Summary
I denne artikkelen viser vi analyser for å studere termiske nociception i
Abstract
I denne artikkelen viser vi analyser for å studere termiske nociception i Drosophila larver. En analysen innebærer romlig-begrenset (lokal) stimulering av termisk nociceptors 1,2 mens den andre innebærer en grossist (global) aktivering av de fleste eller alle slike nevroner 3. Sammen utgjør disse teknikkene tillater visualisering og kvantifisering av de atferdsmessige funksjoner Drosophila nociceptive sensoriske nevroner.
Den Drosophila larven er en etablert modell for å studere termiske nociception, en sensorisk respons på potensielt skadelige temperaturer som er evolusjonært bevares over arter 1,2. Fordelene med Drosophila for slike studier er den relative enkelhet av sin nervesystemet og raffinement av de genetiske teknikker som kan brukes til å dissekere den molekylære basisen for den underliggende biologi 4-6 i Drosophila, som i alle metazoans de response til skadelige termiske stimuli innebærer generelt en "nocifensive" motvilje uttak til den framlagte stimulus 7. Slike stimuli oppdages gjennom frie nerveender eller nociceptors og amplitude i organismebiologi responsen avhenger av antall nociceptors mottar skadelige stimulus 8. I Drosophila, er det klasse IV dendrittiske arborization sensoriske nevroner som gjenkjenner skadelige termiske og mekaniske stimuli 9 i tillegg til sin nylig oppdaget rolle som fotoreseptorene 10. Disse nevroner, som har blitt meget godt undersøkt på utviklingsnivå, arborize over barrieren epidermal arket og knytte kontakter med nesten alle epidermale celler 11,12. Singelen axon av hver klasse IV Nevron prosjekter i ventrale nerve ledningen av det sentrale nervesystemet 11 hvor de kan koble seg til andre-ordens nevroner som prosjekt til hjernen.
Under baseline forhold, nociceptive sensorisk nevrons vil ikke fyre før en relativt høy terskel er nådd. Analysene som beskrives her tillate undersøkeren å kvantifisere baseline atferdsmessige responser eller formodentlig det sensibilisering som følger følgende vevsskade. Hver analyse provoserer forskjellige, men beslektede motorisk atferdsmessige reaksjoner på skadelige termiske stimuli og tillater forskeren å visualisere og kvantifisere ulike aspekter ved termisk nociception i Drosophila larver. Analysene kan brukes til larver av ønskede genotyper eller larver hevet under ulike miljøforhold som kan påvirke nociception. Siden termisk nociception er konservert over arter, vil funnene sanket fra genetisk disseksjon i Drosophila sannsynlig informere vår forståelse av termisk nociception i andre arter, inkludert virveldyr.
Protocol
En typisk beskrivelse av de eksperimentelle skritt for å forberede normal eller UV-sensitivt larver for de to termiske nociception analysene er vist i figur 1.
1. Utarbeidelse av larver
- Mann og kvinne avkom larver av en ønsket genotype kan testes direkte. Alternativt kan en genetisk kors settes opp til å få avkom larver av en definert genotype av interesse. Sett opp kors i flasker som inneholder flue mat ved hjelp av 20-30 jomfruelige kvinner og 15-20 menn.
- 5 dager etter egg lå, høst og ren tidlig tredje instar larver ved øste ut grøtaktig flua mat og forsiktig anstrengende med rennende vann gjennom en 630 mikrometer (porestørrelse) mesh. Overfør tidlig tredje instar larver (~ 3-4 mm i lengde langs anteroposterior aksen) til en liten fuktig pute av mat for å hindre sult og dessication. Hvis nociceptive sensibilisering er å bli testet, følger etterfølgende trinn 2.1-2.11. Dersom larvene skal testes i absence av vevsskade, gå direkte til trinn 3.1.
2. Etherization og UV bestråling
- Konstruer en etherization kammer.
- Skjær bunnen av en 1,5 ml mikrosentrifuge tube.
- Med en varm metall stekespade smelte klippekanten på mikrosentrifuge røret.
