Summary
Den ECIS / Taxi-systemet är en automatiserad, real-time-analys som mäter cellulära kemotaxi. I denna analys celler röra sig under ett skikt av agaros att komma fram till en mål-elektrod. Cellulär rörelse mäts genom insättande av resistens mot växelströmmen 0.
Abstract
Cellulär rörelse som svar på externa stimuli är grundläggande för många cellulära processer, inklusive sårläkning, inflammation och svaret på infektion. En vanlig metod för att mäta kemotaxi är Boydenkammare-analys i vilket celler och kemoattraherande är åtskilda av ett poröst membran. Som celler vandrar genom membranet mot kemoattraherande, följa de till undersidan av membranet, eller falla in i de underliggande media och därefter färgas och visuellt räknas 1. I denna metod exponeras celler för en brant och övergående kemoattraherande gradient, som tros vara en dålig bild av gradienter som finns i vävnader 2.
En annan analyssystem, under-agaros kemotaxianalys, 3, 4 åtgärder cellrörelse över ett fast substrat i en tunn vattenhaltig film som bildas under agaros skiktet. Den gradient som utvecklas i agaros är grund och tros vara en apphållbarhet enligt representation av naturligt förekommande gradienter. Kemotaxi kan utvärderas genom mikroskopisk avbildning av den tillryggalagda sträckan. Både Boydenkammare-analysen och den under-agaros-analys vanligen utformade som slutpunkter analyser.
Den automatiserade ECIS / Taxi-systemet kombinerar under-agaros strategi med Electric Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS) 5, 6. I denna analys är mål-elektroder placerade i var och en av 8 kammare. En stor motelektroden löper genom var och en av de 8 kamrarna (figur 2). Varje kammare är fylld med agaros och två små brunnarna är sänkningen av agaros på vardera sidan av målet elektroden. En brunn fylls med testet cellpopulationen, medan den andra håller källor sprida kemoattraherande (Figur 3). Ström som passerar genom systemet kan användas för att bestämma förändringen i motstånd som uppträder när cellerna passerar över det valda elektroden. Celler på målet electrode öka motståndet hos systemet 6. Dessutom snabba variationer i motståndet representerar förändringar i interaktionerna mellan cellerna med elektrodytan och indikerar pågående cellulära formförändringar. Den ECIS / Taxibilar systemet kan mäta rörelse hos cellpopulationen i realtid över utsträckta tidsperioder, men är också tillräckligt känsliga för att detektera ankomsten av en enda cell på målet elektroden.
Dictyostelium discoidium är känt att migrera i närvaro av en folat-gradient 7, 8 och dess kemotaktiska svaret kan mätas noggrant som ECIS / Taxibilar 9. Leukocytkemotaxi, har som svar på SDF1α och kemotaxi antagonister också mätts med ECIS / Taxibilar 10, 11. Ett exempel på leukocyt svar på SDF1α visas i figur 1.
Protocol
1. ECIS / Taxibilar Elektrod Framställning
- Guldytan av ECIS / taxibilar elektroduppsättningen (bestående av 8 kamrarna per objektglas) först stabiliseras genom förbehandling med steril 10 mM cystein i avjoniserat vatten (dHaO 2 O) i 15 min vid rumstemperatur under sterila betingelser.
- Aspirera cystein-lösningen från varje elektrod kammare, skölj 3 gånger med sterilt dH 2 O och ersätt med 250 pl komplett medium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mM HEPES-buffert).
- Anslut elektroduppsättningen att kontakta stiften på instrumentet array innehavaren att utföra elektrod kontroll.
- Chambers som är rätt anslutna kommer att markeras i grönt på skärmen. Om kamrarna är markerade i rött, är de inte anslutna och elektroden bör åter placeras i arrayen innehavaren att knyta kontakter för alla kammare.
- När alla kamrarna är anslutna, klicka på "Check"-knappen i mjukvaran regulatorn för att avskräckabryta den initiala resistansen och kapacitansen värden för varje kammare. Resistansvärden bör vara mellan 1600 och 2000 ohm, och kapacitans värden skall vara mellan 5 och 6 högfrekvenskondensator för en 8 kammare array. Om en kammare inte är inom dessa acceptabla parametrar, bör den enskilde kammaren inte användas för att samla data.
- Koppla elektroden från Array försäljning tid att utarbeta de enskilda agaros kamrarna. Aspirera medium från kamrarna och tvätta varje kammare 3 gånger med sterilt dH 2 O.
