Summary
I den här artikeln visar vi analyser för att studera termisk nociception i
Abstract
I den här artikeln visar vi analyser för att studera termisk nociception i Drosophila larver. En analys involverar rumsligt begränsad (lokal) stimulering av termisk nociceptorer 1,2 medan den andra innebär en grossist (global) aktivering av de flesta eller alla sådana neuroner 3. Tillsammans utgör dessa tekniker kan visualisering och kvantifiering av de beteendemässiga funktioner Drosophila nociceptiva sensoriska neuroner.
Drosophila larv är en etablerad modell för att studera termisk nociception, ett sensoriskt svar till potentiellt skadliga temperaturer som evolutionärt är konserverad mellan arter 1,2. Fördelarna med Drosophila för dessa studier är den relativa enkelheten i dess nervsystem och sofistikerade av de genetiska tekniker som kan användas för att dissekera den molekylära grunden för den underliggande biologin 4-6 i Drosophila, som i alla metazoer de response för att skadliga termiska stimuli innebär i allmänhet en "nocifensive" obehaglig tillbakadragande till den presenterade stimulans 7. Sådana stimuli detekteras genom fria nervändar eller nociceptorer och amplituden hos den organismens respons beror på antalet av nociceptorer mottar skadligt stimulus 8. I Drosophila är det klass IV dendritiska förgrening sensoriska nervceller som upptäcker skadliga termiska och mekaniska stimuli 9 i tillägg till deras nyligen upptäckt roll som fotoreceptorer 10. Dessa nervceller, som har mycket bra studerats på utvecklingsnivå, arborize över barriären epidermal arket och knyta kontakter med nästan alla epidermalceller 11,12. Den enda axon i varje klass IV neuron projekt i den ventrala nerven ur det centrala nervsystemet 11 där de kan ansluta till andra ordningens neuroner som skjuter till hjärnan.
Enligt huvudscenariot, nociceptiv sensorisk neurons kommer inte att skjuta förrän en relativt hög tröskel nås. Analyserna som beskrivs här tillåter forskaren att kvantifiera grundläggande beteendemässiga svar eller, förmodligen, sensibilisering som följer efter vävnadsskada. Varje analys framkallar olika men besläktade motoriskt beteende svar på skadliga termiska stimuli och tillåter forskaren att visualisera och kvantifiera olika aspekter av termisk nociception i Drosophila larver. Analyserna kan användas för larver av önskade genotyper eller larver upp under olika miljöförhållanden som kan påverka nociception. Eftersom termisk nociception bevaras över arter kommer resultaten erfarenheter som samlats från genetisk dissektion i Drosophila informera sannolikt vår förståelse av termisk nociception i andra arter, inklusive ryggradsdjur.
Protocol
En typisk beskrivning av de experimentella stegen för framställning av normala eller UV-sensibiliserad larver för de två termiska nociception analyser visas i figur 1.
1. Framställning av Larver
- Manliga och kvinnliga avkomma larver av en önskad genotyp kan testas direkt. Alternativt kan en genetisk kors sättas upp för att producera avkomma larver av en definierad genotyp av intresse. Ställ in kors i flaskor som innehåller fluga mat med 20-30 jungfruliga kvinnor och 15-20 män.
- 5 dagar efter äggläggningen, skörd och ren i början av tredje stadiet larver genom skopar upp mosig flugan mat och försiktigt ansträngande med rinnande vatten genom en 630 m (porstorlek) mesh. Överföra början av tredje instar-larver (~ 3-4 mm i längd utmed den anteroposteriora axeln) till en liten fuktig dyna av livsmedel för att förhindra svält och desickation. Om nociceptiv sensibilisering skall testas, följ de efterföljande stegen 2,1-2.11. Om larver som skall testas i absence av vävnadsskada, gå direkt till steg 3,1.
2. Eterisering och UV-bestrålning
- Konstruera en eterisering kammare.
- Skära bottnen av en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Med ett varmt metallspatel smälta den skurna kanten på mikrocentrifugrör.