- Fest en finmasket til smeltet røret overflaten og la den avkjøles. Den etherization kammeret vil tillate oppføring av eter damp men forhindrer larve rømning.
- Bruk pinsett eller en pensel til å forsiktig plassere 10 tidlig tredje instar larver inni en hjemmelaget etherization kammer.
- Plasser larver langs innsiden av lokket og tett.
Merk: De to neste trinn skal utføres i en avtrekkshette som eter er en potensielt eksplosiv kjemisk og dens damp kan anesthetize en menneskelig så vel som en larve.
- Plasser etherization kammeret inneholder larver inni en Coplin krukke inneholder en 10 ml begerglass bærer enbomullsdott dynket med ~ 1,5 ml dietyleter.
- Skru på lokket av Coplin jar å utsette larvene til ether røyk for 2 til 2,5 minutter. Vær oppmerksom på at lengre etherization ganger kan påvirke larve atferd eller overlevelse.
- Etter etherization, fjerne etherization kammeret fra Coplin glasset / begeret, som gir noen få sekunder i panseret for eter røyk å forsvinne. Du kan nå flytte fra hetten tilbake til laboratoriet.
- Bruk en vann skvett flaske til forsiktig skylle larver fra etherization kammeret i en liten petriskål.
- Bruk pinsett og en Kimwipe å klatt bedøves larver tørr og forsiktig påføre dem dorsal siden opp på en stripe av dobbeltsidig teip festet til en 3 "x 1" glass objektglass.
- Plasser lysbildet på bunnen av en UV bestråling kammer og utsette larvene for UV-lys i 6 sekunder på 20 mJ / cm 2 intensitet.
- Fordyp raset i vannet for å forsiktig flyte larvene ut av tosidige scotch tape.
- Bruk pinsett eller en pensel til å forsiktig plassere det bestrålte larver i en 15 x 45 mm en dram glass kultur hetteglass med ~ 1,0 ml flue mat der de kan komme for en variabel periode (8 -24 timer) ved 25 ° C eller andre ønsket kultur temperatur før re-høsting for termiske nociception analyser.
3. Lokal Heat Probe Assay
Vi leverer en skadelig termisk stimulans til en individuell larve kropp segment ved hjelp av en spesialbygd termisk sonde produseres av Pro-Dev Engineering (se tabell av materialer). Selv om denne sonden har optimal design funksjoner (en liten metall tuppen av ~ 0,07 mm 2 areal og evnen til nettopp å opprettholde et sett punkt temperatur fra 23 ° C til 65 ° C) i prinsippet ethvert verktøy med et lite tips som kan varmes opp til en definert temperatur for en periode på opptil 20 sekunder burde holde. Den probespiss brukes til å stimulere til tidlig 3. instar larver nettopp på dorsal midtlinjen på magen segment A4 (se figur 2). Som svar på denne termiske stimuli, vil larvene generelt utvise en motvilje tilbaketrekking oppførsel av rullende sidelengs ved 360 grader eller mer. Denne atferden er forskjellig fra deres lett berøring respons til en ikke-skadelige romtemperatur metall probe som vanligvis innebærer en kort pause i sin motorisk aktivitet 13.
Protokoll for varmen sonde analysen:
- Pre-set temperaturen i termisk sonde til ønsket settpunkt.
- Bruk en pensel eller tang for å forsiktig overføre en individuell larve på en flat plattform (vi vanligvis bruker en liten bit av vinyl snitt fra en perm) der larvene skal senere stimulert. Larven bør være dekket av en tynn film av vann før kontakt med termisk sonde. Filmen av vann dekker larven bør være så lite som mulig og helt dekke larve, samtidig som man sikrer at larven er ikke tørr ved berøring av vinyl.