2. Förbereda Agaros Chambers
- I en steril 15 ml polypropen koniskt rör, mått 0,03 g Seakem GTG agaros och tillsätt 1 ml steril PBS. Ersätta rörets lock löst, och smältning av agarosen i autoklav under en 2 min flytande cykel (smältning i en mikrovågsugn är inte effektiv för denna analys). Denna korta tid smälter inte den koniska rör. För mindre kräsna celler som inte kräver serum för kultur (t.ex. Dictyostelium discoideum) 0,5%agaros kan göras i det lämpliga mediet och smältes i en mikrovågsugn. Autoklaven är nödvändigt för celler som kräver serum, eftersom detta kommer att denatureras vid smältes i mikrovågsugn.
- Tillsätt 5 ml komplett RPMI-medium värmdes i ett vattenbad (55 ° -60 ° C) direkt till den heta agaros, till en slutlig koncentration av 0,5% agaros och pipett upp och ned försiktigt för att blanda.
- Pipettera 300 pl av smält agaros medium i varje kammare, ersätta de ECIS / taxi array locket och låt gel vid rumstemperatur.
- Pipettera återstående agaros i locket 15 ml tub för att bedöma agaros gelning. Detta överskott agaros kommer också att användas i del 4: Cutting brunnar i agaros.
3. Konstruera och slipning kanylen Well Cutting Tool
- Slipa två 14 gauge trubbig ände kanyler, med användning av en 5/64 "-bit. Rotera spetsen hos borrkronan i varje kanyl öppning med en låg hastighet borr, att göra vissa av borrskäret skär hela inre kanten av varje kanyl opningsverktygets att bilda en vass skäregg (figur 4A).
- Borras två hål genom 1 "x 2" x ¼ "plexiglas (figur 4B-D) med en 5/64"-bit i en pelarborrmaskin. In varje skärpt 14 gauge kanyl, så det sticker ut ett lika långt genom varje plexiglas hål.
4. Kapning Wells i Agarose
- Sterilisera 14 gauge kanylen genom att lätt flammande tipsen. Före skärning brunnar i ECIS kammaren, låt kanylerna svalna till rumstemperatur, eller kyla kanyler genom att trycka på agaros i locket till 15 ml röret. Om temperaturen i kanylen är för hög, kommer agaros smälter som kammaren brunnarna skärs, vilket gör brunnarna missformade och defekt.
- Rikta kanylen paret ovanför de två guld prickar som omger målet elektroden i varje kammare (figur 2c och 5). Sätt kanylen vertikalt, utan någon horisontell förflyttning, stannar vid ett lätt kontakt mellan kanylen ochelektrodytan. Ta försiktigt bort kanylen, återigen utan någon horisontell rörelse. Placering av ytterligare brunnar för motsätta gradienter är också möjligt med en omkonfigurering av kanylen jiggen.
- Försiktigt aspirera agaros pluggen lämnas av kanylen med användning av en steril 9 "pasteurpipett, ansluten till lågt vakuumtryck, med en vakuum-fälla fånga agaros avfall.
- Tillsätt 300 pl komplett RPMI-medium på ytan av varje kammare vid 37 ° C, under 2 minuter för att mätta agaros, och sedan försiktigt suga ut mediet från ytan och brunnarna utan att störa agaros.
5. Fylla på Wells
- Varje brunn är i stånd att hålla en volym av 7 | il. En brunn i varje kammare, tillsätt 7 il cellsuspension. För Jurkat T-celler, använda 2 x 10 7 celler / ml. Dessa celler kommer att svara på 7 | il av 200 ng / ml SDF-1α utspätt i RPMI ofullständig, som saknar serum. Använd komplett media enbart som en negativ fortsROL.
- Efter brunnarna fylls, visa varje kammare av matrisen med ett inverterat mikroskop för att se till att alla brunnar skars och fylldes på rätt sätt. Celler bör vara i inom gränserna för brunnens gräns. Om de ses i både brunnar, eller sprider sig utanför cellen väl gränsen, då ett gap har bildats under agarosen. Observera felaktigt inrättas brunnar, eftersom data inte tillförlitligt kan tolkas från dessa kammare.
6. Datainsamling
- Placera elektroden i matrisen hållaren och åter ansluta guld plattorna på elektroduppsättningen till fjäderbelastade pogo stiften i hållaren och klicka på "setup". De brunnar som är ordentligt anslutna kommer att markeras med grönt. Om brunnarna är röd, är de ej i och elektroden bör omplaceras i matrisen hållaren.
- Välj "8WE1" (8 och 1 elektrod) från rullgardinsmenyn i programvaran panelen för att indikera arrayen konfigurationen.