- Anbringa ett finmaskigt till den smälta rörytan och låt svalna. Den eterisering Kammaren kommer att tillåta införsel av eter rök men hindrar larver flykt.
- Använd pincett eller en pensel för att försiktigt placera 10 början av tredje stadiet larver inne i en hemmagjord eterisering kammare.
- Placera larver längs insidan av locket och nära.
Obs: De följande två steg bör utföras i ett dragskåp som eter är en potentiellt explosiv kemisk och dess ångor kan bedöva en människa såväl som en larv.
- Placera eterisering kammare som innehåller larver inuti ett Coplin innehållande en 10 ml bägare som bär enbomullstuss indränkt med ~ 1,5 ml dietyleter.
- Skruva på locket på Coplin burken att exponera larverna till eter rök 2 till 2,5 minuter. Observera att längre eterisering tider kan inverka menligt på larver beteende eller överlevnad.
- Efter eterisering, ta bort eterisering kammaren från Coplin JAR / bägare, vilket ger några sekunder i huven för eter rök att försvinna. Du kan nu flytta från huven tillbaka till labbet.
- Använd en flaska vatten spruta försiktigt skölja larver från eterisering kammaren i en liten petriskål.
- Använd pincett och en Kimwipe att utplåna sövs larver torrt och försiktigt anbringa dem ryggsidan upp på en remsa av dubbelhäftande tejp fästs en 3 "x 1" glasmikroskopskiva.
- Placera objektglaset på bottenytan av en UV-bestrålningskammaren och exponera larver för UV-ljus under 6 sekunder vid 20 mJ / cm 2 intensitet.
- Sänk bilden i vattnet för att försiktigt flyta larver bort av den dubbelsidiga scotch tejp.
- Använd pincett eller en pensel för att försiktigt placera den bestrålade larver i en 15 x 45 mm en dram av glas kultur injektionsflaska innehållande ~ 1,0 ml fluga livsmedel där de kan återhämta sig under en variabel tidsperiod (8 -24 timmar) vid 25 ° C eller andra önskade kulturen temperatur innan de skörd för termiska nociception analyser.
3. Lokal värme Probe Assay
Vi levererar ett skadligt termisk stimulans för en enskild larvkroppen segment med hjälp av en specialbyggd termisk sond tillverkad av Pro-Dev Engineering (se tabell material). Även om denna sond har optimala design (en liten metall spets ~ 0,07 mm 2-område och förmågan att exakt hålla en temperatur börvärde från 23 ° C till 65 ° C) i princip varje verktyg med en liten spets som kan värmas till en definierad temperatur under en period av upp till 20 sekunder bör räcka. Sondspetsen används för att stimulera 3: e stadiet larver just på dorsal mittlinje på buken segment A4 (se figur 2). Som svar på denna termiska stimulans kommer larverna uppvisar i allmänhet en aversiv tillbakadragande beteende rulla sidled 360 grader eller mer. Detta beteende skiljer sig från deras lätt beröring svar på ett icke-skadlig rumstemperatur metallsond som i allmänhet innebär en kort paus i sin motoriskt verksamhet 13.
Protokoll för värme sonden analysen:
- Förinställda temperaturen hos den termiska proben till önskad inställningspunkt.
- Använd en pensel eller tång för att försiktigt föra en enskild larv på en plan plattform (vi brukar använda en liten bit vinyl fraktion från ett bindemedel) på vilken larverna kommer därefter stimuleras. Larven bör omfattas av en tunn film av vatten innan kontakten med den termiska sonden. Filmen av vatten som täcker larven bör vara så lite som möjligt och helt täcka larven, samtidigt som larven inte är torr när du tar i vinyl.