- Trykk forsiktig probespiss mot larven på segmentet A4 med et lett press med spissen på rundt en 45 ° vinkel mellom sonden og overflaten av larven (se figur 2). Trykket skal føre til en svak innrykk på overflaten av larven og vil vanligvis være tilstrekkelig for å hindre bevegelse. Dersom larven fortsetter å bevege seg, bruke litt mer press og det vil som regel stoppe. Ikke ta opp data fra larver som beveger seg utover det synsfeltet, eller som konstant sonde kontakt ikke kan oppnås inntil respons eller 20 s cutoff.
- Fortsett å stimulere larven til en tilbaketrekking respons er utstilt eller inntil 20 andre cutoff er nådd, hva som inntreffer først. Svare larver typisk første viser en foreløpig oppførselen løfte hodet og halen. Dette er vanligvis fulgt av tilbaketrekning oppførsel av rullende minst 360 grader. Bare en komplett rull på 360 grader blir scoret som nocifensive atferd (den foreløpige head eller hale raise er ikke).
- Når uttaket atferden er initiert utgivelse kontakt med sonden og registrere ventetid eller tid til uttak. Hvis ingen uttak atferden er observert innen 20 sekunder, så larven er en non-responder. Responderne kan videre deles inn i 2 kategorier. Dersom uttak atferden vises innen 5 sekunder, så larven er en rask responder. Dersom uttak atferden vises mellom 5-20 sekunder, så larven er en slow-responder (se figur 1 i Babcock, et al. 2009) 1.
4. Global Heat Plate Assay
Varmen plate analysen ble designet for å måle termisk nociception i Drosophila larver når hele dyret konfrontert med en skadelig termisk stimulans. Individuell midten 3. instar larvene er plassert i en 80 mL dråpe vann på en 60 x 15 mm petriskål - se figur 3 for skjematisk og bilder av analysen settetopp. Den petriskål blir deretter plassert på en solid oppvarming blokk (referert til som "varme plate"). Som temperaturen i vannet slipp stiger, viser larven en serie på fem stereotyp atferd vi har kalt hode thrash, roll, pisk, beslag, og lammelser. Ettersom disse atferd er til en viss grad en funksjon av SetPoint temperaturen i varmen plate og volumet av vann der larvene er nedsenket vi presenterer her hva vi har funnet å være optimale forhold (95 ° C varme plate, 80 mL dråpe av vann) for å observere alle fem av atferd med minimale overlapping mellom dem.
Protokoll for varme plate analysen:
- Plasser fiberoptisk lys guider for å sikre at det er tilstrekkelig høy kontrast belysning for visning av larven. Bruk en test larve om nødvendig. Lampen strømmen skal være på lavt for å unngå ambient varme på larven som skal testes.
- Plasser oppvarming blokk i varmen plate med flat overflate opp og plasser varme platen påmikroskopet basen. Slå på varmen platen til "høy" posisjon, la ca 15 minutter til temperaturen har stabilisert seg, og juster deretter å oppnå en overflatetemperatur på 95 ° C.
- Mål 80 mL destillert vann og plassere vannet dråpe i midten av 60 x 15 mm polystyren petriskål med en micropipettor.
- Bruk pinsett til å forsiktig plassere en ren mid 3. instar larve i midten av vannet dråpe. Prøv å overføre larven med minimal mulig volum av vann slik at dråpen som skal varmes opp kan overnatte så nært som mulig til det opprinnelige 80 mL.
- Påfør petriskål inneholder vann dråpe, og larven på solid oppvarming blokk på varmen platen. Raskt justere plasseringen av fatet, slik at hele larve og slipp av vann er i sikte. Se Figur 3 og videoer 1-6.
- Starter tidtakeren i det øyeblikk petriskål plasseres på solid oppvarming blokk av varmen plate og rekordtidspunkt for start av hver atferd. Om ønskelig, kan atferd også være video-opptak - Se videoer 1-5 for representative eksempler på hver oppførsel. Leica programvareversjon 3.7 ble brukt til innspilling av film, opptaksmodus var "Kontinuerlig", var kameraets oppløsning 3 megapiksler (vi brukte 0.63x zoom som den beregnede bildeoppløsningen er 10 mikrometer / pixel) og bilder / sekund var 44,5.
