravær af varme: peristaltiske bevægelse ledsaget ved at søge hoved bevægelser. Se video fra 6:27.
- Hovedet Thrash: Larven bevæger hovedet hurtigt i en fremadrettet eller lateral bevægelse. Denne bevægelse svarer til deres normale bevægelse i vand (se video 1), men forekommer mere ryk og vedholdende. Se video fra 6:40.
- Roll: Larve ruller lateralt i det mindste en fuld 360 °. Se video fra 6:50. Dette kan forekommeet variabelt antal gange og ofte involverer ufuldstændige ruller. Med henblik på at score den adfærd, vi kun tæller 360 ° ruller. Denne opførsel er det mest ligner den, der ses med lokal anvendelse af varmen sonden.
- Pisk: larve udviser hurtig sammentrækning udløsning bevægelser langs anteroposteriore akse, at bringe hovedet meget kort tæt til halen. Se video fra 7:11. Pisk er ofte observeret i hurtig rækkefølge eller på samme tid som valsning.
- Beslaglæggelse: Larve strækker sig ud langs anteroposteriore aksen og udviser en høj frekvens hele kroppen ryster adfærd uden at bøje. Se video fra 7:25.
- Lammelse: Larve ophører bevægelse. I nogle larver er permanent, medens andre derefter udviser en lav frekvens pulsering bevægelse. Se video fra 7:36.
Disse data antyder, at temperaturen af vanddråben, og latenstiden til indtræden af de fem charkarakteristiske adfærd observeret ved den globale opvarmning af larve / vanddråbe er stærkt korreleret.
Figur 1. Oversigt over eksperimentelle trin til forberedelse og analyse af larver. Forud for analyse nociception med varmen probe eller den varme plade, der larver afledt af en bestand eller genetisk tværs høstet og renset for fødevarer. Hvis nociceptive overfølsomhed (i modsætning til baseline nociception), skal vurderes, er høst efterfulgt af etherisering (udsættelse for ether), montering, UV-bestråling, og en periode med opsving på fly mad. Høstes eller genvindes larver underkastes derefter skadelige testtemperatur med enten varme proben (lokal) eller varme plade (samlet) assay. Tallene henviser til dele af metoder, tekst, der beskriver trin (e) er vist.
Figure 2. Eksperimentel sat op til lokale varme sonde analysen. Varmen probe styres af en termisk styreenhed, der anvendes til at indstille og opretholde temperaturen af proben. Sonden holdes vinkelret på anteroposteriore aksen og anvendes til at stimulere larve i en vinkel på 45 ° med vandret. Probe kontakt er lavet specielt til abdominale segment A4 som vist. Brugeren skal opretholde denne kontakt med et let tryk indtil 20 sekunder cutoff eller indtil den rullende adfærd begynder. Hvis temperaturen opfattes som skadelige, vil larve viser en aversiv tilbagetrækning opførsel er kendetegnet ved mindst et 360 ° valse. Antallet af ruller kan være enkelt-eller multiple (se figur 4B).
Figur 3. Eksperimentelle opsætning til varme plade-assay. (A) tegning af et horisontalt billede af 60 x 15 mm petriskål indeholdende et mid 3. istjerne larve i en 80 ul vanddråbe. (B) tegning af en afbildning set ovenfra af larve placeret i midten af vanddråben som set gennem mikroskopet. (C) fotografi af et horisontalt billede af arbejdsstationen for dette assay. (D) fotografi af larve som set gennem mikroskopet.
Figur 4. Kvantificering af adfærdsmæssig reaktion under anvendelse af varme proben assay. (A) plot af procent respons tilhører hver kategori (hurtig, langsom-og ikke-responderende) versus temperatur. (B) afbildning af latenstiden til aversiv tilbagetrækning adfærd i forhold til antallet af ruller hver larver udstillet på fire forskellige test temperaturer med stigende skadelighedskriterier (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C og 52 ° C).