- Tryck försiktigt sondspetsen mot larven på segmentet A4 ett lätt tryck med spetsen i ungefär 45 ° vinkel mellan sonden och ytan av larven (se figur 2). Trycket bör förorsaka en lätt fördjupning på ytan hos larven och kommer vanligtvis att vara tillräcklig för att förhindra förflyttning. Om larven fortsätter att röra sig, använda något högre tryck och det slutar vanligen. Spela inte data från larver som rör sig bortom synfältet eller som ständig sond kontakt inte kan uppnås förrän reaktion eller 20 s cutoff.
- Fortsätta stimulera larven tills ett uttag svar ut eller tills 20 sekunder cutoff nås, som inträffar först. Svara larver vanligtvis först visar en preliminär beteende lyfta huvudet och svansen. Detta följs vanligen av indragning beteende rullande minst 360 grader. Endast en komplett rulle 360 grader noteras som nocifensive beteende (det preliminära heaD eller svansen höjning inte är).
- När uttag beteendet initieras utsläpp kontakt med sonden och registrera latens eller tid att uttag. Om ingen återkallelse beteende observeras inom 20 sekunder, då larven är en icke-responder. De som svarade kan ytterligare delas in i 2 kategorier. Om tillbakadragandet beteendet visas inom 5 sekunder, sedan larven är en snabb-responder. Om tillbakadragandet beteendet visas mellan 5-20 sekunder, sedan larven är en långsam-responder (se figur 1 i Babcock et al. 2009) 1.
4. Globala Värme plattanalys
Värmen Plattan analysen utformad för att mäta termisk nociception i Drosophila larver när hela djuret konfronteras med en skadlig termisk stimulans. Individuell mitten 3: e stadiet larver placeras i en 80 ^ droppe vatten på en 60 x 15 mm petriskål - se figur 3 för schema och bilder av analysen uppsättningenupp. Petriskålen placeras sedan på en fast värmeblock (hänvisad till som "värmeplatta"). När temperaturen stiger vattendroppe, uppvisar larven en serie av fem stereotypa beteenden vi har kallat huvudet thrash, rulle, piska, beslag, och förlamning. Eftersom dessa beteenden är i viss utsträckning en funktion av börvärdestemperaturen av värmen plattan och volymen av vatten i vilket larven nedsänkes vi presenterar vad vi har funnit vara de optimala betingelserna (95 ° C värme plattan, 80 | il droppe vatten) för att observera alla 5 av de beteenden med minimal överlappning mellan dem.
Protokoll för värme plattanalys:
- Placera de fiberoptiska ljusledare att se till att det finns tillräckligt med hög kontrast belysning för visning larven. Använd ett test larv om det behövs. Den lätta strömmen bör vara på låg för att undvika omgivande värme på larven, som skall testas.
- Placera värmeblocket i värmen plattan med plan yta och placera värmen plattan påmikroskopet bas. Slå på värmeplatta med "Hög"-läge, tillåter ca 15 minuter för temperaturen att stabilisera och justera följaktligen att åstadkomma en yttemperatur av 95 ° C.
- Mät 80 il destillerat vatten och placera vattendroppe i mitten av 60 x 15 mm polystyren petriskål med en mikropipett.
- Använd pincett för att försiktigt placera en ren mitt 3: e instar larven i mitten av vattnet droppe. Försök att överföra larven med den minimala möjliga volym vatten så att droppen skall uppvärmas förblir så nära som möjligt till den ursprungliga 80 | il.
- Placera försiktigt petriskålen innehåller vattendroppe och larven på den fasta värmeblocket på värmen plattan. Snabbt justera placeringen av skålen så att hela larv och droppe vatten är i sikte. Se figur 3 och videor 1-6.
- Starta timern i det ögonblick petriskålen placeras på den fasta värmeblocket i en värmeplatta och registreratiden för början av varje uppträdande. Om så önskas kan beteenden även video inspelad - Se videoklipp 1-5 för representativa exempel på varje beteende. Leica programversion 3,7 användes för att registrera filmerna var inspelningsläge "Continuous", var Kameraupplösning 3 megapixel (vi använde 0.63x zoom med vilket den beräknade bildupplösningen är 10 m / pixel) och bildrutor / sekund var 44,5.
