Summary
ECIS / Такси система автоматизирована, в режиме реального времени анализ, который измеряет сотовой хемотаксис. В данном анализе клетки перемещаются под слоем агарозы, чтобы прийти к целевой электрода. Сотовые движения измеряется начала сопротивления переменного тока 0.
Abstract
Сотовые движения в ответ на внешние раздражители имеет фундаментальное значение для многих клеточных процессах, включая заживления ран, воспалений и ответ на инфекцию. Общий метод измерения хемотаксис является Бойден анализа камеру, в которой клетки и хемоаттрактантный разделены пористой мембраной. Как клетки мигрируют через мембрану в сторону хемоаттрактантный, они придерживаются в нижней части оболочки, или осенью в основных средствах массовой информации, и впоследствии окрашиваются и визуально считается 1. В этом методе клетки подвергаются воздействию крутой и переходные хемоаттрактантный градиент, который считается бедным представление градиента в тканях 2.
Другой анализ системы, под-агарозы хемотаксис анализ, 3, 4 меры клетки движение по твердой подложке в тонкую водную пленку, образует под слоем агарозы. Градиент, который развивается в агарозном мелкий и считается приложениеropriate представление естественного градиента. Хемотаксис может быть оценена микроскопических изображений расстояния. Оба анализа Бойден камеру и под-агарозы анализа, как правило, настроены как конечная точка анализа.
Автоматизированная ECIS / Такси система сочетает в себе под-агарозы подход с электрическим Cell-подложка сопротивление зондированию (ECIS), 5, 6. В данном анализе целевой электроды расположены в каждом из 8 камер. Большое контр-электрод проходит через каждого из 8 камер (рис. 2). Каждая камера заполнена агарозой и два небольших скважин разреза в агарозном по обе стороны от целевого электрода. Одна скважина заполняется клеточной популяции тест, а другой держит источников диффундирующих хемоаттрактантный (рис. 3). Ток проходит через системы может быть использован для определения изменения сопротивления, которое происходит в клетках проходит над объектом электрода. Клетки на целевой электродыE повышают устойчивость системы 6. Кроме того, быстрые изменения сопротивления представляют собой изменения во взаимодействии клеток с поверхности электрода и свидетельствуют о текущих клеточные изменения формы. ECIS / Такси система измерения движения популяции клеток в реальном времени, в течение длительного периода времени, но также достаточно чувствительны, чтобы обнаружить прибытие из одной клетки в цель электрода.
Dictyostelium discoidium, как известно, мигрируют в присутствии фолиевой кислоты градиент 7, 8 и хемотаксиса ответ может быть точно измерена по ECIS / такси 9. Хемотаксис лейкоцитов в ответ на SDF1α и хемотаксис антагонистов также были измерены с ECIS / 10 Такси 11. Пример лейкоцитарной реакции на SDF1α показано на рисунке 1.
Protocol
1. ECIS / Такси электрода подготовка
- Золотой поверхности ECIS / такси электрод массив (состоящий из 8 камер на слайд) сначала стабилизировать предварительная обработка стерильным 10 мМ цистеина в дистиллированной воде (DH 2 O) в течение 15 мин при комнатной температуре в стерильных условиях.
- Аспирируйте цистеин решение от каждого электрода камеры, промыть 3 раза стерильной дН 2 O, а также заменить 250 мкл полной среды (RPMI 1640, 10% FBS, 25 мМ HEPES буфера).
- Подключите электроды массив связаться с контактами на инструмент держатель массив электродов для выполнения проверки.
- Палаты, что правильно подключены будут выделены зеленым цветом на экране компьютера. Если камеры будут выделены красным цветом, они не связаны и электрод должен быть повторно расположены в массиве держатель для установления контактов для всех камер.
- После того как все камеры подключены, нажмите на кнопку "Проверить" в программном обеспечении контроллеров для сдерживаниямое первоначальное сопротивление и емкость значения для каждой камеры. Значения сопротивлений должны быть от 1600 до 2000 Ом и емкость значения должны быть между 5 и 6 нанофарад на 8 камеры массива. Если камера не входит в эти рамки приемлемых параметров, отдельные камеры не должны использоваться для сбора данных.
- Отключите электрод из массива держатель для подготовки отдельных камер агарозы. Аспирируйте среды из камеры и мыть каждую камеру в 3 раза стерильной дН 2 O.