Figur 5. Varmepladen assay: Reaktionstid og temperatur versus Behavior. (A) latenstid og gennemsnitlig vanddråben temperatur til hver adfærdsmæssig reaktion under de optimale betingelser 95 ° C (varm plade overfladetemperatur) og 80 ul dråbe vand (n = 150). Bemærk, at hver adfærd observeres inden for et bestemt tidsinterval. Vanddråben temperaturer blev målt ved anvendelse af et termoelement indsat i enten toppen eller bunden af dråben (n = 10 dråber for hver lokation), og disse målinger blev taget et gennemsnit. (B) Procent af larver hver adfærdsmæssig reaktion under optimale assaybetingelser. Prygle, beslaglæggelse og paralyse observeres næsten 100% af tiden, medens ruller og piskning observeres 77 og 80% af tiden, hhv. Ved lavere overfladetemperatur sæt punkter, beslaglæggelse og lammelser ikke overholdes inden for 200 s, og ved højere indstillingspunkter rullende og piskning kan springes over eller kan forekomme samtidigt. n = 150. (C) Procentdel af larver, som overlever efter påbegyndelse af lammelse adfærd. Larverne blev opvarmet, indtil væreegreneringsvirksomhederne lammelse og derefter fjernes til standard dyrkningsbetingelser at komme sig. Mock-behandlet larver modtage en tilsvarende behandling med undtagelse af varme eksponering. Dannelse af pupper og levedygtige voksne blev kvantificeret på dage 7-13. n = 120.
Figur 6. Inaktivering af larvestadium nociceptive sensoriske neuroner forøger adfærdsmæssige respons latenstider. Afbildning af latenstiden for hver adfærd for de indikerede genotyper: w 1118, GAL4 109 (2) 80 = MD-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C og md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. MD-Gal4 drev ekspression af UAS-regulerede transgener i alle fire klasser af multidendritic perifere sensoriske neuroner, UAS-Ork1.Δ-C14 udtrykker en modificeret version af Drosophila åbne ensretter K +-kanal er nødvendig for synaptisk transmission, og U AS-Ork1.Δ-NC 14 udtrykker en yderligere modificeret version af den samme kanal, som ikke interfererer med synaptisk transmission. Bemærk, at kun larver bærer både MD-Gal4 driver 6 og UAS'et-Ork1.Δ-C transgener viser øget ventetid for fire af de fem observerede adfærd (thrash, roll, beslaglæggelse og lammelse). Bemærk også, at på grund af den øgede ventetid til rullende disse dyr pisk, før de ruller. Asterisk angiver p <0,05 ved Students t-test. n = 30 larver pr genotype.
Supplerende Video 1. Klik her for at se video .
Supplerende Video 2. Klik her for at se video .
Supplerende Video 3."Target =" _blank "> Klik her for at se video.
Supplerende Video 4. Klik her for at se video .
Supplerende Video 5. Klik her for at se video .
Supplerende Video 6. Klik her for at se video .
Discussion
De assays der er beskrevet her, kan anvendes til kvalitativt og kvantitativt at vurdere larver af forskellige genotyper for modtagelighed for skadelige termiske stimuli. Et væsentligt element i den varme sonden analysen er, at stimulus gives kun på et enkelt locus. Dette sandsynligvis fører til brænding af kun en lille delmængde af klasse IV neuroner-de dem i segment i kontakt med proben og måske dem, umiddelbart tilstødende segmenter 11. På grund af lokal stimulering efterligner den varme proben assayet fælles sanseoplevelse for at detektere en skadelig stimulus, der er lokaliseret til et særligt organ region, såsom en hånd at kontakte en varm ovn. En ulempe ved den varme proben assayet er, at det har en bruger til bruger variabilitet, som kan sandsynligvis tilskrives tre faktorer: i) det tryk, hvormed brugeren anvender probe til larve, ii) den nøjagtige placering af proben på larve i forhold til de underliggende nociceptive neuroner, og iii) nøjagtige angle, hvor proben er i kontakt med overfladen af larver.
Vi har tidligere rapporteret en kvantitativ strategi kategorisere larver i non-responders, langsomme respondenter og hurtige respondenter baseret på deres tilbagetrækning ventetid til en given temperatur 1. Her har vi rapportere om larver lydhørhed over for endnu højere temperaturer. Interessant, finder vi, at der er et loft for larver termiske nociceptive responser, og at dette loft ligger mellem 52 og 54 ° C. Dette kan indikere, larver ikke besidder en transient receptor potentiale (TRP) kanal er i stand til gating ved temperaturer højere end 52 ° C. Alternativt kunne det tyder på, at de neuroner eller muskler, der anvendes til at indlede eller udføre motorisk reaktion bliver beskadiget, før de overhovedet kan fungere i aversiv tilbagetrækning. Vi rapporterer en anden analyse af amplituden af nedtrapningsrespons der anvender enten antallet af ruller som en indikator for den "robusthed" af reaktionen. Naivt, enville forvente, at disse parametre vil stige med stigende temperatur eller tid stimulering. Overraskende finder vi, at dette ikke er tilfældet. Larver stimuleret i længere tid ved en temperatur i den lave ende af skadelige område (42 ° C) viser flere ruller og mere tid rullende end larver probet ved højere temperaturer (48-52 ° C). Dette antyder, at i det skadelige temperaturen vinduet er det primært varigheden af eksponeringen, som bestemmer amplituden af responset. Idet larver udsættes for meget skadelige temperaturer (48-52 ° C) reagerer gennemsnit meget hurtigt, udviser de ikke så mange valser som larver udsættes for en mindre skadelig temperatur i et længere tidsrum. Analysen af responsamplituden rapporteret her tilføjer en anden kvantitativ dimension langs hvilken forskellige genotyper eller miljømæssige manipulationer kan sammenlignes.