5. Representativa resultat
Lokal värme Probe Assay:
Vid kontakt med den termiska sonden, visar en larv typiskt en preliminär beteende lyfta huvudet och svansen. Typiskt lyft på huvudet ses först, följt av att lyfta på svansen. Några sekunder efter denna preliminära beteendet larven börjar vanligtvis rullar i sidled som vi kallar "obehaglig tillbakadragande beteende." Den tid efter vilken den preliminära beteende eller indragning beteendet som visas kan variera beroende på temperatur eller GEnetisk bakgrund. I vår första studie mätte vi andelen larver uppvisar aversiv uttag vid olika punkt probuppsättning temperaturer och fann att 48 ° C var den lägsta temperatur vid vilken alla larver svarade snabbt (<5 s). Här rapporterar vi att det finns ett tak för larver termiska nociception svar (Figur 4A). 100 procent snabba svarat observeras upp till en sond temperatur av 52 ° C. Emellertid, vid 54 ° C och högre, 90% eller mer av larverna misslyckas att reagera med efter 20 s i kontakt. Dessa larver inte fortsätter att flytta efter 20 s cutoff.
Som tidigare nämnts 1, kan de kategorier av tillbakadragande beteende, vid varje temperatur ritas och jämföras statistiskt. Med tanke på att detta är en beteendevetenskaplig analys finns en viss variation från larv till larv och mellan enskilda användare. För att beakta detta har vi brukar mäta 3 uppsättningar av 30 larver per test skick. Förutom den enkla kategoriseringen av withdrawal latency som vi tidigare har rapporterat, rapporterar vi här att amplituden (antal rullar eller tid tillbringas i aversiv tillbakadragande beteende) kan också mätas (se figur 4). Överraskande, tycks det finnas ett omvänt förhållande mellan ingången temperaturen och robusthet svar eftersom lägre temperaturer verkar framkalla en högre antal rullar (figur 4B) och mer tid tillbringas i aversiv tillbakadragande (data visas ej). Detta kan tyda på att varaktigheten av exponering för en skadlig temperatur kan vara den viktigaste faktorn för robusthet.
Värme plattanalys:
Fem stereotypa motoriskt beteende observeras vid överföring av larven nedsänkt i vatten för att värmen plattan. Dessa beskrivs nedan och visas i videon tillsammans med den typiska motoriskt beteende ett ouppvärmt larv i vatten. De genomsnittliga latensen vid vilken dessa beteenden observeras visas i figur 5En, som är medeltalet av vattendroppen temperaturer som uppmätts för var latens. Under optimala analysförhållanden presenteras här andelen av larver visa varje enskild beteende varierade från 77 till 100% (figur 5B) men ibland böljande och piska beteenden utelämnas, överlappning eller förekommer i omvänd ordning. De observerade beteenden, i kronologisk ordning, beskrivs enligt följande och kan ses i videon vid de tider som anges nedan:
- Normal rörelse i avsaknad av värme: Peristaltic transport tillsammans genom att söka huvudrörelser. Se Video från 6:27.
- Huvudet Thrash: Larva förflyttas huvudet snabbt i en framåt eller rörelse i sidled. Denna rörelse liknar deras normala rörelseförmåga i vatten (se Video 1) men inträffar mer ryckigt och ihärdigt. Se Video från 6:40.
- Roll: Larva rullar i sidled minst ett 360 °. Se Video från 6:50. Detta kan inträffaett varierande antal gånger och ibland innebär ofullständiga rullar. För att göra poäng beteendet vi bara räknar fulla 360 ° rullar. Detta beteende är den mest liknar den som ses med lokal applicering av värmen sonden.
- Whip: Larva uppvisar snabb kontraktion frisättning rörelser längs anteroposterior axel som föra huvudet mycket kort nära svansen. Se Video från 7:11. Vispning observeras ofta i snabb följd eller samtidigt som valsning.
- Beslag: Larva sträcker ut längs den anteroposteriora axeln och uppvisar en hög frekvens hela kroppen skakade beteende utan att böja. Se Video från 7:25.