2. Подготовка агарозном палаты
- В стерильной 15 мл полипропиленовые конические трубки, мера 0,03 г Seakem GTG агарозы и добавляют 1 мл стерильной PBS. Замена труб крышка неплотно, и растопить агарозы в автоклаве в течение 2 мин цикл жидкости (температура плавления в микроволновой печи не является эффективным для этого теста). Этот короткий промежуток времени не растает коническую трубку. Для менее требовательных клетки, которые не нуждаются в сыворотке культуры (например, Dictyostelium discoideum) 0,5%агарозы может быть сделано в соответствующей среде и растаял в микроволновой печи. Автоклава необходимо для клеток, которые требуют сыворотки, так как это будет, если денатурировали растаял в микроволновой печи.
- Добавьте 5 мл полной среды RPMI нагревают на водяной бане (55 ° -60 ° C) непосредственно к горячей агарозы, до конечной концентрации 0,5% агарозы и пипетки и осторожно перемешать.
- Внесите 300 мкл расплавленной средой агарозы в каждой камере, заменить ECIS / крышка такси массива и позволяет геля при комнатной температуре.
- Внесите остальные агарозы в крышку 15 мл трубку для оценки агарозном гелеобразования. Этот избыток агарозном также будет использоваться в части 4: Сокращение скважин в агарозы.
3. Строительство и резкости Канюля Ну режущий инструмент
- Резкость два 14 калибровочных тупой конец канюли, используя 5/64 "немного. Поверните кончик сверла в каждой канюля открытия с медленным дрели, убедившись, что сверло режет весь интерьер край каждого канюля опуширение, чтобы сформировать острым режущим краем (рис. 4а).
- Просверлите два отверстия, через 1 "х 2" х ¼ "плексигласа (рис. 4В-D) с 5/64" бит в сверлильный станок. Вставьте каждый заостренными 14 калибра канюля чтобы она выступала на равном расстоянии через каждые оргстекла отверстие.
4. Резка Уэллс в агарозном
- Стерилизовать 14 калибра канюли, слегка пылающего подсказки. До резки скважин в камере ECIS, позволяют канюли остыть до комнатной температуры или охлаждения канюли, касаясь агарозы в крышку 15 мл трубку. Если температура канюли слишком высока, агарозы будет таять, как камера скважин вырезать, оказание скважин деформаций и дефектной.
- Совместите канюля пара над двумя золотыми точками окружающем мишень электрод в каждой камере (рис. 2 и 5). Вставьте канюлю вертикально, без горизонтального движения, останавливаясь на нежный контакт между канюли иповерхности электрода. Осторожно удалите канюлю, опять же, без горизонтального перемещения. Размещение дополнительных скважин для противостояния градиенты можно также с реконфигурации джиг канюли.
- Осторожно аспирации вилку агарозном оставленные канюлю, используя стерильные 9 "пипетки Пастера, связанные с низким давлением вакуума, вакуумная ловушка ловить агарозном отходов.
- Добавить 300 мкл полной среды RPMI на поверхности каждой камере при температуре 37 ° C, в течение 2 мин для насыщения агарозы, а затем аккуратно аспирации средствах массовой информации с поверхности и скважин, не нарушая агарозы.
5. Загрузка Уэллс
- Каждая скважина способна удерживать объемом 7 мкл. Для одной скважины в каждой камере, добавить 7 мкл суспензии клеток. Для Jurkat Т-клеток с помощью 2 x10 7 клеток / мл. Эти клетки будут реагировать на 7 мкл 200 нг / мл SDF-1α разводят в неполном RPMI, в которой нет сыворотки. Используйте полный СМИ только как негативное продолжениеРОЛ.
- После того, как скважины были загружены, просмотр каждой камеры массива с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что все скважины были вырезать и заполнить правильно. Клетки должны быть в пределах границ скважины. Если они видели в обеих скважинах, или распространяются за пределы клетки и границы, то разрыв формируется под агарозы. Обратите внимание, что неправильно создавать скважин, а данные не могут быть надежно интерпретированы от камеры.
6. Сбор данных
- Поместите электрод в держатель массив и заново подключить золотые накладки на электрод массив пружинным пого контакты владельца и нажмите кнопку "Настройка". Скважин, которые подключены правильно будет выделена зеленым цветом. Если скважины красные, они не связаны и электродом должна быть приложена в массиве владельца.
- Выберите "8WE1" (8 и 1 электрод) из выпадающего меню в панели программного обеспечения для указания конфигурации массива.