- Välj "kontrollera" i mjukvaran kontrol panelen för att bestämma den initiala resistansen och kapacitansen värden för varje brunn. De resistansvärden bör vara mellan 1600 och 2000 ohm, medan kapacitans värdena bör vara mellan 5 och 6 högfrekvenskondensator.
- Välja flera frekvenser för att mäta resistansen vid flera frekvenser. Det finns ett val att anpassa frekvenser, eller använda en uppsättning av rekommenderade frekvenser. Standard flera frekvenser förvärv inställningarna fånga data vid 11 förutbestämda frekvenser (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 och 64.000 Hz) vid en hastighet av 8 brunnar / min. Tidsintervallet mellan mätningarna kan också anpassas. Uppsamling flera frekvensdata möjliggör analys av kapacitans, impedans och motstånd. Samla resistansvärden vid 4.000 Hz är oftast tillräckligt för däggdjursceller studier cellkemotaxi, men de extra frekvenserna kan ge information i andra sammanhang 12,13.
- Total experiment varaktighet kan ställas in, på högerpanel, eller experimentet kan stoppas manuellt genom att klicka på "Finish" när cellerna har producerat motstånd som indikerar ankomst till elektroden. Den tid det tar för cellerna att nå fram till elektroden beror på den använda celltypen.
- Klicka på "Start" för att inleda insamling av data.
7. Data Management
- Även om data kan exporteras till Excel är ECIS 1600R programvaran som medföljer ECISθ systemet den mest effektiva metoden för att analysera ECIS / Taxi data.
- Mjukvaran dataanalys verktygsbalken innehåller alternativknapparna Z, R, och C. Dessa bestämmer huruvida impedansen, resistans, kapacitans eller, respektive, är avsatt på den vertikala axeln mot x-axeln (förfluten tid).
- ECIS / Taxi data mest effektivt visas som motstånd över tiden vid 4.000 Hz. Snabba fluktuationer i motståndet eller microtransients (Figur 1), är bevis på cellulär rörelse över elektroden. Kompilera, or binning datapunkterna så att inte alla punkter plottas, rekommenderas inte för ECIS / Taxi, eftersom det kommer den genomsnittliga microtransients av data.
- När diagrammet har gjorts med ECIS1600R programvara, kan den exporteras genom att välja "export grafen" från Arkiv-menyn och sparas som en. Tif eller. Jpg-fil.
8. Representativa resultat
Cellulär kemotaxi indikeras av en ökning i resistans vid 4000 Hz. Ankomsten av celler på målet elektroden indikeras också av uppkomsten av snabba svängningar i motståndet kallas microtransients eller mikrorörelse som beskrivs i Opp et. al., 2009 (figur 1) 14. Ett negativt resultat anges i fast eller en liten minskning i motståndet vid 4000 Hz, som visas i rött i figur 1. Frånvaro av microtransients är också ett tecken på en avsaknad av cellrörelse till elektroden. Ökningen i motstånd är direkt proproportionell till antalet celler som korsar elektroden 10. Tillsats av monoklonal antikropp specifik för en kemoattraktant eller toxiner kända för att interferera med G-receptorer proteinkopplade kan blockera kemotaxi 11.
Figur 1. Kemotaxi av humana Jurkat-T-celler som svar på SDF1α. Humana Jurkat-T-celler (2.0x10 6 celler / ml) utsattes för en gradient av SDF-1α (startkoncentration 100 ng / ml) eller RPMI 1640 som en negativ kontroll. Den normaliserade motstånd vid 4000 Hz var grafiskt. Humana Jurkat-T-celler förflyttas som svar på SDF-1α, vilket framgår av den ökning av motståndet och microtransients, medan ingen rörelse sågs med exponering för RPMI 1640.
Figur 2. Vy uppifrån av ett ECIS / Taxis Elektrod without-agaros. Varje ECIS / Taxibilar elektrod består av 8 individuella kammare. Varje kammare delar en stor elektrod (a), och innehåller en enskild elektrod mål (b). Varje kammare har också 2 guld cirklar (c), som används som en guide när du skär brunnarna i agarosen med kanyler. Guld kvadrater (d) är kontaktplattorna som ansluter till de pogo stiften för att tillämpa den AC-ström till elektroden. De individuella mål-elektroder är vardera i krets med större motelektrod (e).