5. Representative Resultater
Lokal Heat Probe Assay:
Ved kontakt med termisk sonde, viser en larve typisk en foreløpig oppførsel av løfte hodet og halen. Vanligvis løfting av hodet er sett først, etterfulgt av løfting av halen. Noen sekunder etter at denne foreløpige oppførselen larven begynner vanligvis å rulle sidelengs som vi refererer til som "motvilje uttak oppførsel." Tiden etter som foreløpig atferd eller tilbaketrekking atferd er vist kan variere etter temperatur eller GEnetic bakgrunn. I vår første studie målte vi hvor mange prosent av larvene stille motvilje uttak på ulike probe sett punkt temperatur og fant at 48 ° C var den laveste temperaturen hvor alle larver reagerte raskt (<5 s). Her rapporterer vi at det er et tak på larvestadiet termisk nociception respons (Figur 4A). 100% fast respondere er observert opp til en probe temperatur på 52 ° C. Men på 54 ° C og høyere, 90% eller mer av larvene ikke klarer å svare, selv etter 20 s av kontakt. Disse larvene ikke fortsette å flytte etter 20 s cutoff.
Som nevnt tidligere en, kan de kategoriene av tilbaketrekking oppførsel ved hver temperatur bli plottet og sammenlignes statistisk. Gitt at dette er et atferdsmessig analysen er det noen variasjon fra larve til larve og mellom individuelle brukere. For å veie opp for dette pleier vi måle 3 sett med 30 larver per test tilstand. I tillegg til den enkle kategorisering av withdrawal ventetid som vi tidligere har rapportert, rapporterer vi her at amplituden (antall ruller eller tid tilbrakt i motvilje tilbaketrekking atferd) kan også måles (se figur 4). Overraskende, synes det å være en invers sammenheng mellom input temperatur og robusthet av responsen fordi lavere temperaturer synes å provosere et høyere antall ruller (figur 4B) og mer tid i motvilje tilbaketrekning (data ikke vist). Dette kan tyde på at varigheten av eksponering for en skadelig temperatur, kan være den viktigste determinant av robusthet.
Heat Plate Assay:
Fem stereotype motorisk atferd er observert ved overdragelse av larven nedsenket i vann til varme platen. Disse er beskrevet nedenfor og vist i videoen sammen med den typiske motorisk adferd et uoppvarmet larve i vann. De gjennomsnittlige ventetider der disse atferd blir observert er vist i figur 5A, som er den gjennomsnittlige Water drop temperaturer målt for hver latency. Under optimale forhold analysen som presenteres her andelen av larver viser hvert distinkt oppførsel varierte 77-100% (Figur 5B) men noen ganger de rullende og pisket atferd er utelatt, overlapping, eller oppstå i omvendt rekkefølge. De observerte atferd, i kronologisk rekkefølge, blir beskrevet som følger, og kan bli sett i videoen til tider angitt nedenfor:
- Normal bevegelse i fravær av varme: peristaltiske locomotion ledsaget ved å søke hodebevegelser. Se video fra 06:27.
- Hode Thrash: larva flytter fort på hodet i en forover eller sideveis bevegelse. Denne bevegelsen er lik normal bevegelse i vann (se video 1), men forekommer mer rykkvis og vedvarende. Se video fra 06:40.
- Roll: Larva ruller sidelengs minst en full 360 °. Se video fra 06:50. Dette kan skjeet variabelt antall ganger og noen ganger involverer ufullstendige ruller. Ved anvendelse av scoring oppførselen vi kun teller 360 ° ruller. Denne oppførselen er den mest lik den som ses med lokal anvendelse av varmen sonde.
- Pisk: larva utstillinger raske sammentrekning-release bevegelser langs anteroposterior akse som bringe hodet veldig kort nær halen. Se video fra 07:11. Pisking er ofte observert i rask rekkefølge eller på samme tid som ruller.
- Anfall: Larva strekker seg ut langs anteroposterior akse og viser en høy frekvens hele kroppen rister oppførsel uten å bøye. Se video fra 07:25.