- Выберите "галочку" в программном обеспечении контрол панели определить начальное сопротивление и емкость значения для каждой скважины. Значения сопротивления должны быть от 1600 до 2000 Ом, а емкость значения должны быть между 5 и 6 нанофарад.
- Выберите несколько частот для измерения сопротивления на нескольких частотах. Существует возможность выбора настройки частот, или с помощью набора рекомендованных частотах. Стандартные настройки нескольких приобретение частоты сбора данных в 11 заданных частотах (52.5, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000, 8000, 16000, 32000 и 64000 Гц) в размере 8 скважин / мин. Интервал между измерениями может быть изменен. Сбор данных нескольких частот позволяет для анализа емкости, сопротивления и сопротивления. Сбор значений сопротивления на 4000 Гц, обычно достаточно для млекопитающих исследования хемотаксиса клетки, но дополнительные частоты могут предоставить информацию в других контекстах 12,13.
- Общая продолжительность эксперимента может быть установлен на правой рукепанели или эксперимента может быть остановлена вручную, нажав кнопку "Готово" раз клетки производятся сопротивление, что свидетельствует о прибытии на электроде. Время, необходимое для клеток, чтобы прийти к электроду зависит от типа клеток используется.
- Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать сбор данных.
7. Управление данными
- Хотя эти данные могут быть экспортированы в Excel, программное обеспечение ECIS 1600R, которая сопровождает ECISθ система является наиболее эффективным методом для анализа ECIS / Такси данных.
- Программное обеспечение для анализа данных панель инструментов содержит переключатель Z, R, В и С. Эти определения сопротивления, сопротивления, емкости и, соответственно, откладывается по вертикальной оси по отношению к оси Х (прошедшее время).
- ECIS / Такси данные наиболее эффективно отображаться в виде сопротивления с течением времени при 4000 Гц. Быстрые колебания сопротивления, или microtransients (рис. 1), свидетельствуют о сотовых движение за электродом. Компиляция, оГ биннинга точек данных, так что не все точки на графике, не рекомендуется для ECIS / такси, так как это будет средний microtransients из данных.
- После того, граф был сделан с ECIS1600R программное обеспечение, оно может быть экспортировано, выбрав "экспорт графе" из меню Файл, и сохранить как. Или TIF. JPG файлов.
8. Представитель Результаты
Сотовые хемотаксис свидетельствует увеличение сопротивления при 4000 Гц. Появление клеток на целевой электрода свидетельствует и появление резких колебаний сопротивления называется microtransients или микродвижения, как описано в Opp и др.. др.., 2009 (рис. 1) 14. Отрицательный результат свидетельствует последовательное или небольшое снижение, в сопротивление при 4000 Гц, как показано на красный на рисунке 1. Отсутствие microtransients также является признаком отсутствия клеточного движения электрода. Увеличение сопротивления непосредственно пропропорциональна числу клеток, которые пересекают электрод 10. Кроме того моноклональных антител, специфичных для хемоаттрактантный или токсины известны вмешиваться рецепторов G белком может заблокировать хемотаксис 11.
Рисунок 1. Хемотаксис прав Jurkat Т-клеток в ответ на SDF1α. Человека Jurkat Т-клеток (2.0x10 6 клеток / мл) подвергались градиенту SDF-1α (начиная с концентрации 100 нг / мл) или RPMI 1640 в качестве отрицательного контроля. Нормированный сопротивление при 4000 Гц графике. Человека Jurkat Т-клеток переехали в ответ на SDF-1α, о чем свидетельствует увеличение сопротивления и microtransients, в то время не было замечено движение с воздействием RPMI 1640.
Рисунок 2. Вид сверху ECIS / Такси электродов withouт агарозы. Каждый ECIS / Такси электрод состоит из 8 отдельных камерах. Каждая камера разделяет большой электрод (а), и содержит отдельные электрод цель (б). Каждая камера имеет 2 золотые круги (с), которые используются в качестве ориентира при обработке скважин в агарозном с канюли. Золотые квадраты (D) контактных площадок, которые подключаются к пого контакты для того, чтобы применить переменный ток на электрод. Отдельные электроды целевой каждый в цепь с большим счетчиком электрод (е).
Рисунок 3. Две скважины нарезать каждый агарозном заполненные камеры. Когда хемоаттрактантный добавляется один хорошо рассеивает его для создания градиента в агарозы, с самой высокой концентрацией chemoattract ближе к хемоаттрактантный хорошо. Клетки перемещаются под агарозы в сторону более высоких концентраций хемоаттрактантный и может пройти над целью электрода. Какклетки пересечь целевой электрода, увеличение сопротивления записывается ECIS 1600R программного обеспечения.