- Förlamning: Larva upphör rörelse. I vissa larver detta är permanent, medan andra så uppvisar en låg rörelse frekvens pulsering. Se Video från 7:36.
Dessa data antyder att temperaturen hos vattendroppen och latensen till inträde av de fem koltika beteenden observerades vid global uppvärmning av larven / vatten droppe är starkt korrelerade.
Figur 1. Sammanfattning av experimentella stegen för beredning och analys av larver. Före analys nociception med värme sonden eller det värme plattan, är larver härledda från en särskild lager eller genetisk tvär skördades och rengöras av livsmedel. Om nociceptiv sensibilisering (i motsats till baseline nociception) ska bedömas, är skörd följt av eterisering (exponering för eter), montering, UV-strålning, och en period av återhämtning på fluga mat. Skördas eller återvinnas larver utsätts sedan för skadliga testtemperaturer antingen med hjälp av värme sond (lokal) eller värme-platta (globala)-analys. Siffrorna hänvisar till avsnitt av de metoder text som beskriver steget (s) visas.
Figure 2. Experimentell inrättas för lokala värme prob analys. Värmen sond styrs av en termisk styrenhet som används för att ställa in och bibehålla temperaturen hos sonden. Sonden hålls vinkelrätt mot den anteroposteriora axeln och används för att stimulera larven i en vinkel av 45 ° mot horisontalplanet. Sond kontakt sker speciellt till buken segment A4 som visas. Användaren måste upprätthålla denna kontakt med lätt tryck fram till 20 sekunder cutoff eller tills den rullande beteendet börjar. Om temperaturen uppfattas som skadliga, kommer larven visar en aversiv tillbakadragande beteende kännetecknas av minst en 360 ° rulle. Antalet valsar kan vara enkel eller multipel (se figur 4B).
Figur 3. Experimentell uppställning för värme plattanalys. (A) Tecknad film av en horisontell bild av 60 x 15 mm petriskål med en mitten 3 aistjärnan larv i ett 80 il vatten droppe. (B) tecknad av en vy ovanifrån av larv placerades i mitten av vattendroppen som betraktas genom mikroskopet. (C) Fotografi av en horisontell vy av arbetsstationen för denna analys. (D) Fotografi av larven ses som genom mikroskopet.
Figur 4. Kvantifiering av beteendegensvar användning av analysen värme-proben. (A) diagram av procent av responders tillhör varje kategori (snabbverkande, långsamt, och icke-responders) mot temperatur. (B)-kurva för latensen till aversiv tillbakadragande beteende mot antalet rullar varje larv uppvisade vid fyra olika testtemperaturer av ökande skadlighet (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C, och 52 ° C).
Figur 5. Värme plattanalys: Latency och temperatur vs BehAvior. (A) latens och genomsnittlig vattendroppe temperaturen till varje beteendegensvar under optimala betingelser för 95 ° C (varm platta yttemperatur) och 80 | il droppe vatten (n = 150). Observera att varje uppträdande observeras inom ett särskilt tidsintervall. Vattendroppe temperaturerna mättes med en termoelement insatt i antingen toppen eller botten av droppen (n = 10 droppar för varje plats) och dessa mätningar medelvärde. (B) Procent av larver uppvisar varje beteendeterapi svar under optimala analysförhållanden. Kok stryk, beslag, och förlamning observeras nästan 100% av tiden, medan rullning och piska observeras 77 och 80% av tiden, respektive. Vid lägre yttemperatur börvärden beslag och förlamning är inte observeras inom 200 s och vid högre börvärden rullning och piska kan hoppas över eller kan inträffa samtidigt. n = 150. (C) Procent av larver som överlever efter initiering av förlamning beteende. Larver upphettades tills vararensning förlamning och därefter avlägsnas med standardförfaranden odlingsbetingelser att återhämta sig. Mock-behandlade larver fick samma behandling förutom för värme exponering. Bildning av puppor och livskraftiga vuxna kvantifierades dag 7-13. n = 120.