- Lammelse: Larva opphører bevegelse. I noen larver dette er permanent, mens andre så har en lav frekvens pulsasjon bevegelse. Se video fra 07:36.
Disse dataene antyder at temperaturen på vannet dråpen og ventetid til utbruddet av de fem røyeacteristic atferd observert ved global oppvarming av larven / vann dråpe er høyt korrelert.
Figur 1. Oversikt over eksperimentelle skritt for klargjøring og analysen av larver. Før analysering nociception med varmen sonde eller varme platen, blir larver avledet fra en bestemt lager eller genetisk kryss høstet og renset av mat. Hvis nociceptive sensitivisering (i motsetning til baseline nociception) som skal vurderes, er høsting etterfulgt av etherization (eksponering for eter), montering, UV bestråling, og en periode med bedring på utlegger mat. Høstes eller gjenvunnet larvene blir så utsatt for skadelige test temperaturer ved hjelp av enten varme sonden (lokal) eller varme platen (global) assay. Tallene refererer til deler av metoder tekst som beskriver trinn (e) vises.
Figure to. Eksperimentell satt opp for lokale varme sonde analysen. Varmen probe styres av en termisk kontroll enhet som brukes til å sette og opprettholde temperaturen i sonden. Sonden holdes vinkelrett på anteroposterior aksen og brukes til å stimulere larven i en vinkel på 45 ° til horisontalen. Probe kontakt er laget spesielt ved abdominal segment A4 som vist. Brukeren må opprettholde denne kontakten med lett press opp til 20 andre cutoff eller til rullende oppførsel starter. Hvis temperaturen blir oppfattet som skadedyr, vil larven viser en motvilje tilbaketrekking oppførsel karakterisert ved minst en 360 ° roll. Antall ruller kan være én eller flere (se figur 4B).
Figur 3. Eksperimentell satt opp for varme plate analysen. (A) Cartoon av en horisontal visning av 60 x 15 mm petriskål inneholder en mid 3. istjerne larve i en 80 mL vann dråpe. (B) Cartoon av en topp utsikt over larven plassert i midten av vannet dråpe som sett gjennom mikroskop. (C) Fotografi av en horisontal visning av arbeidsstasjon for denne analysen. (D) Fotografi av larven som sett gjennom mikroskop.
Figur 4. Kvantifisering av atferdsresponsen ved hjelp av varme sonden analysen. (A) Plot av prosent av respondere tilhører hver kategori (rask, sakte, og ikke-respondere) versus temperatur. (B) Plot av ventetid for ubehagelige uttak atferd versus antall ruller hver larve utstilt på fire forskjellige test temperaturer øker noxiousness (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C, og 52 ° C).
Figur 5. Heat plate analysen: Ventetid og temperatur vs BehAvior. (A) Latency og gjennomsnittlig vann dråpe temperaturen til hver atferdsresponsen under optimale forhold på 95 ° C (varm plate overflatetemperatur) og 80 mL dråpe vann (n = 150). Vær oppmerksom på at hver atferd er observert innenfor et bestemt tidsintervall. Water drop temperaturer ble målt ved hjelp av et termoelement satt inn enten øverst eller nederst på slipp (n = 10 dråper for hvert sted), og disse målingene ble i gjennomsnitt. (B) prosent av larvene stille hver atferdsresponsen under optimale analysen forhold. Juling, gripe, og lammelse er observert nesten 100% av tiden når du triller og pisking er observert 77 og 80% av tiden, henholdsvis. Ved lavere overflatetemperatur set poeng beslag og lammelser er ikke observert i 200 s og ved høyere settpunkt rulle og pisking kan hoppes eller kan forekomme samtidig. n = 150. (C) Prosent av larver som overlever etter initiering av lammelse oppførsel. Larvene ble oppvarmet til væreginning lammelse og deretter fjernes med vanlige kultur vilkår for å gjenopprette. Mock-behandlet larver fått tilsvarende behandling med unntak for varme eksponering. Dannelse av puppe og levedyktig voksne ble kvantifisert på dager 7-13. n = 120.