Figur 3. Två brunnar skärs i varje agaros-fylld kammare. När den kemoattraherande tillsätts till en brunn den diffunderar att skapa en gradient i agaros, med den högsta koncentrationen av chemoattract närmast den kemoattraherande brunn. Cellerna färdas under agaros i riktning mot högre koncentrationer av kemoattraherande och kan passera över det valda elektroden. Somcellerna passera målet elektroden, är en ökning av motståndet som registreras av ECIS 1600R mjukvara.
Figur 4. Införande av två 14 gauge kanyler i plexiglas. A) En 5/64 "borr används för att slipa kanylen spetsen. B) Två hål måste borras i plexiglas för att rymma 14 gauge kanylen enligt layouten bilden. C) Använd en pelarborrmaskin för att säkerställa att hålen är vinkelräta till pleixglass ytan. D) Två slipade Kanyler förs in genom ¼ "plexiglas, 2 mm från varandra (mätt från inre kanter). Dessa slipas kanyler är noga in i agaros att skära brunnarna.
Figur 5. Justera kanyler med guld prickar i ECIS / Taxis kammaren. Vill klippa brunnar måste slipas kanylerligga i linje med guld prickar flankerar målet elektroden på botten av ECIS / Taxis kammare. Kanylerna skall införas vertikalt, utan någon horisontell rörelse, och avlägsnas på samma sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nya egenskaper ECIS / Taxis analysen innefattar dess förmåga att automatisera insamling av realtidsdata som celler svarar på chemoattractant. Medan den mest vanliga tillämpningen av denna teknik är att mäta cellulära svar på enskilda kemotaktiska gradienter, eller gradienter består av blandningar av kemotaxi agonister och antagonister är ECIS / Taxis strategi också mottaglig för variationer av dessa konfigurationer som kan vara till stor hjälp i Bedömningen av cellulär respons. Det finns goda bevis för att överlappande eller sekventiella gradienter kan påverka cellulära beteenden på nya sätt. Dessutom är det troligt att dessa mera komplexa gradienter är normen in situ 12, 13.
Den ECIS / Taxi analys kan möjliggöra modellering av dessa olika gradientkonfigurationer på ett sätt som inte är möjliga med andra tekniker. T ex genom tillsats av ytterligare brunnar, kan en fördela orientering gradient (er) i förhållande till cellen väl och målet elektrod. Det är också möjligt att konfigurera analysen för att placera cellerna i en av de brunnar som källan av kemotaktiska faktorer.
När man införde analysen, är det viktigt att upprätthålla fullständig hydratisering av gelén som läggs över målet och motelektroderna i varje kammare, och att skära brunnar som har den korrekta rumsliga förhållandet till mål-elektroden. Dessutom behöver botten av cellen väl vara sammanhängande med den tunna filmen av vätska som bildar under agaros skiktet, det är i denna film att cellerna kommer att röra sig som svar på den överliggande gradienten. För att göra detta måste man aspirera alla agarosplugg utan att lämna gelfragment bakom. Avlägsnandet av agaros pluggen skurna genom kanylen kan skapa en tunnel mellan de två brunnar, som har effekten att deformera gradient och tillåter cellerna att röra sig fritt över målet elektroden. Det är viktigt att undertrycket som används för att aspilsken gelen kontakten är låg för att undvika att äventyra agarosen väl integritet.
Vi har funnit att variationer i den procentuella andelen av agaros som används i gelén kan differentiera celler som uttrycker cytoskelettala defekter från vildtyp-celler, vilket antyder att denna manipulation kan användas för att avfråga de krafter som cellerna kan utöva sin omgivning. Om gelen torkar under kultur, kommer förändringar som påverkar de experimentella resultaten, inklusive en relativ ökning i gel styvhet som skulle bromsa cellens rörelse och en ökning av löst koncentration som skulle minska systemets totala impedans.
Analysen är kompatibel med mätning av rörelse av leukocyter och andra celltyper som inte tillåter att ström flyter genom cellkroppen. Detta är inte en universell egenskap hos cellerna: nervceller och vissa epitelceller (t ex) kan överföra ström genom cellen kroppen och skulle således producera mycket lägre resistans värdefullaES per enskild cell.
Medan dessa metoder är specifikt definierade för att detektera cellulära svar kemotaktiska gradienter, är det lätt att föreställa sig den analys som likaledes är tillämplig på studier med metastaser och de extracellulära signaler som förhöjer metastatisk cellrörelse. Dessutom finns det ytterligare array konfigurationer som kan användas i andra cell-substrat interaktionsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
David A Knecht och Michael A Lynes har ett beviljat patent för ECIS / Taxis teknik, vilket som fått tillstånd av universitetet i Connecticut för att Applied biofysik, Inc.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (ES07408 och EB00208).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