Figur 6. Inaktivering av larver nociceptiva sensoriska neuroner ökar beteendemässiga svar latenser. Plot av latensen att varje uppträdande under de angivna genotyper: w 1118, GAL4 109 (2) 80 = MD-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / ^, UAS-Ork1.Δ-NC / +, MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C och md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. MD-Gal4 driver fram uttryck av UAS-reglerade transgener i alla fyra klasser av multidendritic perifera sensoriska neuroner, UAS-Ork1.Δ-C 14 uttrycker en modifierad version av Drosophila öppen likriktaren K +-kanal erfordras för synaptisk överföring, och U AS-Ork1.Δ-NC 14 uttrycker en ytterligare modifierad version av denna samma kanal som inte interfererar med synaptisk överföring. Observera att endast larver bär både MD-Gal4 driver 6 och UAS-Ork1.Δ-C transgener visar ökade latenser för fyra av de fem observerade beteenden (thrash, rulla, beslag, och förlamning). Observera också att på grund av den ökade latens rullande dessa djur piskan innan de rulla. Asterisken betecknar p <0,05 enligt Students t-test. n = 30 larver per genotyp.
Kompletterande Video 1. Klicka här för att titta på video .
Kompletterande Video 2. Klicka här för att titta på video .
Kompletterande Video 3."Target =" _blank "> Klicka här för att se video.
Kompletterande Video 4. Klicka här för att titta på video .
Kompletterande Video 5. Klicka här för att titta på video .
Kompletterande Video 6. Klicka här för att titta på video .
Discussion
Analyserna som beskrivs här kan användas för att kvalitativt och kvantitativt bedöma larver av olika genotyper för lyhördhet för skadliga termiska stimuli. En viktig aspekt av den värme som sonden analysen är att stimulans ges endast vid ett enda ställe. Detta leder sannolikt till bränning av endast en liten undergrupp av klass IV neuroner-de i segmentet i kontakt med sonden och kanske de i omedelbart intilliggande segment 11. På grund av den lokala stimulering, härmar den värme-probanalys den gemensamma sensorisk upplevelse av att detektera en skadlig retning som är lokaliserad till ett visst organ regionen, t.ex. en handen bringa en varm ugn. En nackdel med det värme-probanalys är att det ej har någon användare-till-användare variabilitet som sannolikt kan tillskrivas tre faktorer: i) det tryck med vilket användaren är tillämpligt sonden till larv, ii) det exakta läget för sonden på larven i förhållande till de underliggande nociceptiva neuroner och, iii) den exakta angle, vid vilken sonden i kontakt med ytan hos larven.
Vi har tidigare rapporterat en kvantitativ strategi kategorisera larver i icke-responders, långsamma responders och snabba responders baserat på deras tillbakadragande latens till en viss temperatur 1. Här rapporterar vi om larver lyhördhet för ännu högre temperaturer. Intressant, tycker vi att det finns ett tak för larver termiska nociceptiva svar och att detta tak ligger mellan 52 och 54 ° C. Detta kan tyda på att larver inte har en övergående receptor potential (TRP) kanal som kan slussning vid temperaturer högre än 52 ° C. Alternativt kan det tyder på att de nervceller eller muskler som används för att initiera eller utföra motorisk respons skadas innan de ens kan fungera i aversiv tillbakadragande. Vi rapporterar också en annan analys av amplituden för den tillbakadragande respons-användning av antingen antalet rullar som en indikator på den "robusthet" av svaret. Naivt, enskulle förvänta att dessa parametrar skulle öka med ökande temperatur eller tid av stimulering. Överraskande, finner vi att detta inte är fallet. Larver stimulerades under en längre tid vid en temperatur i den lägre delen av den skadliga intervallet (42 ° C) åskådliggör ytterligare rullar och mer tid valsning än larver sonderades vid högre temperaturer (48-52 ° C). Detta antyder att i den skadliga temperaturfönster det primärt är exponeringstiden, som bestämmer amplituden hos responsen. Eftersom larver exponeras för starkt skadliga temperaturer (48-52 ° C) reagera i genomsnitt mycket snabbt, de inte uppvisar så många valsar som larver exponeras för en mindre skadlig temperatur under en längre tidsperiod. Analysen av svaret amplituden redovisas här ger en kvantitativ dimension längs vilken olika genotyper eller miljö manipulationer kan jämföras.