Figur 6. Inaktivering av larver nociceptive sensoriske nevroner øker atferdsresponsen ventetider. Plot av ventetid til hver atferd for de angitte genotypene: w 1118 og Gal4 109 (2) 80 = MD-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C, og md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. MD-Gal4 stasjoner uttrykk for UAS-regulerte transgener i alle fire klasser av multidendritic perifere sensoriske nevroner, UAS-Ork1.Δ-C 14 uttrykker en modifisert versjon av Drosophila åpen likeretter K + kanal kreves for synaptisk overføring, og U AS-Ork1.Δ-NC 14 uttrykker en ytterligere modifisert versjon av denne samme kanal som ikke forstyrrer synaptiske overføring. Merk at bare larvene bærer både MD-Gal4 driver 6 og UAS-Ork1.Δ-C transgener viser økte ventetider for fire av de fem observerte atferd (thrash, roll, beslag, og lammelse). Legg også merke til at på grunn av den økte ventetid for å rulle disse dyrene pisk før de ruller. Asterisk betegner p <0,05 ved Student t-test. n = 30 larver per genotype.
Supplemental Video 1. Klikk her for å se video .
Supplemental Video 2. Klikk her for å se video .
Supplemental Video 3."Target =" _blank "> Klikk her for å se video.
Supplemental Video 4. Klikk her for å se video .
Supplemental Video fem. Klikk her for å se video .
Supplemental Video 6. Klikk her for å se video .
Discussion
Analysene beskrevet her kan brukes til kvalitativt og kvantitativt vurdere larver av ulike genotyper for respons til helsefarlige termiske stimuli. En viktig funksjon i varmen sonden analysen er at stimulus gis bare på et enkelt locus. Dette fører antakelig til avfyring av bare en liten undergruppe av klasse IV nevroner-de i segmentet kontaktet av sonden og kanskje de i umiddelbart tilstøtende segmenter 11. På grunn av den lokale stimulering, etterligner varmen sonden analysen felles sensoriske opplevelsen av å oppdage en skadelig stimulus som er lokalisert til et bestemt organ region, for eksempel en hånd å kontakte en varm ovn. En ulempe med varmen sonden analysen er at det har noen bruker-til-bruker-variasjonen som kan sannsynligvis tilskrives tre forhold: i) trykket som brukeren anvender sonde til larve, ii) den nøyaktige plasseringen av sonden på larve i forhold til de underliggende nociceptive nevroner, og iii) det nøyaktige Angle hvor sonden kontakt med overflaten av larven.
Vi tidligere rapporterte en kvantitativ strategi å kategorisere larver i ikke-respondere, langsomme respondere, og raske respondenter basert på deres uttak ventetid til en gitt temperatur ett. Her rapporterer vi på larvenes respons til enda høyere temperaturer. Interessant, finner vi at det er et tak for å larver termiske nociceptive svar og at dette taket ligger mellom 52 og 54 ° C. Dette kan indikere at larvene ikke har en forbigående reseptor potensial (TRP) kanal stand gating ved temperaturer høyere enn 52 ° C. Alternativt kan det tyde på at nervecellene eller muskler som brukes til å initiere eller gjennomføre motorisk respons bli skadet før de kan selv fungere i motvilje tilbaketrekning. Vi rapporterer også en annen analyse av amplituden til uttak respons-hjelp av enten antall ruller som en indikator på "robusthet" av responsen. Naivt, enforventer at disse parametrene ville øke med økende temperatur eller tid på stimulering. Overraskende, finner vi at dette ikke er tilfelle. Larver stimulert for en lengre tid ved en temperatur på den lave enden av skadelige området (42 ° C) viser flere ruller og mer tid brukt rullende enn larver probed ved høyere temperaturer (48-52 ° C). Dette tyder på at innen den skadelige temperaturen vinduet er det først og fremst varigheten av eksponering som bestemmer amplituden av responsen. Siden larver utsettes for svært skadelige temperaturer (48-52 ° C) reagerer på gjennomsnittlig svært raskt, de ikke viser så mange ruller som larver utsettes for en mindre skadelig temperatur for en lengre tidsperiode. Analysen av responsen amplitude rapporteres her tilfører en ny kvantitativ dimensjon langs hvilke ulike genotyper eller miljømessige manipulasjoner kan sammenlignes.