Et væsentligt element i den varme plade analysen er, at det indebærer en global eksponering for skadeligevarme. Som sådan er det mere beslægtet med dyret sidder i en opvarmet kedel end røre en varm ovn. Selv om det ikke er klart, når en larve kan opleve en globalt skadelig stimulus i naturen, i laboratoriet de adfærdsmæssige reaktioner på denne globale eksponering er mere komplekse end dem observeret ved lokal stimulering. En styrke af varme pladeassayet, bemærkede også af andre 3, er, at den har ringe bruger-til-bruger variabilitet siden berøre larve ikke er en del af protokollen. Den eneste væsentlige afvigelse synes at være at definere, når hver adfærd begynder, og dette kan minimeres med gentaget visning / fortrolighed. En interessant forskel mellem assays er de temperaturer, ved hvilke afskrækningsmidler adfærd påbegyndes. Disse er meget lavere i den varme plade assayet end den varme proben. Den indledende adfærd, der udvises af larver i kontakt med den varme probe (hoved og hale raise) kan være en korrelere af hovedet thrash observeret ved ~ 27 ° C i den varme plate assay. Det er muligt, at dette svar afspejler "ubehag" mere end "smerte". Vi har ikke observeret et modstykke til piskning, beslaglæggelse, og paralyse selv ved høj (op til 48 ° C) temperaturer i varmen sonden analysen og det kan være, at en kritisk masse af sensorisk neuron skyde fra mere end én region af kroppen er nødvendigt for at bringe disse adfærdsmønstre. Interessant er anfald og lammelse adfærd observeres ved temperaturer (~ 34 - 37 ° C) under den nederste ende af den nociceptive tærskel observeret med den varme probe indikerer, at den globale stimulation kan involvere summering af neuronale reaktioner, der er tilstrækkelige til at udløse opførsel med lokal anvendelse af varme probe. At disse temperaturer faktisk opfattes som skadelige for larverne understøttes af den iagttagelse, at larver at begynde lammelse adfærd og derefter lov til at komme på fly fødevarer ikke i de fleste tilfælde overleve (figur 5C). Yderligere støtter det argument, at varmen plspiste assay udlæsning nociceptive responser er det faktum, at blokering synaptisk transmission i kendte nociceptive sensoriske neuroner forøger latensen af de fleste af de observerede adfærd (Figur 6). Den iagttagelse, at der ikke er nogen stigning i latenstid for den højere temperatur piskning adfærd tyder på, at andre sensoriske neuroner, som ikke udtrykker md-Gal4 kan være nødvendig for denne adfærd.
Sammenfattende omfatter begge assays udsætte et individ larve til en skadelig termisk stimulus af definerede temperatur - den varme spidsen af en lille metal-probe i den lokale assay og nedsænkning i en dråbe hurtigt opvarme vandet i den globale assay. Adfærdsmæssige reaktioner af Drosophila larver af varierende genetiske baggrunde og / eller udsættes for varierende miljømæssige betingelser (for eksempel plus eller minus vævsskade), kan studeres og kvantificeret under anvendelse af disse assays. I sidste ende, vil resultaterne fra disse analyser hjælpe os til bedre at forstå genetiske netværk styrer NOCiception i Drosophila og andre beslægtede arter.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Christian Landry for varme sondedesign, Daniel Babcock for udviklingen af larvestadiet varmen sonden analysen, Sean Sweeney for at foreslå den varme plade analysen, det Bloomington Drosophila Stock Center for fluen lagre, og Galko lab medlemmer til kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH R01 NS069828 til MJG og en NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 til University of Houston-Downtown Lærde Academy) for mindretals adgang til forskerkarrierer (AVG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors--noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