En viktig aspekt av den värme som plattan analysen är att det handlar om en global exponering för skadligavärme. Som sådan är det mer liknar djuret sitta i en värme-gryta än att röra en het spis. Även om det är oklart när en larv kan uppleva ett globalt skadlig stimulans i naturen, i labbet beteendemässiga svaren till denna globala exponering är mer komplicerade än de som observerats vid lokal stimulering. En styrka av värmen plattan analysen, också noterat av andra 3, är att den har lite användare till användare variabilitet sedan röra larven inte är en del av protokollet. Den enda betydande variationen verkar vara att definiera när varje beteende inleds och detta kan minimeras med upprepad visning / kännedom. En intressant skillnad mellan analyserna är de temperaturer vid vilka de aversiva beteenden börja. Dessa är mycket lägre i den värme plattanalys än med värme-sonden. Den preliminära beteende som uppvisas av larver i kontakt med det värme-sond (huvud och svans höjning) kan vara en korrelera av huvudet trash observerades vid ~ 27 ° C i värme plate-analys. Det är möjligt att detta svar speglar "obehag" mer än "smärta". Vi har inte observerat ett nödvändigt korrelat för piska, beslag, och förlamning även vid hög (upp till 48 ° C) temperaturer i värmen sonden analysen och det kan vara att en kritisk massa av sensoriska neuron bränning från mer än en region av kroppen är krävs för att dessa beteenden. Intressant är beslag och förlamning beteenden observerades vid temperaturer (~ 34 till 37 ° C) under den nedre änden av nociceptiv tröskeln observerats med värmen proben indikerar att den globala stimulering kan innebära summering av neuronala svar som är otillräckliga för att utlösa beteendet med lokala applicering av värme sonden. Dessa temperaturer är i själva verket ses som skadliga för larverna stöds av observationen att larverna att påbörja förlamning beteende och därefter fick återhämta på fly livsmedel inte i de flesta fall överleva (figur 5C). Ytterligare stöd för argumentet att värmen PLåt analysen utläsning nociceptiva svaren är det faktum att blockering av synaptisk överföring i kända nociceptiva sensoriska neuroner ökar latensen för de flesta av de observerade beteendena (figur 6). Observationen att det inte finns någon ökning latens för den högre temperatur piska beteende tyder på att andra sensoriska nervceller som inte uttrycker MD-Gal4 kan krävas för detta beteende.
Sammanfattningsvis båda analyserna innebär att utsätta en individ larv till en skadlig termisk stimulans definieras temperatur - den heta spetsen av en liten metall sond i den lokala analysen och nedsänkning i en droppe snabbt värma vatten i den globala analysen. Beteendemässiga svaren hos Drosophila larver av varierande genetiska bakgrunder och / eller utsätts för varierande miljöförhållanden (t ex plus eller minus vävnadsskada), kan studeras och kvantifieras med användning av dessa analyser. I slutändan kommer resultatet från dessa analyser att hjälpa oss att bättre förstå genetiska nätverk som styr NOCiception i Drosophila och andra besläktade arter.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Christian Landry för värme prob design, Daniel Babcock för att utveckla larver analysen värmen sond, Sean Sweeney för att föreslå analysen värmen platta, Bloomington Drosophila Stock Center for flyga bestånd och Galko lab medlemmarna för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH R01 NS069828 att MJG och NIH MARC U-STAR träningsprogram Grant (T34GM079088 till University of Houston-Downtown Scholars Academy) för minoriteternas tillgång till forskarkarriären (AVG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors--noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