En viktig funksjon i varmen plate analysen er at det innebærer en global eksponering mot skadeligevarme. Som sådan er det mer beslektet med dyret sitte i en oppvarming kittel enn berøre en varm ovn. Selv om det er ikke klart når en larve kan oppleve en globalt skadelige stimuli i naturen, i lab de atferdsmessige reaksjoner på dette global eksponering er mer komplekse enn de som ble observert ved lokal stimulering. En styrke på varmen plate analysen, også bemerket av andre 3, er at det har lite bruker-til-bruker-variabilitet siden berøre larven er ikke en del av protokollen. Den eneste betydelige avviket synes å være i definere når hver atferd starter og dette kan minimeres ved gjentatt visning / fortrolighet. En interessant forskjell mellom de analysene er de temperaturene der de aversive atferd begynne. Disse er mye lavere i varmen plate analysen enn med varmen sonde. Den foreløpige oppførsel utstilt av larver kontaktet med varme sonden (hode og hale høyning) kan være en korrelerer av hodet thrash observert på ~ 27 ° C i varmen Plate-analysen. Det er mulig at dette svaret reflekterer "ubehag" mer enn "smerte". Vi har ikke observert en korrelere med pisking, beslag, og lammelse selv ved høy (opp til 48 ° C) temperaturer i sonden analysen og det kan være at en kritisk masse av sensorisk neuron skyte fra mer enn én region av kroppen er nødvendig for å bringe på disse atferd. Interessant nok er de beslag og lammelser atferd observert ved temperaturer (~ 34 - 37 ° C) under bunnen av nociceptive terskelen observert med varmen sonden indikerer at globalt stimulering kan innebære oppsummering av nevrale responser som er utilstrekkelig til å utløse atferd med lokale anvendelsen av varmen sonde. At disse temperaturene er faktisk oppfattes som skadedyr til larvene er støttet av den observasjon at larver som begynner lammelse atferd, og deretter lov til å utvinne på utlegger mat ikke i de fleste tilfeller overlever (figur 5C). Videre støtter argumentet om at varmen plspiste analysen leser ut nociceptive responser er det faktum at blokkering synaptisk overføring i kjente nociceptive sensoriske nevroner øker ventetiden for de fleste av de observerte atferd (figur 6). Observasjonen om at det er ingen økning i ventetiden for den høyere temperaturen pisking oppførsel tyder på at andre sensoriske nevroner som ikke uttrykker MD-Gal4 kan være nødvendig for denne atferden.
I sum, begge analysene innebære å utsette et individ larve til en skadelig termisk stimulans av definerte temperatur - den varme spissen på en liten metall sonde i den lokale analysen og innlevelse i en dråpe raskt varme vann i den globale analysen. Atferdsmessige reaksjoner fra Drosophila larver av varierende genetiske bakgrunn og / eller utsatt for varierende miljøforhold (for eksempel pluss eller minus vevsskade), kan studeres og kvantifiseres ved hjelp av disse prøvene. Til syvende og sist vil resultatene fra disse analysene hjelpe oss å bedre forstå genetiske nettverk styrer NOCiception i Drosophila og andre relaterte arter.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Christian Landry for varme probe design, Daniel Babcock for utvikling av larvenes varme sonden analysen, Sean Sweeney for å foreslå varmen plate analysen, den Bloomington Drosophila Stock Center for fluefiskere bestander, og Galko lab medlemmer for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 NS069828 til MJG og en NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 til University of Houston-Downtown Scholars Academy) for mindretallet tilgang til forskning karrierer (AVG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors--noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