Рисунок 4. Размещение двух 14 калибра канюли в плексигласа. А) 5/64 "сверло используется для заточки кончика канюли. Б) Два отверстия должны быть просверлены в плексигласа для размещения 14 калибра канюли в соответствии с форматом кадра. C) Используйте сверлильный станок для обеспечения отверстия перпендикулярно в pleixglass поверхности. D) два заостренными Канюли вводятся через ¼ "оргстекло 2 мм друг от друга (измеряется от внутренних краев). Эти заостренные канюли тщательно вставлена в агарозном сократить скважин.
Рисунок 5. Выравнивание канюли с золотыми точками в ECIS / Такси камеры. Чтобы сократить скважин, заостренной канюли должныпривести в соответствие с золотыми точками фланговые целевого электрода в нижней части ECIS / Такси камеры. Канюли должны быть вставлены вертикально, без горизонтального перемещения, а также снимается в том же порядке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Новые характеристики ECIS / Такси анализа включают ее возможность автоматизировать сбор данных в реальном времени, как клетки реагируют на хемоаттрактантный. В то время как наиболее употребительных применения этой технологии заключается в измерении клеточных реакций на отдельные градиенты хемотаксиса, или градиент состоит из смеси хемотаксис агонистов и антагонистов, ECIS / Такси подход также поддаются изменениям в этих конфигураций, которые могут быть весьма полезны в Оценка клеточного реагирования. Существует хорошее доказательство того, что перекрытия или последовательного градиент может влиять на клеточный поведения в новых направлениях. Более того, вполне вероятно, что эти более сложные градиенты являются нормой на месте 12, 13.
ECIS / Такси анализ можно включить моделирование этих различных конфигурациях градиент таким образом, что не возможно с другими технологиями. Например, путем добавления дополнительных скважин, можно распределить ориентации гradient (ы) по отношению к клетке так и целевого электрода. Кроме того, можно настроить анализ разместить клетки в одной из скважин в качестве источника хемотаксиса факторов.
При создании теста, очень важно для поддержания полной гидратации геля, который перекрывает цели и счетчик электродов в каждой камере, а также сократить скважин, которые имеют правильную пространственную связь с целевой электрода. Кроме того, в нижней части клетки также должны быть смежными с тонким слоем жидкости, которая образуется под слоем агарозы, она в этом фильме, что клетки будут двигаться в ответ на вышележащие градиента. Для этого нужно вдохнуть все вилки агарозном геле, не выходя за фрагменты. Удаление разрез вилки агарозы в канюля может создать туннель между двумя ямами, которая имеет эффект градиента деформации и позволяет клеткам свободно передвигаться по всей целевой электрода. Очень важно, чтобы вакуума используется для asp,сердитый гель вилка низкой, чтобы избежать нарушения целостности агарозном хорошо.
Мы обнаружили, что изменения в процентах, используемых в агарозном геле могут дифференцироваться клеткам, которые выражают цитоскелета дефектов от дикого типа клеток, предполагая, что эта манипуляция может быть использован для допроса силам, что клетки могут оказывать на окружающую среду. Если гель обезвоживает в культуре, изменения произойдут, которые влияют на результаты эксперимента, в том числе относительно увеличения жесткости гель, который может привести к замедлению движения клеток и увеличением концентрации растворенного вещества, которые уменьшают общее сопротивление системы.
Анализ совместимы с измерением движение лейкоцитов и другие типы клеток, которые не позволяют тока через тело клетки. Это не является универсальной характеристикой клеток: нервных клеток и некоторых эпителиальных клетках (например) может передавать ток через тело клетки и, таким образом, производят гораздо меньшее сопротивление ценныех годов в отдельной ячейке.
Хотя эти подходы, которые специально определены для выявления клеточных реакций на хемотаксис градиенты, то легко представить, как анализ так же применимы к исследований, связанных с метастазами и внеклеточные сигналы, которые повышают метастатическим движение клетки. Кроме того, существуют дополнительные конфигурации массива, который может быть использован в других клетки с субстратом исследования взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Дэвид Knecht и Майкл Лайнс иметь выданный патент на ECIS / Такси технологии, которые, как были лицензированы в университете Коннектикута в прикладной биофизики, Inc
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национальных Институтов Здоровья (ES07408 и EB00208).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
